副溶血性弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種副溶血性弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和試劑盒。該檢測引物組為：上游外引物為F3：5’-GCAAAGAAACGCTTGGCG-3’；下游外引物B3：5’-TGCATAGCAATGTTGTCGCT-3’；上游內引物FIP：5’-TCTCTCGGGTGGTGGATGGGTTTCGTTACACTCCGTTCGC-3’；下游內引物BIP：5’-ATGGTTTGCTACTCTCGCACCCTCGGCTGACAAATGGCTCTA-3’。本發(fā)明的檢測方法具有靈敏度高、特異性強、準確率好、檢測時間短的優(yōu)點，從樣品處理到報告結果只需花12h，不需要PCR儀和電泳儀，操作過程簡單，比其他PCR技術具有更高的特異性，適合基層檢測機構和食品企業(yè)檢測使用。
【專利說明】副溶血性弧菌的環(huán)介導等溫擴増檢測引物組、檢測方法和 試劑盒

【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體設及一種副溶血性弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測引 物組、檢測方法和試劑盒。

【背景技術】：
[0002] 副溶血性弧菌（Vibrio par址aemolyticus)在世界范圍內被公認是一種重要的食 源性致病菌，亦是近年來我國微生物性食物中毒的頭號致病菌。副溶血性弧菌食物中毒可 引起急性胃腸炎，少數情況還能引發(fā)敗血病，危及生命。水產品中較高的副溶血性弧菌污染 率導致了由該菌引起的食物中毒案例在世界各地時有發(fā)生。僅2006年夏天，智利某地就報 導了 900多例VP相關的腹瀉病例；2007年8月25日?9月25日，我國廈口市連續(xù)發(fā)生兩 起VP食物中毒，中毒2000余人。
[0003] 目前，美國和歐盟對進口水產品都強制性要求進行副溶血性弧菌的檢測，檢驗結 果為陰性方可通關，否則出口的水產品將被"全部自動扣留"就地銷毀。該給我國水產品的 出口設置了技術壁壘。國際微生物標準委員會和日本、英國、加拿大等國及我國香港地區(qū)都 提出對水產品開展副溶血性弧菌的檢測工作。我國也要求將副溶血性弧菌的檢測作為水產 品質量的檢測標準（GB 4789. 7-2013，SNT 2142-2008，SN0173-1992，GB18406. 4-2001)。目 前，我國對副溶血性弧菌的檢測主要是根據GB 4789. 7-2013,該需要5?7d時間，難W適應 快速準確的要求。隨著現(xiàn)代科學技術的不斷發(fā)展，特別是免疫學、生物化學、分子生物學的 不斷發(fā)展，人們已創(chuàng)建了不少快速、簡便、特異、敏感且適用的副溶血性弧菌檢測方法。
[0004] 盡管已有針對副溶血性弧菌t化基因和一些其他序列建立LAMP方法的專利報道 (專利申請?zhí)枺?007100304416)，但由于t化等基因不夠特異（Croci et al.，2007)，W此建 立的LAMP方法在實際應用中具有一定的局限性。


【發(fā)明內容】
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[0005] 本發(fā)明的第一目的是提供一種快速、特異好、靈敏高的應用環(huán)介導等溫擴增檢測 副溶血性弧菌（Vibrio par址aemolyticus)的檢測引物組，利用該檢測引物組可W特異性 的檢測副溶血性弧菌。
[0006] 本發(fā)明在選擇新的特異祀基因ir濁的基礎上燈U et al.，2010)，通過篩選和優(yōu)化 引物，建立了一種LAMP擴增方法，通過摸索樣品前處理條件（增菌），將樣品處理技術結合 LAMP技術有機結合，建立用于水產品中副溶血性弧菌的快速檢測方法。該方法的應用對于 水產品快速檢測和保障水產品質量安全具有重要意義，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0007] 本發(fā)明的應用環(huán)介導等溫擴增檢測副溶血性弧菌（Vibrio par址aemolyticus)的 檢測引物組，其特征在于，由下列引物組成：
[0008] 上游外引物為 F3 ;5' -GCAAAGAAACGCTTGGCG-3'（如 SEQ ID NO. 1 所示）；
[0009] 下游外引物 B3 ;5' -TGCATAGCAATGTTGTCGCT-3'（如 SEQ ID NO. 2 所示）；
[0010]上游內引物 FIP ;5' -TCTCTCGGGTGGTGGATGGGTTTCGTTACACTCCGTTCGC-3'（如沈Q ID NO. 3 所示）；
[001U 下游內引物 BIP ;5'-ATGGTTTGCTACTCTCGCACCCTCGGCTGACAAATGGCTCTA-3'（如 SEQ ID NO. 4 所示）。
[0012] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的副溶血性弧菌的檢 測方法，其特征在于，對樣品進行增菌培養(yǎng)獲得增菌液，提取增菌液中的細菌DNA，然后通過 環(huán)介導等溫擴增的方法用上述檢測引物組對細菌DNA進行選擇性擴增，確認是否存在有擴 增產物。
[0013] 所述的樣品可W是各種可能含有副溶血性弧菌的樣品，如水產品。
[0014] 所述的對樣品進行增菌培養(yǎng)優(yōu)選是將樣品接入質量分數3%化cl堿性蛋白腺水， 36°C ±rc培養(yǎng)lOh，獲得增菌液。
[0015] 所述的通過環(huán)介導等溫擴增的方法用上述檢測引物組對細菌DNA進行選擇性擴 增具體為；環(huán)介導等溫擴增體系為體系總體積25 包括2. 5 yL 10X化ermopol反應緩 沖液、0. 4 y L10mmol/LdNTPs、0. 5 y L 10 y mol/L 上游外引物 F3、0. 5 y L 10 y mol/L 下游外 引物B3、l yL40ymol/L上游內引物FIP、1 uL 40ymol/L下游內引物BIP、0. euLlOOmmol/ L M拆04、12. 5yL2mol/L甜菜堿、2yL滅菌雙蒸水d地2〇，l uL Bst DNA聚合酶巧U/yL)和 3 y L細菌DNA模板，反應條件為在溫度為60?65°C解育45?60min。
[0016] 所述的確認是否存在有擴增產物可W利用電泳檢測、巧光顯色檢測或濁度檢測環(huán) 介導等溫擴增反應產物是否具有擴增產物，優(yōu)選用巧光顯色檢測，具體是在80°C終止反應 1?2min，在擴增反應管中加入SYBR Green I顯色劑，1?5min后觀察結果，如果顏色為 澄色，則樣品副溶血性弧菌陰性，無副溶血性弧菌，如果顏色為綠色，則樣品副溶血性弧菌 陽性，含有副溶血性弧菌。
[0017] 所述的10X化ermopol反應緩沖液是現(xiàn)有技術中的物質，可W從試劑公司購 買到，其含有200mmol/L P服.8的S哲基甲基氨基甲燒-鹽酸（Tris-HCl)、100mmol/ 1氯化鐘化0)、10〇111111〇1/1硫酸錠（畑4)25〇4、2〇111111〇1/1硫酸儀曲拆〇4)和1%曲拉通 X-100 (TtitonX-100)，余量為水。
[001引本發(fā)明的第S個目的是提供一種副溶血性弧菌的檢測試劑盒，包括環(huán)介導等溫擴 增試劑和檢測引物組，其特征在于，所述的檢測引物組由下列引物組成：
[0019] 上游外引物為 F3 ;5' -GCAAAGAAACGCTTGGCG-3' ；
[0020] 下游外引物 B3 ;5' -TGCATAGCAATGTTGTCGCT-3,；
[002U 上游內引物 FIP ;5' -TCTCTCGGGTGGTGGATGGGTTTCGTTACACTCCGTTCGC-3,；
[0022] 下游內引物 BIP ;5' -ATGGTTTGCTACTCTCGCACCCTCGGCTGACAAATGGCTCTA-3,。
[0023] 本發(fā)明針對副溶血性弧菌的特異祀基因ir濁設計特異性引物，具有較強的特異 性，適于副溶血性弧菌的檢測。本發(fā)明選擇新的特異性基因ir濁為祀基因，設計和篩選了 一套特異性檢測引物組W及含有該檢測引物組的檢測試劑盒和利用該檢測試劑盒通過環(huán) 介導等溫擴增的檢測方法，進而確定待檢測樣品中是否存在副溶血性弧菌的檢測方法。本 發(fā)明的檢測試劑盒和檢測方法具有靈敏度高、特異性強、準確率好、檢測時間短的優(yōu)點，從 樣品處理到報告結果只需花12h，不需要PCR儀和電泳儀，操作過程簡單，比其他PCR技術 具有更高的特異性，特別適合基層檢測機構和食品企業(yè)檢測水產品中是否含有副溶血性弧 菌，對于水產品快速檢測和保障水產品質量安全具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0024] 圖1是純菌靈敏度實驗中的LAMP擴增產物的電泳結果；1:1. 02 X 105; 2:1.02 X 1〇4;3:1.02 X 1〇3;4:1.02 X 1〇2;5:1.02 X 1〇1;6:1.02 X 10°;7:1.02 X 1〇-1; 8:陰性對照；M:化2000 ;
[0025] 圖2是純菌靈敏度實驗中的LAMP擴增產物的顯示液結果；1:1. 02 X 1〇5; 2:1.02 X 1〇4;3:1.02 X 1〇3;4:1.02 X 1〇2;5:1.02 X 1〇1;6:1.02 X 10°;7:1.02 X 1〇-1; 8:陰性對照；
[0026] 圖 3 是 PCR 純菌靈敏度實驗；1:1.02 X 1〇5;2:1.02 X 1〇4;3:1.02 X 1〇3; 4:1. 02 X 1〇2;5:1. 02 X 10 1;6:1. 02 X 10 °;7:1. 02 X 10-1;8:陰性對照；M:DL2000。

【具體實施方式】：
[0027] W下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[002引實施例1 ;郵類中副溶血性弧菌檢測
[0029] 1、樣品增菌
[0030] 將市場上購買的郵均質，稱取均質樣品25g，放入225血質量分數3%化C1堿性蛋 白腺水，36°C ±rc培養(yǎng)lOh，得到細菌培養(yǎng)物。
[003U 2、細菌DNA的提取
[003引取1血細菌培養(yǎng)物于12000r/min離屯、5min，棄上清，收集菌體，加入50ULTE充分 懸浮混勻，于l00°C水浴lOmin，冰浴3min，12000r/min離屯、5min，取上清備用，即得到細菌 DNA。
[0033] 3、LAMP 擴增
[0034] 環(huán)介導等溫擴增體系為體系總體積25 y L包括2. 5 y L 10X化ermopol反應緩沖 液、0. 4yL10mmol/L dNTPs、0. 5yL 10ymol/L上游外引物 F3、0. 5yL 10ymol/L下游外 引物B3、l yL40ymol/L上游內引物FIP、1 uL 40ymol/L下游內引物BIP、0. euLlOOmmol/ L M拆04、12. 5yL2mol/L甜菜堿、2yL滅菌雙蒸水d地2〇，l uL Bst DNA聚合酶巧U/yL)和 3 y L細菌DNA模板，反應條件為在溫度為60°C解育60min。
[00對 LAMP檢測引物為；
[0036] 上游外引物為 F3 ;5, -GCAAAGAAACGCTTGGCG-3,；
[0037] 下游外引物 B3 ;5' -TGCATAGCAATGTTGTCGCT-3,；
[0038] 上游內引物 FIP ;5, -TCTCTCGGGTGGTGGATGGGTTTCGTTACACTCCGTTCGC-3,；
[0039] 下游內引物 BIP ;5' -ATGGTTTGCTACTCTCGCACCCTCGGCTGACAAATGGCTCTA-3,。
[0040] 80°C終止反應l-2min，取出反應管。
[0041] 4、顯色劑觀察
[0042] 在反應管中加入1 uL 10%的SYBR Green I顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化， 反應管顏色變?yōu)榫G色[陰性對照（創(chuàng)傷弧菌ATCC27562的基因組DNA)澄色，陽性對照（副 溶血性弧菌ATCC33847的基因組DNA)綠色]，說明樣品有副溶血性弧菌污染。該與傳統(tǒng)生 化鑒定方法檢測結果吻合，證明此方法數據可靠。
[00創(chuàng)實施例2 ;黃花魚中副溶血性弧菌檢測
[0044] 將市場上購買的黃花魚均質，稱取均質樣品按照實施例1的方法進行LAMP檢測， 只是LAMP的反應溫度為65°C解育45min，其他與實施例1相同。
[0045] 結果為；反應管顏色變?yōu)槌紊幮詫φ眨▌?chuàng)傷弧菌ATCC27562的基因組DNA)澄 色，陽性對照（陽性菌株副溶血性弧菌ATCC33847的基因組DNA)綠色），說明樣品沒有副溶 血性弧菌污染。該與傳統(tǒng)生化方法檢測結果吻合，證明此方法數據可靠。
[0046] 實施例3 ;LAMP方法的特異性
[0047] 收集副溶血性弧菌及非副溶血性弧菌110株，將菌株在膜蛋白腺肉湯TSB (副溶血 性弧菌在3 %化cl TSB) 37°C培養(yǎng)2化后，分別取1血細菌培養(yǎng)物于1200化/min離屯、5min， 棄上清，收集菌體，加入50yL TE充分懸浮混勻，于100°C水浴lOmin，冰浴3min，12000r/ min離屯、5min，取上清備用，由此分別得到110株的細菌DM。
[0048] LAMP擴增；環(huán)介導等溫擴增（LAMP)反應體系為25化，包括；2. 5 y L lOXIliermopol 反應緩沖液、0. 4 y L 10mmol/LdNTPs、0. 5 y L 10 y mol/L 上游外引物 F3、 0. 5yL lOymol/L下游夕 F 引物B3、lyL 40ymol/L 上游內引物FIP、lyL 40ymol/L下游 內引物 BIP、0. 6 y LlOOmmol/L M拆〇4、12. 5 y L 2mol/L 甜菜堿、2 y L 滅菌雙蒸水 dd&O, 1 y L Bst DNA聚合酶巧U/ y L)和3 y L細菌DNA模板，反應條件為在溫度為65°C解育45min。 80°C終止反應l-2min，取出反應管。
[0049] 上游外引物為 F3 ;5' -GCAAAGAAACGCTTGGCG-3' ；
[00加]下游外引物 B3 ;5' -TGCATAGCAATGTTGTCGCT-3,；
[0化^ 上游內引物 FIP ;5, -TCTCTCGGGTGGTGGATGGGTTTCGTTACACTCCGTTCGC-3,；
[0052]下游內引物 BIP ;5' -ATGGTTTGCTACTCTCGCACCCTCGGCTGACAAATGGCTCTA-3,。
[0化引分別W上述110株細菌DNA按照上述方法進行LAMP擴增，80°C終止反應l-2min， 取出反應管。
[0054] 顯色劑觀察；在反應管中加入1 y L10 %的巧光染料SYBR GREEN I顯色劑，直接用 肉眼觀察顏色變化，如顏色為澄色，陰性，如顏色變?yōu)榫G色，陽性。結果如表1。從表1可W 看出，利用本發(fā)明的環(huán)介導等溫擴增檢測副溶血性弧菌的檢測引物組，按照本發(fā)明的檢測 方法進行檢測，其具有較好的特異性，對2株副溶血性弧菌標準株和80株分離株陽性；對弧 菌屬的霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌和溶藻弧菌陰性；對非弧菌屬的其他25株菌陰性。
[0化5] 表1 ;特異性試驗所用菌株及實驗結果
[0化6]

【權利要求】
1. 一種應用環(huán)介導等溫擴增檢測副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus)的檢測 引物組，其特征在于，由下列引物組成： 上游外引物為F3 :5' -GCAAAGAAACGCTTGGCG-3' ； 下游外引物B3 :5' -TGCATAGCAATGITGTCGCT-3' ； 上游內引物FIP:5' -TCTCTCGGGTGGTGGATGGGITTCGTTACACTCCGITCGC-3' ； 下游內引物BIP:5' -ATGGITTGCTACTCTCGCACCCTCGGCTGACAAATGGCTCTA-3'。
2. -種非疾病的診斷和治療目的的副溶血性弧菌的檢測方法，其特征在于，對樣品進 行增菌培養(yǎng)獲得增菌液，提取增菌液中的細菌DNA，然后通過環(huán)介導等溫擴增的方法用權利 要求1所述的檢測引物組對細菌DNA進行選擇性擴增，確認是否存在有擴增產物。
3. 根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的樣品為水產品。
4. 根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的對樣品進行增菌培養(yǎng)是將樣 品接入質量百分數3%Nacl堿性蛋白胨水，36°C±1°C培養(yǎng)10h，獲得增菌液。
5. 根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的通過環(huán)介導等溫擴增的方法 用權利要求1所述的檢測引物組對細菌DNA進行選擇性擴增具體為：環(huán)介導等溫擴增體系 為體系總體積 25yL，包括 2. 5yLlOXThermopol反應緩沖液、0. 4yLlOmmol/LdNTPs、 0? 5yL10ymol/L上游外引物F3、0. 5yL10ymol/L下游外引物B3、lyL40ymol/L上游 內引物？1卩、11^4011111〇1/1下游內引物81?、0.61^100臟〇1/1]\%504、12.51^2111〇1/1甜 菜堿、2yL滅菌雙蒸水ddH20,1yL8U/yLBstDNA聚合酶和3yL細菌DNA模板，反應條 件為在溫度為60?65°C孵育45?60min。
6. 根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的確認是否存在有擴增產物選 用熒光顯色檢測，具體是在80°C終止反應1?2min，在擴增反應管中加入SYBRGreenI顯 色劑，1?5min后觀察結果，如果顏色為橙色，則樣品副溶血性弧菌陰性，無副溶血性弧菌， 如果顏色為綠色，則樣品副溶血性弧菌陽性，含有副溶血性弧菌。
7. -種副溶血性弧菌的檢測試劑盒，包括環(huán)介導等溫擴增試劑和檢測引物組，其特征 在于，所述的檢測引物組由下列引物組成： 上游外引物為F3 :5' -GCAAAGAAACGCTTGGCG-3' ； 下游外引物B3 :5' -TGCATAGCAATGITGTCGCT-3' ； 上游內引物FIP:5' -TCTCTCGGGTGGTGGATGGGITTCGTTACACTCCGITCGC-3' ； 下游內引物BIP:5' -ATGGITTGCTACTCTCGCACCCTCGGCTGACAAATGGCTCTA-3'。
【文檔編號】C12Q1/68GK104513857SQ201410822777
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年12月22日 優(yōu)先權日:2014年12月22日
【發(fā)明者】徐曉可, 吳清平, 張菊梅, 程健恒, 張淑紅, 鄧梅清 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司