一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法及胎盤(pán)組織復(fù)蘇方法
【專(zhuān)利摘要】一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法及胎盤(pán)組織復(fù)蘇方法，它涉及一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)建立方法。本發(fā)明的干細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法為：將至少3個(gè)部位的胎盤(pán)組織經(jīng)過(guò)無(wú)菌清洗處理后，組織剝離、進(jìn)一步消毒、剪細(xì)、冷凍劑保護(hù)，程序化冷凍、深低溫暫存、液氮罐長(zhǎng)期保存等步驟，長(zhǎng)期保存了具有生物學(xué)活性的胎盤(pán)組織。此方法保存的胎盤(pán)組織可應(yīng)用于胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的建立，根據(jù)所需要細(xì)胞種類(lèi)進(jìn)行選擇組織部位復(fù)蘇后復(fù)蘇、酶消化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、質(zhì)量檢驗(yàn)等，以便獲得胎盤(pán)羊膜上皮細(xì)胞、胎盤(pán)羊膜間充質(zhì)、胎盤(pán)絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤(pán)底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞等。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)化操作步驟，減少人工干預(yù)錯(cuò)誤，提高效率、保存了多種干細(xì)胞資源、為未來(lái)個(gè)性化干細(xì)胞定制提供基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法及胎盤(pán)組織復(fù)蘇方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建方法及胎盤(pán)組織復(fù)蘇方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 胎盤(pán)是寶寶賴以生存的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送的紐帶，由羊膜、絨毛膜和底蛻膜構(gòu)成。 羊膜和絨毛膜來(lái)源于胎兒，底蛻膜則起源于母體。胎盤(pán)除在胎兒發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)支持和維持耐受 中發(fā)揮重要作用外，還是一個(gè)機(jī)體的干細(xì)胞儲(chǔ)備庫(kù)。
[0003] 胎盤(pán)中有多種多能干細(xì)胞，目前已知的至少有三類(lèi)胎盤(pán)干細(xì)胞。胎盤(pán)中第一類(lèi)多 能干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs)，MSCs是一類(lèi)能夠自我更新，具 有多向分化能力的多能干細(xì)胞，可以分化為骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)和肝細(xì)胞等組織細(xì)胞。
[0004] 胎盤(pán)MSCs能抑制免疫和促進(jìn)造血重建的特性，使其在造血干細(xì)胞移植及移植后 GVHD防治方面具有良好的應(yīng)用前景。由于胎盤(pán)來(lái)源MSCs與骨髓來(lái)源MSCs相比具有組織來(lái) 源廣和細(xì)胞增殖能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，使其具有更好的臨床應(yīng)用前景。胎盤(pán)MSCs至少可以分為3 種，絨毛膜MSCs、羊膜MSCs，還包括來(lái)自母體的底蛻膜組織的MSCs，通過(guò)對(duì)絨毛層和底蛻膜 MSCs的免疫標(biāo)記檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們均表達(dá)典型的MSCs表面抗原⑶13、⑶29、⑶44、⑶54、⑶73、 ⑶105,不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原⑶3、⑶14、⑶34、⑶45和內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原⑶31。通過(guò) 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，絨毛膜MSCs還弱表達(dá)胚胎干細(xì)胞類(lèi)表面抗原SSEA-4,而羊膜MSCs表達(dá)典型的 MSCs表面抗原外，還表達(dá)胚胎干細(xì)胞類(lèi)的表面標(biāo)志物Oct-4。而底蛻膜作為母-胎界面的 組成部分之一，為母體面，意味著來(lái)源于底蛻膜的MSCs可作為母親來(lái)源的干細(xì)胞的一種。
[0005] 胎盤(pán)中的第二類(lèi)多能干細(xì)胞為羊膜上皮細(xì)胞（human amniotic epithelial cells，hAECs)。人hAECs作為一種干細(xì)胞，表達(dá)多種胚胎干細(xì)胞類(lèi)標(biāo)志物，包括SSEA-4、 SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-80, hAECs表達(dá)多潛能干細(xì)胞特定的轉(zhuǎn)錄因子0CT-4和Nanog基 因。同時(shí)具有向心肌、肝、神經(jīng)細(xì)胞以及胰島細(xì)胞等多系分化的潛力，因此人hAECs是介 于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之間的一個(gè)中間等級(jí)的干細(xì)胞。研宄中表明，hAECs不表達(dá) HLA-A、B、C、DR等人類(lèi)白細(xì)胞抗原具有免疫赦免性，移植后可以避免免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生， 具有非常廣泛的臨床應(yīng)用前景，近年來(lái)收集和保存羊膜上皮細(xì)胞也成為未來(lái)進(jìn)行臨床應(yīng)用 創(chuàng)造了條件。
[0006] 胎盤(pán)中的第三類(lèi)干細(xì)胞為胎盤(pán)造血干細(xì)胞（human placenta-derived hemopoietic stem cells, hFO-HSCs)。hFO-HSCs 是通過(guò)剪切胎盤(pán)胎兒面組織成 0.5mm3 的組織塊，經(jīng)中性蛋白酶、胰蛋白酶及膠原酶等進(jìn)行組織消化，或者經(jīng)CXCR-4受體阻滯劑 AMD3100加入灌注液灌注法獲得中間層單個(gè)核細(xì)胞。其⑶34、⑶133等造血干細(xì)胞表明抗 原表達(dá)均為陽(yáng)性。與流動(dòng)的臍帶血相比，胎盤(pán)組織間隙中的hPD-HSCs中⑶34陽(yáng)性細(xì)胞是 臍帶血中的數(shù)倍，胎盤(pán)⑶34+⑶38+hro-HSCs亞群細(xì)胞分化形成的粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落、爆 紅型集落、混合型集落數(shù)均明顯高于臍帶血造血干細(xì)胞。hro-HSCs的臨床應(yīng)用價(jià)值類(lèi)似于 臍帶血造血干細(xì)胞，可以在治療血液疾病，如急慢性白血病、再生障礙性貧血、地中海貧血 和淋巴瘤等方面有較好的效果，是一個(gè)可以補(bǔ)充臍帶血造血干細(xì)胞數(shù)量不足的重要干細(xì)胞 資源。
[0007] 目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)胎盤(pán)干細(xì)胞儲(chǔ)存方式為單一部位取樣，然后體外培養(yǎng)擴(kuò)增，達(dá)到 一定數(shù)量后進(jìn)行深低溫凍存。這種方式只進(jìn)行了胎盤(pán)組織中一種干細(xì)胞的擴(kuò)增、培養(yǎng)，而大 部分干細(xì)胞沒(méi)有能夠得到保存。本發(fā)明提供了一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法，本方法保存了 至少3個(gè)胎盤(pán)組織部位（包括但不限于羊膜、絨毛膜、胎盤(pán)底蛻膜），也保存了目前已知的多 種干細(xì)胞，同時(shí)，對(duì)胎盤(pán)組織中目前未知的、將來(lái)可能發(fā)展應(yīng)用潛力更大的干細(xì)胞也進(jìn)行了 保存，此方法簡(jiǎn)化操作步驟、提高效率、且保存了多種干細(xì)胞資源，為未來(lái)定制化干細(xì)胞分 離、培養(yǎng)、擴(kuò)增奠定了基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明是為胎盤(pán)組織的不同部位保存提供可靠的方法，此方法用于胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù) 建立，分離不同功能的干細(xì)胞，延長(zhǎng)胎盤(pán)組織的保存時(shí)間，保證組織內(nèi)細(xì)胞不受影響，保證 組織細(xì)胞的活性，操作方法簡(jiǎn)單，復(fù)蘇后可直接用于干細(xì)胞分離培養(yǎng)。
[0009] 本發(fā)明應(yīng)用胎盤(pán)組織的凍存方法，將胎盤(pán)不同部位組織剝離后分別剪小至0. 5? Imm3大小，加入配置好并提前遇冷的凍存液重懸后，分裝于凍存管內(nèi)，4°C溫度下平衡 30min，轉(zhuǎn)入-80°C冰箱內(nèi)過(guò)夜，最終置于液氮中長(zhǎng)期保存，根據(jù)所需要細(xì)胞種類(lèi)分別進(jìn)行復(fù) 蘇用于細(xì)胞培養(yǎng)。
[0010] 本發(fā)明的一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法，它是按照以下步驟進(jìn)行：
[0011] -、胎盤(pán)米集：米集留有3?5cm胳帶的完整胎盤(pán)，備用；
[0012] 二、胎盤(pán)組織預(yù)處理：取步驟一至少3個(gè)部位的胎盤(pán)組織分別采用組織剪、鉗進(jìn)行 仔細(xì)剝離、收集，收集后的組織分別用生理鹽水洗凈血液、剪小至〇. 5?Imm3大小，分別用 生理鹽水清洗2?3遍，其中，每次清洗后在1300rpm轉(zhuǎn)速下離心6min，收集沉淀，繼續(xù)下一 次清洗；清洗結(jié)束后，收集沉淀備用；
[0013] 三、組織塊凍存液配制：所述凍存液每ImL是由0. 68?0. 72mL DMEM、0. 07? 0. 12mL胎牛血清、0. 01?0. 02mL L-谷氨酰胺和0. 2mL二甲基亞砜組成，配制好后于4°C預(yù) 冷保存；或者組織塊凍存液采用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行配制；
[0014] 四、組織程序化凍存：將步驟二預(yù)冷保存的組織塊用0. 5倍組織塊體積的培養(yǎng)基 重懸配成組織懸液，再加入0. 5?1. 5倍組織懸液體積的步驟三配制的凍存液，然后分裝至 凍存管內(nèi)，首先在程控降溫盒中4°C平衡30min，然后轉(zhuǎn)入-80°C過(guò)夜暫存；
[0015] 五、對(duì)每一個(gè)凍存管設(shè)低溫防凍條碼，進(jìn)行管理；
[0016] 六、對(duì)步驟二的預(yù)處理后的胎盤(pán)組織樣本和步驟五復(fù)蘇的胎盤(pán)組織進(jìn)行厭氧菌、 需氧菌、霉菌、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒檢測(cè)；將檢測(cè)結(jié)果全部為陰性的胎盤(pán)組 織轉(zhuǎn)入-150°C?-180°C液氮罐氣相中長(zhǎng)期保存，即構(gòu)建出胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)。
[0017] 本發(fā)明的一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的胎盤(pán)組織復(fù)蘇方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的：
[0018] -、首先從權(quán)利要求1構(gòu)建的胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)中取出凍存管放在37°C?40°C水浴中 1?2min進(jìn)行解凍；
[0019] 二、將步驟一解凍后的胎盤(pán)組織放入潔凈的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM 混勻，然后在4°C溫度、轉(zhuǎn)速為1300轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心6min，去上清收集固相物，重復(fù) 離心操作2?3次，收集固相物；
[0020] 三、將步驟二收集的固相物接種到T75培養(yǎng)瓶中，加入DMEM培養(yǎng)液后置于0)2培 養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天后，計(jì)算貼壁組織塊數(shù)量和懸浮組織塊數(shù)量；
[0021] 通過(guò)如下方式計(jì)算組織塊貼壁成活率：
[0022] 貼壁成活率=培養(yǎng)瓶中貼壁成活的組織塊數(shù)量八培養(yǎng)瓶中貼壁成活的組織塊數(shù) 量+培養(yǎng)瓶中懸浮未貼壁組織塊數(shù)量）*100% ;
[0023] 即完成胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的胎盤(pán)組織復(fù)蘇。
[0024] 本發(fā)明的一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的胎盤(pán)組織復(fù)蘇方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的：
[0025] 一、首先從權(quán)利要求1構(gòu)建的胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)中取出凍存管放在37°C?40°C水浴中 1?2min進(jìn)行解凍；
[0026] 二、將步驟一解凍后的胎盤(pán)組織放入潔凈的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM 混勻，然后在4°C溫度、轉(zhuǎn)速為1300轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心6min，去上清收集固相物，重復(fù) 離心操作2?3次，收集固相物；
[0027] 三、對(duì)步驟二收集的固相物進(jìn)行酶解30?50min后，在4°C溫度、轉(zhuǎn)速為1300轉(zhuǎn)/ 分鐘的條件下離心6min，去上清收集沉淀的細(xì)胞，經(jīng)DMEM懸浮后取樣測(cè)定細(xì)胞活率并通過(guò) 如下方式計(jì)算復(fù)蘇細(xì)胞活率：細(xì)胞活率=活細(xì)胞數(shù)量八活細(xì)胞數(shù)量+死細(xì)胞數(shù)量）*100 %; 并計(jì)算復(fù)蘇后的細(xì)胞總數(shù)數(shù)量；即完成胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的胎盤(pán)組織復(fù)蘇。
[0028] 本發(fā)明包含以下有益效果：
[0029] 1)在建立干細(xì)胞庫(kù)時(shí)，僅僅進(jìn)行高效的組織凍存，操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、節(jié)省空間資源， 卻保存了大量的干細(xì)胞資源。如果是建庫(kù)一開(kāi)始就進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增，將要建立多種擴(kuò)增培養(yǎng) 體系、培養(yǎng)并保存多種細(xì)胞，這樣才能將目前已知的部分胎盤(pán)干細(xì)胞資源進(jìn)行保存。
[0030] 2)本發(fā)明是先將至少3個(gè)胎盤(pán)組織部位（胎盤(pán)羊膜、胎盤(pán)絨毛膜、胎盤(pán)底蛻膜）進(jìn) 行剝離，根據(jù)胎盤(pán)的不同部位（胎兒面，母體面）分別進(jìn)行凍存，根據(jù)患者需求進(jìn)行復(fù)蘇不 同部位的組織塊；
[0031] 3)本發(fā)明是將組織塊分別剪小至0. 5?Imm3大小，在凍存過(guò)程中，凍存保護(hù)液能 夠滲透組織細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的水分脫出，凍存過(guò)程中有效的減少凍存過(guò)程中冰晶的形成， 降低細(xì)胞的損傷；
[0032] 4)本發(fā)明冷凍保存液保護(hù)胎盤(pán)組織的不同部位，根據(jù)患者的使用需求進(jìn)行復(fù)蘇不 同部位的胎盤(pán)組織，有效的節(jié)約了胎盤(pán)組織塊，增加了患者的使用次數(shù)；
[0033] 5)本發(fā)明方法可應(yīng)用于新生兒出生后胎盤(pán)不同組織部位的保存，延長(zhǎng)組織的保存 時(shí)間到至少20年，于液氮中可長(zhǎng)期保存，根據(jù)母親、胎兒疾病選擇性復(fù)蘇不同部位的組織 塊，從而不同種類(lèi)的干細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用于臨床治療。
[0034] 6)本方法保存了至少3個(gè)胎盤(pán)組織部位的全部細(xì)胞，這不僅保存了目前已知的胎 盤(pán)干細(xì)胞，可以在需要臨床使用的時(shí)候，進(jìn)行有選擇性地進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，而且，也保存了目 前未知、但是將來(lái)有可能應(yīng)用前景更廣的胎盤(pán)細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞有可能由于目前我們的認(rèn)知 水平的限制而不知道其功用，而在10-20年以后可能其應(yīng)用價(jià)值才被發(fā)現(xiàn)，如果采用普通 的建庫(kù)方法，這類(lèi)細(xì)胞在最開(kāi)始就會(huì)因?yàn)槲覀兊牟涣私饬藳](méi)能擴(kuò)增并保存。
[0035] 7)本方法也確保了胎盤(pán)組織中的一些目前我們雖然了解其未來(lái)功用、但卻沒(méi)有良 好的培養(yǎng)、擴(kuò)增方法的干細(xì)胞得以完整的保存。待科技發(fā)展后，擴(kuò)增和培養(yǎng)手段不斷完善 后，再?gòu)谋痉椒ń⒌奶ケP(pán)干細(xì)胞庫(kù)中將這些細(xì)胞大量增殖，從而更好地進(jìn)行臨床研宄或 應(yīng)用。
[0036] 8)如果采用組織塊法進(jìn)行胎盤(pán)干細(xì)胞培養(yǎng)，本發(fā)明方法復(fù)蘇后胎盤(pán)組織塊貼壁成 活率高達(dá)98%以上。若采用酶消化法培養(yǎng)干細(xì)胞，凍存組織塊復(fù)蘇、酶解消化后細(xì)胞活性超 過(guò)90%，可成功制備得到胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞、羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞、羊膜上皮細(xì)胞等干細(xì)胞。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)建立流程示意圖；
[0038] 圖2為胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
[0039] 圖3為羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
[0040] 圖4為羊膜上皮細(xì)胞形態(tài)圖。

【具體實(shí)施方式】

【具體實(shí)施方式】 [0041] 一：本實(shí)施方式的一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法，它是按照以下步驟 進(jìn)行：
[0042] -、胎盤(pán)米集：米集留有3?5cm胳帶的完整胎盤(pán)，備用；
[0043] 二、胎盤(pán)組織預(yù)處理：取步驟一至少3個(gè)部位的胎盤(pán)組織分別采用組織剪、鉗進(jìn)行 仔細(xì)剝離、收集，收集后的組織分別用生理鹽水洗凈血液、剪小至〇. 5?Imm3大小，分別用 生理鹽水清洗2?3遍，其中，每次清洗后在1300rpm轉(zhuǎn)速下離心6min，收集沉淀，繼續(xù)下一 次清洗；清洗結(jié)束后，收集沉淀備用；
[0044] 三、組織塊凍存液配制：所述凍存液每ImL是由0. 68?0. 72mL DMEM、0. 07? 0. 12mL胎牛血清、0. 01?0. 02mL L-谷氨酰胺和0. 2mL二甲基亞砜組成，配制好后于4°C預(yù) 冷保存；或者組織塊凍存液采用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行配制；
[0045] 四、組織程序化凍存：將步驟二預(yù)冷保存的組織塊用0. 5倍組織塊體積的培養(yǎng)基 重懸配成組織懸液，再加入0. 5?1. 5倍組織懸液體積的步驟三配制的凍存液，然后分裝至 凍存管內(nèi)，首先在程控降溫盒中4°C平衡30min，然后轉(zhuǎn)入-80°C過(guò)夜暫存；
[0046] 五、對(duì)每一個(gè)凍存管設(shè)低溫防凍條碼，進(jìn)行管理；
[0047] 六、對(duì)步驟二的預(yù)處理后的胎盤(pán)組織樣本和步驟五復(fù)蘇的胎盤(pán)組織進(jìn)行厭氧菌、 需氧菌、霉菌、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒檢測(cè)；將檢測(cè)結(jié)果全部為陰性的胎盤(pán)組 織轉(zhuǎn)入-150°C?-180°C液氮罐氣相中長(zhǎng)期保存，即構(gòu)建出胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)。

【具體實(shí)施方式】 [0048] 二：本實(shí)施方式與一不同的是：所述的胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù) 包含但不限于胎盤(pán)絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤(pán)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤(pán)底蛻膜間充質(zhì)干細(xì) 胞和胎盤(pán)羊膜上皮細(xì)胞四種干細(xì)胞。其它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0049] 三：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟一中采集后的胎 盤(pán)用無(wú)菌生理鹽水沖洗表面血液后置于無(wú)菌生物樣本采樣袋內(nèi)，在4?25°C采集箱內(nèi)運(yùn) 輸，采集箱運(yùn)輸過(guò)程要求控制溫度恒定，防止顛簸，采集的胎盤(pán)需在72小時(shí)內(nèi)進(jìn)行處理。其 它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0050] 四：本實(shí)施方式與一不同的是：采集箱的溫度為4? 10°C。其它與一相同。
[0051]

【具體實(shí)施方式】五：本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是：采集的胎盤(pán)需在24小 時(shí)內(nèi)進(jìn)行處理。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0052] 六：本實(shí)施方式與一不同的是：采集箱的采集套裝 中，可以放置但不限于生理鹽水、DMEM等保存液，體積以蓋過(guò)胎盤(pán)為準(zhǔn)，并要求套裝密封性 能良好。其它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0053] 七：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟一中采集的胎盤(pán) 的供者為無(wú)血液系統(tǒng)病史、免疫系統(tǒng)病史、神經(jīng)系統(tǒng)病史、內(nèi)分泌系統(tǒng)病史、HTLV、HBV、HCV、 HIV、梅毒等感染史、惡性腫瘤史、吸毒史、染色體異常史、糖尿病史、性病史和其它遺傳病史 的供者。其它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0054] 八：本實(shí)施方式與一不同的是：所述凍存液每ImL是 由0. 70mL DMEM、0. IOmL胎牛血清、0. 15mL L-谷氨酰胺和0. 2mL二甲基亞砜組成。其它與 一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0055] 九：本實(shí)施方式與一不同的是：步驟四中的培養(yǎng)基為 DMEM、DMEM/F12、AMEM或無(wú)血清培養(yǎng)基。其它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0056] 十：本實(shí)施方式與一不同的是：所述的3個(gè)部位的胎 盤(pán)組織包括羊膜、胎盤(pán)絨毛膜和胎盤(pán)底蛻膜。其它與一相同。

【具體實(shí)施方式】 [0057] ^^一 ：本實(shí)施方式一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的胎盤(pán)組織復(fù)蘇方法，它是按 照以下步驟進(jìn)行的：
[0058] -、首先從權(quán)利要求1構(gòu)建的胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)中取出凍存管放在37°C?40°C水浴中 1?2min進(jìn)行解凍；
[0059] 二、將步驟一解凍后的胎盤(pán)組織放入潔凈的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM 混勻，然后在4°C溫度、轉(zhuǎn)速為1300轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心6min，去上清收集固相物，重復(fù) 離心操作2?3次，收集固相物；
[0060] 三、將步驟二收集的固相物接種到T75培養(yǎng)瓶中，加入DMEM培養(yǎng)液后置于0)2培 養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天后，計(jì)算貼壁組織塊數(shù)量和懸浮組織塊數(shù)量；
[0061] 通過(guò)如下方式計(jì)算組織塊貼壁成活率：
[0062] 貼壁成活率=培養(yǎng)瓶中貼壁成活的組織塊數(shù)量八培養(yǎng)瓶中貼壁成活的組織塊數(shù) 量+培養(yǎng)瓶中懸浮未貼壁組織塊數(shù)量）*100% ;
[0063] 即完成胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的胎盤(pán)組織復(fù)蘇。

【具體實(shí)施方式】 [0064] 十二：本實(shí)施方式一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的胎盤(pán)組織復(fù)蘇方法，它是按 照以下步驟進(jìn)行的：
[0065] -、首先從權(quán)利要求1構(gòu)建的胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)中取出凍存管放在37°C?40°C水浴中 1?2min進(jìn)行解凍；
[0066] 二、將步驟一解凍后的胎盤(pán)組織放入潔凈的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM 混勻，然后在4°C溫度、轉(zhuǎn)速為1300轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心6min，去上清收集固相物，重復(fù) 離心操作2?3次，收集固相物；
[0067] 三、對(duì)步驟二收集的固相物進(jìn)行酶解30?50min后，在4°C溫度、轉(zhuǎn)速為1300轉(zhuǎn)/ 分鐘的條件下離心6min，去上清收集沉淀的細(xì)胞，經(jīng)DMEM懸浮后取樣測(cè)定細(xì)胞活率并通過(guò) 如下方式計(jì)算復(fù)蘇細(xì)胞活率：細(xì)胞活率=活細(xì)胞數(shù)量八活細(xì)胞數(shù)量+死細(xì)胞數(shù)量）*100 %; 并計(jì)算復(fù)蘇后的細(xì)胞總數(shù)數(shù)量；即完成胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的胎盤(pán)組織復(fù)蘇。
[0068] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)【具體實(shí)施方式】的組 合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。
[0069] 通過(guò)以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：
[0070] 實(shí)施例一
[0071] 本實(shí)施例的胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)建立方法如下：
[0072] -、胎盤(pán)采集：采集留有3?5cm臍帶的完整胎盤(pán)，采集后的胎盤(pán)用無(wú)菌生理鹽水 沖洗表面血液后置于無(wú)菌生物樣本采樣袋內(nèi)，在4?25°C采集箱（最佳控制在4-KTC)內(nèi) 運(yùn)輸，采集套裝中，可以放置但不限于生理鹽水、DMEM等保存液，體積以蓋過(guò)胎盤(pán)為準(zhǔn)，并要 求套裝密封性能良好。運(yùn)輸過(guò)程要求控制溫度、防止顛簸、運(yùn)輸時(shí)間在72小時(shí)內(nèi)，最佳不超 過(guò)24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行制備；
[0073] 其中，胎盤(pán)供者要求無(wú)血液系統(tǒng)病史、免疫系統(tǒng)病史、神經(jīng)系統(tǒng)病史、內(nèi)分泌系統(tǒng) 病史、肌1^、耶￥、!1(^、!11￥、梅毒等感染史、惡性腫瘤史、吸毒史、染色體異常史、糖尿病史、性 病史和其它遺傳病史；供者孕期要求在38-42周，胎兒避免為早產(chǎn)兒；
[0074] 二、胎盤(pán)組織預(yù)處理：取步驟一至少3個(gè)部位的胎盤(pán)組織包括但不限于羊膜、絨 毛膜、胎盤(pán)底蛻膜）分別采用組織剪、鉗進(jìn)行仔細(xì)剝離、收集，每一部分組織至少剝離、收集 5?20克濕重，收集后的組織分別用生理鹽水洗凈血液、剪小至0. 5?Imm3大小，分別用生 理鹽水清洗2?3遍，其中，每次清洗后在1300rpm轉(zhuǎn)速下離心6min，收集沉淀，繼續(xù)下一次 清洗；清洗結(jié)束后，收集沉淀備用；
[0075] 三、組織塊凍存液配制：以IOml凍存液配制為例，其特征在于所述凍存液由6. 8? 7. 2mL DMEM、0. 7?I. 2mL胎牛血清、0. 1?0. 2mL L-谷氨酰胺和2mL二甲基亞砜組成，配 制好后于4 °C預(yù)冷保存，也可采用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行配制。
[0076] 四、組織程序化凍存：將步驟二預(yù)冷保存的組織塊用0. 5倍體積的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基 可以是但不限于DMEM、DMEM/F12、AMEM或者無(wú)血清培養(yǎng)基）重懸配成組織懸液（Iml組織： 0. 5mlDMEM培養(yǎng)基），然后向重懸液中加入步驟三配制的凍存液0. 5?1. 5倍（Iml組織懸 液：0. 5ml?I. 5ml凍存液），然后按每管ImL分裝到凍存管中，每部位組織凍存10-30管。 凍存管放置在程控降溫盒中4°C平衡30min后轉(zhuǎn)入-80度超低溫冰箱過(guò)夜暫存，待各項(xiàng)檢測(cè) 結(jié)果合格后轉(zhuǎn)入液氮中長(zhǎng)期保存；
[0077] 五、樣本條碼管理：
[0078] 胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)建立過(guò)程會(huì)按照條碼進(jìn)行管理，每個(gè)部位的胎盤(pán)組織都會(huì)有唯一的 條碼相對(duì)應(yīng)，相應(yīng)的凍存管上的條碼為低溫防凍條碼；
[0079] 六、對(duì)步驟二的胎盤(pán)組織樣本和步驟五的復(fù)蘇的胎盤(pán)組織進(jìn)行厭氧菌、需氧菌、霉 菌檢測(cè)和乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒檢測(cè)；對(duì)檢測(cè)結(jié)果為全部陰性的胎盤(pán)組織轉(zhuǎn) 入-150°C?_180°C液氮罐氣相中長(zhǎng)期保存，即構(gòu)建出胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)。
[0080] 本實(shí)施例胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的建立主要包含胎盤(pán)絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞，胎盤(pán)羊膜間充 質(zhì)干細(xì)胞，胎盤(pán)底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞，胎盤(pán)羊膜上皮細(xì)胞四種干細(xì)胞，通過(guò)對(duì)每種細(xì)胞的免 疫表型進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)胎盤(pán)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物表達(dá)和骨髓干細(xì)胞類(lèi)似， 陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物：⑶90、⑶105、⑶166、⑶29、⑶44和⑶73,羊膜來(lái)源的干 細(xì)胞還表達(dá)胚胎干細(xì)胞類(lèi)的表面標(biāo)志物SSEA-4,通過(guò)免疫熒光檢測(cè)羊膜來(lái)源的干細(xì)胞發(fā)現(xiàn) 其高表達(dá)胚胎干細(xì)胞特有的蛋白成分0CT-4,這些因子的陽(yáng)性表達(dá)說(shuō)明羊膜來(lái)源的干細(xì)胞 是介于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之間的具有多能性的類(lèi)胚胎干細(xì)胞。另外，可以從形態(tài)學(xué) 進(jìn)行細(xì)胞鑒定，胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞、羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞均具有紡錘狀并漩渦狀生長(zhǎng)形態(tài)，羊 膜上皮細(xì)胞具有鵝卵石狀細(xì)胞形態(tài)。
[0081] 對(duì)實(shí)施例一構(gòu)建的胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)中的胎盤(pán)組織進(jìn)行復(fù)蘇處理：
[0082] 解凍時(shí)，先將凍存管從液氮中取出，放在37°C?40°C水浴中1?2min內(nèi)迅速完成 解凍；用移液管將復(fù)蘇的組織塊吸入放入潔凈的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM輕輕 混勻，然后離心（4°C，1300轉(zhuǎn)/分鐘、6分鐘）去掉上清液，反復(fù)清洗2-3次，并去掉上清液； 將組織塊直接接種到T75培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)液后置于CO 2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)2天后，在 每一個(gè)培養(yǎng)瓶中，計(jì)算貼壁組織塊數(shù)量和懸浮組織塊數(shù)量，計(jì)算組織塊貼壁成活率（貼壁 成活率=培養(yǎng)瓶中貼壁成活的組織塊數(shù)量八培養(yǎng)瓶中貼壁成活的組織塊數(shù)量+培養(yǎng)瓶中 懸浮未貼壁組織塊數(shù)量）*1〇〇% );或者采用酶解法，采用但不限于膠原酶I、II、IV、胰酶、 胰酶替代物等消化酶進(jìn)行消化30-50分鐘后，4°C，1300轉(zhuǎn)/分鐘、6分鐘離心，去掉上清液， 收集單細(xì)胞顆粒。臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)算復(fù)蘇細(xì)胞活率（細(xì)胞活率=活細(xì)胞數(shù)量八活細(xì)胞數(shù) 量+死細(xì)胞數(shù)量）*100% )和細(xì)胞總數(shù)，并進(jìn)行干細(xì)胞鑒定。鑒定結(jié)果如表1和表2所示，
[0083] 表格1 :復(fù)蘇培養(yǎng)、擴(kuò)增后流式細(xì)胞儀及免疫熒光檢測(cè)鑒定
[0084]

【權(quán)利要求】
1. 一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于它是按照以下步驟進(jìn)行： 一、 胎盤(pán)米集：米集留有3?5cm胳帶的完整胎盤(pán)，備用； 二、 胎盤(pán)組織預(yù)處理：取步驟一至少3個(gè)部位的胎盤(pán)組織分別采用組織剪、鉗進(jìn)行仔細(xì) 剝離、收集，收集后的組織分別用生理鹽水洗凈血液、剪小至〇. 5?1mm3大小，分別用生理 鹽水清洗2?3遍，其中，每次清洗后在1300rpm轉(zhuǎn)速下離心6min，收集沉淀，繼續(xù)下一次清 洗；清洗結(jié)束后，收集沉淀備用； 三、 組織塊凍存液配制：所述凍存液每lmL是由0. 68?0. 72mL DMEM、0. 07?0. 12mL 胎牛血清、0. 01?0. 02mL L-谷氨酰胺和0. 2mL二甲基亞砜組成，配制好后于4°C預(yù)冷保存； 或者組織塊凍存液采用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行配制； 四、 組織程序化凍存：將步驟二預(yù)冷保存的組織塊用0. 5倍組織塊體積的培養(yǎng)基重懸 配成組織懸液，再加入0. 5?1. 5倍組織懸液體積的步驟三配制的凍存液，然后分裝至凍存 管內(nèi)，首先在程控降溫盒中4°C平衡30min，然后轉(zhuǎn)入-80°C過(guò)夜暫存； 五、 對(duì)每一個(gè)凍存管設(shè)低溫防凍條碼，進(jìn)行管理； 六、 對(duì)步驟二的預(yù)處理后的胎盤(pán)組織樣本和步驟五復(fù)蘇的胎盤(pán)組織進(jìn)行厭氧菌、需氧 菌、霉菌、乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒和梅毒檢測(cè)；將檢測(cè)結(jié)果全部為陰性的胎盤(pán)組織轉(zhuǎn) 入-150°C?_180°C液氮罐氣相中長(zhǎng)期保存，即構(gòu)建出胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于所述的胎盤(pán)干細(xì)胞 庫(kù)包含胎盤(pán)絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤(pán)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤(pán)底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞和胎 盤(pán)羊膜上皮細(xì)胞四種干細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于步驟一中采集后的 胎盤(pán)用無(wú)菌生理鹽水沖洗表面血液后置于無(wú)菌生物樣本采樣袋內(nèi)，在4?25°C采集箱內(nèi)運(yùn) 輸，采集箱運(yùn)輸過(guò)程要求控制溫度恒定，防止顛簸，采集的胎盤(pán)需在72小時(shí)內(nèi)進(jìn)行處理。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于所述凍存液每lmL 是由0. 70mL DMEM、0. 10mL胎牛血清、0. 15mL L-谷氨酰胺和0. 2mL二甲基亞砜組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于步驟四中的培養(yǎng)基 為DMEM、DMEM/F12、AMEM或無(wú)血清培養(yǎng)基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于所述的3個(gè)部位的 胎盤(pán)組織包括羊膜、胎盤(pán)絨毛膜和胎盤(pán)底蛻膜。
7. -種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的胎盤(pán)組織復(fù)蘇方法，其特征在于它是按照以下步驟進(jìn)行的： 一、 首先從權(quán)利要求1構(gòu)建的胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)中取出凍存管放在37°C?40°C水浴中1? 2min進(jìn)行解凍； 二、 將步驟一解凍后的胎盤(pán)組織放入潔凈的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM混勻， 然后在4°C溫度、轉(zhuǎn)速為1300轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心6min，去上清收集固相物，重復(fù)離心操 作2?3次，收集固相物； 三、 將步驟二收集的固相物接種到T75培養(yǎng)瓶中，加入DMEM培養(yǎng)液后置于C02培養(yǎng)箱 內(nèi)培養(yǎng)2天后，計(jì)算貼壁組織塊數(shù)量和懸浮組織塊數(shù)量； 通過(guò)如下方式計(jì)算組織塊貼壁成活率： 貼壁成活率=培養(yǎng)瓶中貼壁成活的組織塊數(shù)量八培養(yǎng)瓶中貼壁成活的組織塊數(shù)量+ 培養(yǎng)瓶中懸浮未貼壁組織塊數(shù)量）*100% ; 即完成胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的胎盤(pán)組織復(fù)蘇。
8. -種胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的胎盤(pán)組織復(fù)蘇方法，其特征在于它是按照以下步驟進(jìn)行的： 一、 首先從權(quán)利要求1構(gòu)建的胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)中取出凍存管放在37°C?40°C水浴中1? 2min進(jìn)行解凍； 二、 將步驟一解凍后的胎盤(pán)組織放入潔凈的離心管中，加入2?3倍體積的DMEM混勻， 然后在4°C溫度、轉(zhuǎn)速為1300轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心6min，去上清收集固相物，重復(fù)離心操 作2?3次，收集固相物； 三、 對(duì)步驟二收集的固相物進(jìn)行酶解30?50min后，在4°C溫度、轉(zhuǎn)速為1300轉(zhuǎn)/分鐘 的條件下離心6min，去上清收集沉淀的細(xì)胞，經(jīng)DMEM懸浮后取樣測(cè)定細(xì)胞活率并通過(guò)如下 方式計(jì)算復(fù)蘇細(xì)胞活率：細(xì)胞活率=活細(xì)胞數(shù)量八活細(xì)胞數(shù)量+死細(xì)胞數(shù)量）*1〇〇 % ;并 計(jì)算復(fù)蘇后的細(xì)胞總數(shù)數(shù)量；即完成胎盤(pán)干細(xì)胞庫(kù)的胎盤(pán)組織復(fù)蘇。
【文檔編號(hào)】C12N5/0735GK104480533SQ201410834913
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月29日
【發(fā)明者】張怡, 王靈娟, 付寅生, 劉艷青 申請(qǐng)人:黑龍江天晴干細(xì)胞股份有限公司