檢測常見致病真菌的熒光定量pcr引物、探針及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測常見致病真菌的熒光定量PCR引物、探針及試劑盒，本發(fā)明獨(dú)立設(shè)計(jì)特異性的引物與TaqMan探針，建立一種熒光PCR檢測方法能夠同時(shí)檢測15種臨床常見致病真菌，其中包括8種假絲酵母菌(白色念珠菌、光滑假絲酵母、近平滑假絲酵母、乳酒假絲酵母、清酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、季也蒙假絲酵母、熱帶假絲酵母)，4種曲霉菌(黑曲霉、黃曲霉、土曲霉、煙曲霉)以及隱球菌、米根霉和卷枝毛霉，該方法具有較高的靈敏度和特異性，對于侵襲性真菌感染的早期診斷和治療具有重大意義。
【專利說明】檢測常見致病真菌的熒光定量PCR引物、探針及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒，特別是涉及使用實(shí)時(shí) 熒光定量PCR技術(shù)快速鑒定臨床樣本常見致病真菌的試劑盒及檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著抗生素、免疫抑制劑及皮質(zhì)類固醇激素在臨床上廣泛應(yīng)用，器官移 植、導(dǎo)管插管等普遍開展，深部真菌感染率越來越高。深部真菌感染是一種重癥感染，死亡 率為40-90%，真菌病的發(fā)病率近年來呈上升趨勢，尤其對重癥監(jiān)護(hù)病房和免疫缺陷患者、 以及癌癥患者，8 %的院內(nèi)感染由真菌引起。
[0003] 據(jù)統(tǒng)計(jì)，近30年深部真菌感染的發(fā)病增加了 3-5倍，真菌感染已成為艾滋病的重 要死亡原因之一。引起深部真菌感染的病原菌主要有念珠菌、曲霉菌和隱球菌等。其中念 珠菌屬感染最多，其次為曲霉菌感染，且侵襲性曲霉菌感染率正逐年升高，病死率較高，而 各種抗真菌藥物的濫用，更加劇了真菌感染的復(fù)發(fā)和增加了治療難度，其感染患者的存活 主要依賴于早期診斷和早期治療。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法耗時(shí)太長，耽誤時(shí)間的同時(shí)恐錯(cuò) 過最佳治療時(shí)機(jī)，同時(shí)敏感性較低，因此從技術(shù)上解決這一問題頗為重要。
[0004] 目前，臨床上常用的深部真菌診斷方法有：傳統(tǒng)培養(yǎng)法、影像學(xué)檢查法、血清學(xué)檢 查。以上方法均存在一定的缺陷：傳統(tǒng)培養(yǎng)法是診斷真菌感染的最直接方法，準(zhǔn)確度高，但 其耗時(shí)長、易污染、敏感性低的缺點(diǎn)使其不利于臨床患者診斷；影像學(xué)檢查通過高分辨率的 機(jī)器對患者病灶部位直接進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，具有重要的提示價(jià)值，但此方法不僅特異度低且 僅對高危病人具有早期診斷價(jià)值；血清學(xué)方法具有一定的敏感度和特異性，但診斷的假陽 性率較高。
[0005] 目前相對最為先進(jìn)、也最有發(fā)展前景的是分子生物學(xué)方法，即PCR，聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)方法。傳統(tǒng)的PCR技術(shù)雖具有較高的靈敏度，但特異度低，因外源污染等問題容易造成假 陽性結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)能夠在極短的時(shí)間內(nèi)檢測出組織中極微量的真菌DNA，具 有較高的靈敏度和特異性。
[0006] 臨床常見的侵襲性真菌主要有念珠菌、曲霉菌和隱球菌等，目前尚未發(fā)現(xiàn)使用探 針法熒光PCR可以檢測不同真菌菌屬的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種檢測常見致病真菌的熒光 定量PCR引物、探針及試劑盒，本發(fā)明獨(dú)立設(shè)計(jì)特異性的引物與TaqMan探針，建立一種熒光 PCR檢測方法能夠同時(shí)檢測15種臨床常見致病真菌，其中包括8種假絲酵母菌（白色念珠 菌、光滑假絲酵母、近平滑假絲酵母、乳酒假絲酵母、清酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、季也 蒙假絲酵母、熱帶假絲酵母），4種曲霉菌（黑曲霉、黃曲霉、土曲霉、煙曲霉）以及隱球菌、 米根霉和卷枝毛霉，該方法具有較高的靈敏度和特異性，對于侵襲性真菌感染的早期診斷 和治療具有重大意義。
[0008] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：
[0009] -種檢測常見致病真菌的熒光定量PCR引物，引物序列如下：
[0010] 引物 Fl 序列：5' -ACTTTYAACAAYGGATCTCTTGGYTC-3'
[0011] 引物 F2 序列：5' -TGACRCTSRRACAGGCATG-3'
[0012] 引物 F3 序列：5' -TGATACTGAARCAGGCGTRCTC-3'。
[0013] 而且，所述常見致病真菌包括8種假絲酵母菌：白色念珠菌、光滑假絲酵母、近平 滑假絲酵母、乳酒假絲酵母、清酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、季也蒙假絲酵母和熱帶假絲 酵母，4種曲霉菌：黑曲霉、黃曲霉、土曲霉和煙曲霉，以及隱球菌、米根霉和卷枝毛霉。
[0014] 一種檢測常見致病真菌的熒光定量PCR探針，序列如下：
[0015] 熒光探針 Fl 序列：5' -FAM-CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC-TAMRA-3'
[0016] 熒光探針 F2 序列：5' -FAM-CATCGATGAAGAACGYAGCRAARTGC-TAMRA-3'。
[0017] 一種檢測常見致病真菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：包括上述的引物和 探針。
[0018] 而且，還包括內(nèi)參照質(zhì)控，其引物和特異性檢測探針序列如下：
[0019] 引物 Nl 序列：5' -CAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAA-3'
[0020] 引物 N2 序列：5' -TCTTGCGACGTTATGCGGTAT-3'
[0021] 熒光探針 N 序列：5' -VIC-CTTGCTTCITTGCTGACGAG-TAMRA-3'。
[0022] 而且，所述常見致病真菌包括8種假絲酵母菌：白色念珠菌、光滑假絲酵母、近平 滑假絲酵母、乳酒假絲酵母、清酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、季也蒙假絲酵母和熱帶假絲 酵母，4種曲霉菌：黑曲霉、黃曲霉、土曲霉和煙曲霉，以及隱球菌、米根霉和卷枝毛霉。
[0023] 本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是：
[0024] 1、本發(fā)明目的在于開發(fā)一種快速、靈敏、特異的真菌熒光PCR檢測試劑盒，該試劑 盒使用一個(gè)PCR反應(yīng)體系即可檢測到15種常見致病真菌（包括白色念珠菌、光滑假絲酵 母、近平滑假絲酵母、乳酒假絲酵母、清酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、季也蒙假絲酵母、熱 帶假絲酵母、黑曲霉、黃曲霉、土曲霉、煙曲霉、隱球菌、米根霉和卷枝毛霉），克服了傳統(tǒng)的 臨床致病真菌檢測的缺點(diǎn)和局限性，解決了熒光PCR檢測臨床樣品中真菌感染的難題。
[0025] 2、本試劑盒由PCR反應(yīng)液管、Taq酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、陽性對照品管、陰性對 照品管、內(nèi)參照和盒體組成，其中，PCR反應(yīng)液含有PCR反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs)、特異性引物和不同熒光標(biāo)記的探針組成；陰性對照為無核酸酶污染的去離子水； 陽性對照為具有目的檢測序列的DNA插入到pMD-T載體而構(gòu)成的重組體，同時(shí)，試劑盒使用 尿嘧啶-DNA-糖基化酶和dUTP，有助于避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。
[0026] 3、本試劑盒同時(shí)加入了內(nèi)參照質(zhì)控，全程監(jiān)控核酸提取和熒光PCR檢測過程，最 大限度的避免了臨床檢測污染（假陽性）的發(fā)生，雙通道檢測結(jié)果準(zhǔn)確度更高更可靠。
[0027] 4、本試劑盒經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證具有較高的靈敏度和特異性，整個(gè)檢測過程僅需2-3個(gè)小 時(shí)，相比傳統(tǒng)檢測方法不僅效率大大提高，而且敏感度及特異性都有了極大的改進(jìn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1顯示熒光定量PCR檢測的特異性結(jié)果圖；
[0029] 圖2為特異性實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參檢測通道檢測結(jié)果（縱坐標(biāo)是檢測樣品的熒光信號值， 橫坐標(biāo)是循環(huán)數(shù)）；
[0030] 圖3為本試劑盒真菌標(biāo)準(zhǔn)品熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0031] 圖4為熒光定量PCR檢測的靈敏度結(jié)果圖；
[0032] 圖5為靈敏度實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參檢測結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0034] 本發(fā)明的基本原理是利用靶多核苷酸的特異性引物和靶多聚核苷酸的特異性探 針，在耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、高質(zhì)量脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs)以及Mg2+等PCR反 應(yīng)緩沖液中，從而達(dá)到快速、實(shí)時(shí)檢測靶多核苷酸的目的。
[0035] 本試劑盒由PCR反應(yīng)液管、Taq酶、尿嘧啶DNA糖基化酶、陽性對照品管、陰性對照 品管、內(nèi)參照和盒體組成。
[0036] PCR反應(yīng)液含有PCR反應(yīng)緩沖液、氯化鎂、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs)0. 1禮、特 異性引物和不同熒光標(biāo)記的探針組成，其中引物Fl濃度為720nM，引物F2, F3, NI, N2濃度 為400nM，熒光探針Fl，F(xiàn)2采用FAM標(biāo)記，濃度為120nM，熒光探針N采用Vic標(biāo)記，濃度為 IOOnM ;陰性對照為無核酸酶污染的去離子水；陽性對照為具有目的檢測序列的DNA插入到 pMD-T載體而構(gòu)成的陽性質(zhì)粒樣品；內(nèi)參照為大腸桿菌菌體凍干粉。
[0037] 陽性對照中目的檢測序列為：
[0038] CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCT TTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCA
[0039] 構(gòu)成本試劑盒的核心即檢測常用致病真菌的引物和特異性熒光探針，序列分別如 下：
[0040] 引物 Fl 序列：5' -ACITTYAACAAYGGATCTCTTGGYTC-3'
[0041] 引物 F2 序列：5' -TGACRCTSRRACAGGCATG-3'
[0042] 引物 F3 序列：5' -TGATACTGAARCAGGCGTRCTC-3'
[0043] 熒光探針 Fl 序列：5' -FAM-CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC-TAMRA-3'
[0044] 熒光探針 F2 序列：5' -FAM-CATCGATGAAGAACGYAGCRAARTGC-TAMRA-3'
[0045] 另外，本試劑盒根據(jù)大腸桿菌基因組16S區(qū)序列設(shè)計(jì)內(nèi)參照質(zhì)控，其引物和特異 性檢測探針序列如下：
[0046] 引物 Nl 序列：5' -CAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAA-3'
[0047] 引物 N2 序列：5' -TCTTGCGACGTTATGCGGTAT-3'
[0048] 熒光探針 N 序列：5' -VIC-CTTGCTTCITTGCTGACGAG-TAMRA-3'
[0049] 本發(fā)明所述試劑盒的使用體系為：
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測常見致病真菌的熒光定量PCR引物，其特征在于：引物序列如下：引物FI 序列：5' -ACTTTYAACAAYGGATCTCTTGGYTC-3' 引物 F2 序列：5'-TGACRCTSRRACAGGCATG-3' 引物 F3 序列：5'-TGATACTGAARCAGGCGTRCTC-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測常見致病真菌的熒光定量PCR引物，其特征在于：所述 常見致病真菌包括8種假絲酵母菌：白色念珠菌、光滑假絲酵母、近平滑假絲酵母、乳酒假 絲酵母、清酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、季也蒙假絲酵母和熱帶假絲酵母，4種曲霉菌：黑 曲霉、黃曲霉、土曲霉和煙曲霉，以及隱球菌、米根霉和卷枝毛霉。
3. -種檢測常見致病真菌的熒光定量PCR探針，其特征在于：序列如下： 熒光探針 F1 序列：5'-FAM-CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC-TAMRA-3' 熒光探針 F2 序列：5'-FAM-CATCGATGAAGAACGYAGCRAARTGC-TAMRA-3'。
4. 一種檢測常見致病真菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：包括權(quán)利要求1所述 的引物，包括權(quán)利要求2所述的探針。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測常見致病真菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：還 包括內(nèi)參照質(zhì)控，其引物和特異性檢測探針序列如下： 引物 N1 序列：5'-CAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAA-3' 引物 N2 序列：5'-TCTTGCGACGTTATGCGGTAT-3' 熒光探針 N 序列：5' -VIC-CTTGCTTCTTTGCTGACGAG-TAMRA-3'。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測常見致病真菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于：所 述常見致病真菌包括8種假絲酵母菌：白色念珠菌、光滑假絲酵母、近平滑假絲酵母、乳酒 假絲酵母、清酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、季也蒙假絲酵母和熱帶假絲酵母，4種曲霉菌： 黑曲霉、黃曲霉、土曲霉和煙曲霉，以及隱球菌、米根霉和卷枝毛霉。
【文檔編號】C12N15/11GK104450936SQ201410820825
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月25日
【發(fā)明者】姜坤妤, 杜勇, 張薇, 孫明娣, 史斐斐, 張文媛, 賈后壯, 郭江燕, 鄭媛媛 申請人:天津?qū)毴鹕锛夹g(shù)有限公司