一個受高鹽和水楊酸誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子啟動子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個受高鹽和水楊酸誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子啟動子PCb-RARE及其應(yīng)用，該啟動子來源于竹節(jié)樹(Carallia brachiata)反轉(zhuǎn)座子Cb-RARE-1的LTR區(qū)，其序列如SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明用含有該啟動子和GUS基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，驗(yàn)證了該啟動子受NaCl和水楊酸的誘導(dǎo)，利用該特性，可以把該啟動子應(yīng)用在耐鹽堿植物的篩選和分子育種中。本發(fā)明利用誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)，該啟動子的功能在高鹽或水楊酸刺激下可被激活或抑制，因此可在特定時(shí)間或生長時(shí)期利用高濃度氯化鈉或水楊酸激活或抑制基因表達(dá)進(jìn)而控制基因產(chǎn)物的合成，從而可以有目的地調(diào)節(jié)植物生長。
【專利說明】一個受高鹽和水楊酸誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子啟動子及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一個受高鹽和水楊酸誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 (也稱反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)座子）啟動子其應(yīng)用，該啟動子來源于竹節(jié)樹（Carallia brachiata)反轉(zhuǎn)座子 Cb-RARE-1 的 LTR 區(qū)。

【背景技術(shù)】
[0002] 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retrotransposon, RTN)是指以RNA為媒介進(jìn)行增殖與轉(zhuǎn)座的元 件。在反轉(zhuǎn)錄酶RT與RNaseH作用下，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)錄成染色體外DNA，再在整合酶作 用下插入到染色體新的位置上。反轉(zhuǎn)座子的插入能引起基因內(nèi)或者基因附近的穩(wěn)定突變。 因此反轉(zhuǎn)座子跳躍的特性可以用于突變的引發(fā)并用于種質(zhì)培育等。
[0003] 具有長片段末端重復(fù)（long terminal repeat, LTR)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子兩端各有一 正向排列的重復(fù)序列，包含有與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的啟動子（promoter)和終止子（terminator)。 啟動子可啟動反轉(zhuǎn)座子內(nèi)部基因的轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物參與轉(zhuǎn)座行為的控制。大部分轉(zhuǎn)座行為是 有害的，機(jī)體發(fā)展了許多機(jī)制抑制其轉(zhuǎn)座活性。通常情況下，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是靜止的。但 是，在受到各種生物和非生物脅迫時(shí)，部分反轉(zhuǎn)座子能被激活，發(fā)生轉(zhuǎn)座。例如，小麥中反轉(zhuǎn) 錄轉(zhuǎn)座子TaR T-1受MeJA、SA或白粉病原菌（Powdery Mildew Fungus)脅迫時(shí)，表達(dá)上調(diào) (Tang et al.，2005);燕麥基因0ARE-1在SA處理、UV照射、外傷以及病原菌脅迫下，表達(dá) 水平上調(diào)（Kimura et al.，2001) 〇
[0004] 植物基因工程和生物技術(shù)的發(fā)展為耐性作物的研宄以及植物生物反應(yīng)器的研宄 做出了巨大的貢獻(xiàn)。但是，如何控制外源基因定時(shí)定量地高效表達(dá)，是限制基因工程技術(shù)在 作物遺傳改良方面有效應(yīng)用的重要因素。解決辦法之一是尋找有效的目的基因，而另一種 辦法則是尋找可有效控制目的基因表達(dá)的啟動子。
[0005] 啟動子控制與其融合的目的基因在植物宿主中的時(shí)空表達(dá)，因此啟動子類型的選 擇決定基因的表達(dá)時(shí)間和部位。根據(jù)啟動子驅(qū)動基因表達(dá)的不同特點(diǎn)，啟動子分為組成型 啟動子和特異性啟動子。組成型啟動子能在所有細(xì)胞或組織中，不分時(shí)間和空間地啟動轉(zhuǎn) 錄；特異性啟動子又可分為組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。組織特異型啟動子是指啟 動目的基因只在某些特定的器官或組織中表達(dá)；誘導(dǎo)型啟動子是指受到某些物理或化學(xué)信 號的刺激，可以大幅度地改變目的基因的表達(dá)水平一類啟動子。
[0006] Kasuga等利用誘導(dǎo)型rd29A啟動子代替組成型啟動子CaMV35S轉(zhuǎn)化擬南芥，提高 了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性，同時(shí)減少了組成型過表達(dá)造成的植株生長停滯或矮化現(xiàn)象的發(fā) 生（Narusaka等，2003, PlantJ 34, 137-148)。誘導(dǎo)型啟動子只有在接受誘導(dǎo)信號后才促使 目的基因的表達(dá)模式發(fā)生變化，因此在植物分子育種中使用這類啟動子可以有效控制植物 的基因表達(dá)和表型，不僅不會造成各種資源的浪費(fèi)，還能減少對植物生長發(fā)育及其他代謝 途徑的影響。因此，研宄和利用誘導(dǎo)型啟動子，對于研宄植物響應(yīng)各種脅迫的生理機(jī)理以及 通過基因工程培育農(nóng)作物新型品種有重要的意義，在基礎(chǔ)研宄和植物生物技術(shù)方面也有著 廣闊的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的首要目的在于提供一個受高鹽和水楊酸誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子啟動子 Pcmme，該啟動子來源于竹節(jié)樹（Carallia brachiata)反轉(zhuǎn)座子Cb-RARE-1的LTR區(qū)。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述啟動子序列的表達(dá)盒。
[0009] 本發(fā)明的再一目的在于提供含有上述啟動子序列的重組載體。
[0010] 本發(fā)明的第四個目的在于提供上述的啟動子在耐鹽堿植物的篩選和分子育種中 的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0012] 一個受高鹽和水楊酸誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子啟動子Pcb_KAKE，其序列如SEQ ID NO:l所 示，序列長度974bp，該啟動子來源于竹節(jié)樹（Carallia brachiata)反轉(zhuǎn)座子Cb-RARE-1的 LTR區(qū)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該啟動子序列可以啟動下游基因的表達(dá)，其活性和特異性受到水楊 酸和氯化鈉的調(diào)節(jié)。
[0013] 一種表達(dá)盒，包含上述的啟動子序列和目的基因序列。
[0014] -種重組表達(dá)載體，包含上述的啟動子序列，或者包含上述的表達(dá)盒。
[0015] 基于上述啟動子受高鹽和水楊酸誘導(dǎo)的特性，可以將該啟動子應(yīng)用于耐鹽堿植物 的篩選和分子育種。
[0016] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0017] 本發(fā)明利用誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)外源基因在植物體內(nèi)表達(dá)，該啟動子的功能在高鹽 或水楊酸刺激下可被激活或抑制，因此可在特定時(shí)間或生長時(shí)期利用高濃度氯化鈉或水楊 酸激活或抑制基因表達(dá)進(jìn)而控制基因產(chǎn)物的合成，從而可以有目的地調(diào)節(jié)植物生長。迄今 為止，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于該啟動子核苷酸序列的報(bào)道，亦未發(fā)現(xiàn)利用該啟動子有條件地啟動基 因表達(dá)特性的應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是Pa_KAKE::⑶S轉(zhuǎn)基因擬南芥對不同濃度NaCl的響應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0019] 圖2是Pa_KAKE::⑶S轉(zhuǎn)基因擬南芥在100mMNaCl處理不同時(shí)間的響應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0020] 圖3是Pcb_KAKE: :GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥的胚軸和根尖部位對不同濃度水楊酸的響應(yīng)實(shí) 驗(yàn)結(jié)果圖。
[0021] 圖4是Peb_KAKE::⑶S轉(zhuǎn)基因擬南芥對10mM水楊酸處理不同時(shí)間的響應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 竹節(jié)樹DNA提取及反轉(zhuǎn)座子Cb-RARE-1假定LTR序列Peb_KAKE的克?。?br> [0025]采用改進(jìn)的CTAB法（Doyle and Doyle, 1990)提取竹節(jié)樹葉片總DNA。利用TaKaRa 公司試劑盒LA PCR? Kit，按照其說明書的反應(yīng)體系擴(kuò)增Cb-RARE-1的LTR序列Pa_KAKE。
[0026] 所用引物對為：
[0027] Cb-promoter-F:5,-GAATTCAGAGTGTCTATTGAGCATATT-3,(SEQIDNO:2)
[0028]Cb-promoter-R2:5'-GGTACCCACATCTATAAGCATAAT-3'（SEQIDN0:3)〇
[0029] 引物的 5'端添加了限制性內(nèi)切酶EcoR I(5'-GAATTC-3'）或KpnI(5'-GGTACC-3'） 的識別序列。
[0030] PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 2min ;94°C變性 45sec，58°C復(fù)性 45sec，72°C延伸 3min，35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收（Axygen Biosciences),并連接 于PMDTM18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆測序。所得序列即為 SEQ ID N0:1。
[0031] 實(shí)施例2
[0032] 含Pa_KAKE::⑶S表達(dá)盒的重組表達(dá)載體pBI-pCb-RARE的構(gòu)建：
[0033] 擴(kuò)大培養(yǎng)實(shí)施例1中獲得的陽性克?。ㄔ摽寺『蠵a_KAKE序列的重組質(zhì)粒）。利 用質(zhì)粒提取試劑盒（AXYGENAXYPr印?PlasmidMinpr印Kit)提取質(zhì)粒DNA，以該質(zhì)粒為 模板，下面序列為引物，通過實(shí)施例1中的PCR反應(yīng)程序擴(kuò)增Pcb__序列。
[0034] Pcb-EAEE-F：5,-AAGCTTAGAGTGTCTATTGAGCATATT-3 , (SEQ IDN0:4)〇
[0035] Pcb-EAEE-R：5,-GTCGACCACATCTATAAGCATAAT-3?(SEQIDN0:5)〇
[0036] 所得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（AXYGEN AXYPrep? P1 asmi d Minprep Kit，上海申能博彩）回收。將該回收片段與T_載體（Takara，T_easy vector) 連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，獲得含有Peb_KAKE序列的重組JM109株系（稱為 JMIOQ-P^^gg) 〇
[0037] 擴(kuò)大培養(yǎng)JM109-Peb_KAKE，利用質(zhì)粒提取試劑盒（AXYGEN AXYPr印? Plasmid Minpr印Kit)提取質(zhì)粒DNA。用限制性內(nèi)切酶Hindlll和Sail進(jìn)行雙酶切，并用瓊脂糖凝 膠回收試劑盒（AXYGEN AXYPr印? Plasmid Minpr印Kit，上海申能博彩）回收長度為986bp 的P〇ri?E片段（SEQIDNO: 1加上兩端共12bp的酶切位點(diǎn)）。
[0038]用同樣的限制性內(nèi)切酶HindllI和SalI切割植物雙元表達(dá)載體質(zhì)粒pBI 101，并 膠回收大片段。將雙元載體質(zhì)粒PBI101的大片段與片段用T4DNA連接酶連接，得到 PBI-Po^^: :GUS重組載體質(zhì)粒，將該質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。利用Peb_KAKE的特異引 物，通過PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子并保存菌種。陽性轉(zhuǎn)化子中含有P eb_KAKE融合GUS報(bào)告基因的 重組載體（pBI-Pcb_ KAKE::⑶S)。
[0039] 實(shí)施例3
[0040] 含有Pa__::⑶S表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因擬南芥的構(gòu)建：
[0041] 擴(kuò)大培養(yǎng)含重組載體（pBI-Pa_KAKE::⑶S)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，收集菌體后提取 PBI-Po^g: :GUS重組載體質(zhì)粒。取純化的:GUS重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 EHA105,挑選能在含有60mg/L利福平與50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)板上生長的菌落并進(jìn)行 PCR鑒定，挑選可擴(kuò)增到P a__片段的陽性轉(zhuǎn)化子并保存農(nóng)桿菌菌種。
[0042] 取上述農(nóng)桿菌菌種活化培養(yǎng)一天后，以1%的接種比例接種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)12小時(shí) 以上，至〇D6(i(i= 0. 6?0. 8。4000rpm室溫離心10min，棄上清液，收集菌體。用新鮮配制的 5%蔗糖轉(zhuǎn)化液懸浮菌體，使0D6QQ= 0.6?0.8。加入0.03% Silwet (購自美國GE公司） 混勻。
[0043] 選擇健康的、有較多花苞的擬南芥哥倫比亞生態(tài)型的野生型植株，通過花序浸泡 法轉(zhuǎn)化擬南芥植株。收集轉(zhuǎn)化植株果實(shí)，即為T1代種子。將T1代種子播撒在含30mg/L潮 霉素的MS培養(yǎng)板上進(jìn)行篩選，選取能正常生長的植株，即為T1代植株。收集T1代植株果 實(shí)，即為T2代種子。在30mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)板上播下T2代種子，選擇健康生長幼苗轉(zhuǎn) 入營養(yǎng)土繼續(xù)培養(yǎng)，并進(jìn)行單株收種，即為T3代種子。將每個單株獲得的T3代種子播撒在 30mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)板上進(jìn)行單拷貝插入的純合植株篩選。統(tǒng)計(jì)全體樣本在30mg/L潮 霉素的MS培養(yǎng)板上培養(yǎng)時(shí)的抗性：非抗性幼苗的分離比，分離比接近或等于3:1的株系即 為單拷貝插入株系。在單拷貝插入株系中選擇能在30mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)板上100%健 康成長的單株為純合植株。該純合植株（其基因型記為：Pt^^iGUS/Col)被用于后續(xù)的 工作。
[0044] 實(shí)施例4
[0045] 轉(zhuǎn)基因擬南芥:⑶S/Col在高鹽下的⑶S基因表達(dá)活性分析：
[0046] 取表面消毒后的轉(zhuǎn)基因擬南芥Peb__: :GUS/Col、野生型（Col)的種子播于MS培 養(yǎng)基平板上，4°C低溫處理3天后，轉(zhuǎn)移到長日照（16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗）下培養(yǎng)10天。 取擬南芥幼苗，轉(zhuǎn)移到潤濕了 l〇〇mM或150mM NaCl溶液的濾紙上進(jìn)行高鹽脅迫處理。每種 鹽濃度下處理0.5、1、2小時(shí)。脅迫處理結(jié)束后，馬上取出幼苗，放入有500 yL⑶S組織化 學(xué)檢測液的離心管中，使幼苗被完全浸泡。將上述離心管置于37°C 6小時(shí)或以上。取出幼 苗，用75%乙醇溶液和無水乙醇漂洗、脫色。在脫色過程中，不定時(shí)更換乙醇，直至脫色完 全。將幼苗放置在體視顯微鏡或普通光學(xué)顯微鏡下觀察。
[0047] 結(jié)果表明高鹽脅迫下⑶S基因的表達(dá)水平和組織特異性發(fā)生了變化：如圖1所示， 與處理前相比，100mM NaCl處理后轉(zhuǎn)基因植株的胚軸、幼嫩真葉、根的⑶S染色變淺，表明 ⑶S基因表達(dá)下調(diào)，而在根尖部位染色加深，即⑶S基因表達(dá)上調(diào)，表明在以上組織或器官 中Pdrf? E啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的活性可被高鹽調(diào)控。
[0048] 此外，lOOmM NaCl處理不同時(shí)間時(shí)，胚軸的⑶S組織化學(xué)染色均隨著時(shí)間延長而 逐漸減弱，2小時(shí)處理時(shí)顏色最淺（圖2)，表明啟動子的活性隨著高鹽處理時(shí)間的延 長逐漸被抑制。
[0049] 實(shí)施例5
[0050] 轉(zhuǎn)基因擬南芥:⑶S/Col在水楊酸處理下⑶S基因表達(dá)的檢測：
[0051] 取表面消毒后的轉(zhuǎn)基因擬南芥:⑶S/Col、野生型（Col)的種子分別將其浸 泡在200 y 1的蒸餾水、0. ImM SA、lmM SA溶液中，4°C低溫處理3天后，再將其播在MS培養(yǎng) 基中，在22±2°C和長日照環(huán)境中培養(yǎng)7?10天，轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。3個星期后， 選取整齊一致的植株用10mM水楊酸噴灑處理〇. 5h、lh、2h，同時(shí)用蒸餾水噴灑作陰性對照。 剪取植株不同部位進(jìn)行⑶S組織化學(xué)檢測。
[0052] 結(jié)果如圖3所示，不同濃度的水楊酸處理使胚軸上部染色變淺，而靠近根尖部位 染色有一定程度的加深。
[0053] 當(dāng)使用10mMSA處理時(shí)，隨著處理時(shí)間延長葉片染色先變淺后恢復(fù)，處理1小時(shí)后 染色最淺，2小時(shí)處理則恢復(fù)非處理時(shí)染色（圖4)，表明啟動子的活性受到水楊酸的 調(diào)節(jié)。
[0054] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一個受高鹽和水楊酸誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子啟動子P a^AKE，其序列如SEQ ID NO: 1所 不〇
2. -種表達(dá)盒，其特征在于：包含權(quán)利要求1所述的啟動子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒，其特征在于：還包含目的基因序列。
4. 一種重組表達(dá)載體，其特征在于：包含權(quán)利要求1所述的啟動子序列，或者包含權(quán)利 要求2或3所述的表達(dá)盒。
5. 權(quán)利要求1所述的啟動子在耐鹽堿植物的篩選和分子育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450708SQ201410834918
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月29日
【發(fā)明者】唐恬, 梁山, 林星欽, 劉小如, 區(qū)佩如, 潘婷 申請人:中山大學(xué), 華南師范大學(xué)