一種快速提取動物糞便微生物rna的試劑盒及提取方法
一種快速提取動物糞便微生物rna的試劑盒及提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒及提取方法，該試劑盒主要利用硅膠模吸附柱吸附糞便微生物RNA，再采用特有的去蛋白液和漂洗液洗去蛋白等雜質(zhì)，與常規(guī)的動物糞便糞便微生物RNA提取方法相比，該試劑盒不僅節(jié)省了大量提取時間，同時簡化了實驗步驟，能夠更有效、快速、經(jīng)濟地提取到動物糞便微生物RNA。
【專利說明】一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒及提取方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒 及提取方法。
【背景技術】
[0002] 在腸道微生物的傳統(tǒng)研宄方法中，顯微鏡方法對于菌群計數(shù)非常有價值，該方法 由于所需設備簡單、操作簡便、耗時短，很適宜臨床應用。但該法并不能完全反映腸道菌群 的狀態(tài)，更不能對微生物種類和數(shù)量進行精確定量，且操作過程受主觀因素影響較大，最 重要的一點是不能獲得純培養(yǎng)物，不能對其進行下一步的研宄，有較大局限。
[0003] 隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，越來越多的技術被應用到腸道微生物的研宄中來， 其中最主要的兩種分子物質(zhì)，DNA和RNA日益成為腸道微生物研宄的重點。RNA是以DNA的 一條鏈為模板，以堿基互補配對原則，轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈，主要功能是實現(xiàn)遺傳信息在 蛋白質(zhì)上的表達，是遺傳信息傳遞過程中的橋梁，RNA的提取是分子生物學的基礎實驗，對 于cDNA文庫構建、熒光定量PCR、RT-PCR、Northern雜交等下游分子生物學實驗來說，都需 要質(zhì)量好的，完整性高的RNA。Chomczyski和Sacchi第一次提出了用異硫氰酸胍法提取細 胞內(nèi)的RNA，使得RNA的提取過程變得簡便快捷。
[0004] 目前，關于動物糞便微生物RNA提取的報道較少，因為糞便中含有較為復雜的物 質(zhì)，傳統(tǒng)方法提取時間過長，常會造成提取到的糞便微生物RNA降解。因此，研宄一種快速、 便捷的動物糞便微生物RNA提取方法顯得至關重要，這對于我們開展動物糞便微生物RNA 的后續(xù)研宄有著重大的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒及提取方法， 該試劑盒主要利用硅膠模吸附柱吸附柱吸附糞便微生物RNA，再采用特有的去蛋白液（工 作液I)和漂洗液（工作液J)洗去蛋白等雜質(zhì)，利用該試劑盒可以快速提取到動物糞便微 生物RNA。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0007] -種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，所述試劑盒由吸附柱及以下工作液 組成：
[0008] 工作液A :由終濃度0? 25-0. 37mol/L磷酸二氫鉀和終濃度0? 175-0. 2mol/L氫氧 化鈉組成，pH= 7-8 ;
[0009] 工作液B :由終濃度10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)和終濃度 l-10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA)組成，pH = 5. 0-8. 0 ;
[0010] 工作液C :質(zhì)量濃度為1-2%溶菌酶；
[0011] 工作液D:10-20mg/mL蛋白酶K;
[0012] 工作液E :質(zhì)量濃度10-20 %的十二烷基硫酸鈉（SDS);
[0013] 工作液F:體積比為酚：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液；
[0014] 工作液G :體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液；
[0015] 工作液H:體積濃度70-80%無水乙醇；
[0016] 工作液I :由終濃度3-6mol/L鹽酸胍和終濃度10-30mmol/L三羥甲基氨基甲烷 鹽酸鹽（Tris-HCl)組成，pH = 6. 0-7. 0,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為 30-40% ；
[0017] 工作液J :由終濃度20-50mmol/L NaCl和終濃度2-5mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽 酸鹽（Tris-HCl)組成，pH = 7. 0-8.0,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為 80-90 %〇
[0018] 所述RNA吸附柱為硅膠膜RNA吸附柱，購買自北京天恩澤公司，產(chǎn)品編號： 60911-50。
[0019] 本發(fā)明所述終濃度是指溶液在工作液中的終濃度，例如工作液A :由終濃度 0? 25-0. 37mol/L磷酸二氫鉀和終濃度0? 175-0. 2mol/L氫氧化鈉組成，pH = 7-8 ;是指 磷酸二氫鉀在工作液A中的濃度為0. 25-0. 37mol/L，氫氧化鈉在工作液A中的濃度為 0? 175-0. 2mol/L，工作液 A 的 pH = 7-8〇
[0020] 進一步，所述工作液I由終濃度5mol/L鹽酸胍和終濃度20mmol/L三羥甲基氨基 甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)組成，pH = 6. 6,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為 38%〇
[0021] 進一步，所述工作液J由終濃度20mmol/L NaCl和終濃度2mmol/L三羥甲基氨基 甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)組成，pH = 7. 5,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度 為 85%。
[0022] 所述試劑盒的提取方法，包括糞便的前處理、糞便中微生物細胞的裂解、RNA的游 離與雜蛋白的抽除，RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除，具體步驟如下：
[0023] 1)糞便的前處理：稱取0. 3-0. 5g新鮮糞便于2ml離心管中，加入l-2ml工 作液A振蕩l_2min，3000-5000rpm/min離心10_20min，轉(zhuǎn)移上清至滅菌的離心管中， 10000-12000rpm/min 離心 10_20min，棄上清，保留沉淀；
[0024] 2)糞便中微生物細胞的裂解：在上述沉淀中加入450-600 yl工作液B和 50-60 y 1工作液C，混勻后，37-40°C水浴l-2h，加入65-70 y 1工作液D和65-70 y 1工作液 E，混勻后，37-60°C水浴l_2h ;
[0025] 3) RNA的游離與雜蛋白的抽除：在上述溶液中加入600-800 y 1工作液F，振蕩器震 蕩30_60s后，12000-13000rpm/min離心10_20min，轉(zhuǎn)移一次上清液至滅菌的離心管中，加 入與一次上清液等體積的工作液G，12000-13000rpm/min離心10-20min，將二次上清液移 至滅菌的離心管中；
[0026] 4)RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：加入與二次上清液等體積的工作液H，混合均勻 后，加到RNA吸附柱上，12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，然后加入500-600ul 工作液I，12000-13000rpm/min離心l_2min，倒掉液體，然后加入500-600ul工作液 J，12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，然后再次加入500-600ul工作液J， 12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，將RNA吸附柱吹干后加入50-60ul DEPC水， 12000-13000rpm/min離心l-2min，收集液體，獲得所述動物奠便微生物RNA。
[0027] 本發(fā)明采用以上技術方案，所述試劑盒主要利用硅膠模吸附柱吸附糞便微生物 RNA，再采用特有的去蛋白液（工作液I)和漂洗液（工作液J)洗去蛋白等雜質(zhì)，具體步驟 包括糞便的前處理、糞便中微生物細胞的裂解、RNA的游離與雜蛋白的抽除，RNA的吸附以 及雜質(zhì)的去除。常規(guī)的動物糞便糞便微生物RNA提取方法操作時間需要12小時以上，本發(fā) 明試劑盒僅需要4小時即可提取到動物糞便糞便微生物RNA，由于RNA容易被降解，本發(fā)明 減少操作時間可以大大降低動物糞便糞便微生物RNA被降解的風險。本發(fā)明試劑盒不僅節(jié) 省了大量提取時間，同時簡化了實驗步驟，能夠更有效、快速、經(jīng)濟地提取到動物糞便微生 物 RNA〇
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028] 圖1為利用本發(fā)明試劑盒提取的動物糞便微生物RNA的電泳檢測圖：
[0029] 泳道1，2分別是利用本發(fā)明試劑盒提取到的動物糞便微生物RNA檢測結(jié)果；
[0030] 泳道 3 為TAKARADL2000DNAMarker。
【具體實施方式】
[0031] 一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，所述試劑盒由吸附柱及以下工作液 組成：
[0032] 工作液A :由終濃度0? 25-0. 37mol/L磷酸二氫鉀和終濃度0? 175-0. 2mol/L氫氧 化鈉組成，pH = 7-8 ;
[0033] 工作液B :由終濃度10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)和終濃度 l-10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA)組成，pH = 5. 0-8. 0 ;
[0034] 工作液C:質(zhì)量濃度為1-2%溶菌酶；
[0035]工作液D : 10-20mg/mL蛋白酶K ;
[0036] 工作液E:質(zhì)量濃度10-20 %的十二烷基硫酸鈉（SDS);
[0037] 工作液F :體積比為酚：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液；
[0038] 工作液G :體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液；
[0039] 工作液H:體積濃度70-80 %無水乙醇；
[0040] 工作液I :由終濃度3-6mol/L鹽酸胍和終濃度10-30mmol/L三羥甲基氨基甲烷 鹽酸鹽（Tris-HCl)組成，pH = 6. 0-7. 0,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為 30-40% ；
[0041] 工作液J :由終濃度20-50mmol/L NaCl和終濃度2-5mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽 酸鹽（Tris-HCl)組成，pH = 7. 0-8.0,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為 80-90 %〇
[0042] 所述RNA吸附柱為硅膠膜RNA吸附柱，購買自北京天恩澤公司，產(chǎn)品編號： 60911-50。
[0043] 所述試劑盒的提取方法，包括糞便的前處理、糞便中微生物細胞的裂解、RNA的游 離與雜蛋白的抽除，RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除，具體步驟如下：
[0044] 1)糞便的前處理：稱取0. 3-0. 5g新鮮糞便于2ml離心管中，加入l-2ml工 作液A振蕩l_2min，3000-5000rpm/min離心10_20min，轉(zhuǎn)移上清至滅菌的離心管中， 10000-12000rpm/min 離心 10_20min，棄上清，保留沉淀；
[0045] 2)糞便中微生物細胞的裂解：在上述沉淀中加入450-600 yl工作液B和 50-60 y 1工作液C，混勻后，37-40°C水浴l-2h，加入65-70 y 1工作液D和65-70 y 1工作液 E，混勻后，37-60°C水浴l_2h ;
[0046] 3) RNA的游離與雜蛋白的抽除：在上述溶液中加入600-800 y 1工作液F，振蕩器震 蕩30_60s后，12000-13000rpm/min離心10_20min，轉(zhuǎn)移一次上清液至滅菌的離心管中，加 入與一次上清液等體積的工作液G，12000-13000rpm/min離心10-20min，將二次上清液移 至滅菌的離心管中；
[0047] 4)RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：加入與二次上清液等體積的工作液H，混合均勻 后，加到RNA吸附柱上，12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，然后加入500-600ul 工作液I，12000-13000rpm/min離心l_2min，倒掉液體，然后加入500-600ul工作液 J，12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，然后再次加入500-600ul工作液J， 12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，將RNA吸附柱吹干后加入50-60ul DEPC水， 12000-13000rpm/min離心l-2min，收集液體，獲得所述動物奠便微生物RNA。
[0048] 實施例1
[0049] 一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，所述試劑盒由吸附柱及以下工作液 組成：
[0050] 工作液A :由終濃度0. 25磷酸二氫鉀和終濃度0. 175氫氧化鈉組成，pH = 7. 2 ;
[0051] 工作液B :由終濃度10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)和終濃度 lmmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA)組成，pH = 8. 0 ;
[0052] 工作液C :質(zhì)量濃度為1 %溶菌酶；
[0053] 工作液D : 20mg/mL蛋白酶K ;
[0054] 工作液E :質(zhì)量濃度10 %的十二烷基硫酸鈉（SDS);
[0055] 工作液F :體積比為酚：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液；
[0056] 工作液G :體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液；
[0057] 工作液H :體積濃度70 %無水乙醇；
[0058] 工作液I :由終濃度5mol/L鹽酸胍和終濃度20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)組成，pH = 6. 6,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為38% ;
[0059] 工作液J :由終濃度20mmol/L NaCl和終濃度2mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)組成，pH = 7. 5,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為85%。
[0060] 所述RNA吸附柱為硅膠膜RNA吸附柱，購買自北京天恩澤公司，產(chǎn)品編號： 60911-50。
[0061] 實施例2
[0062] -種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，所述試劑盒由吸附柱及以下工作液 組成：
[0063] 工作液A :由終濃度0? 37mol/L磷酸二氫鉀和終濃度0? 2mol/L氫氧化鈉組成，pH =8 ；
[0064] 工作液B:由終濃度20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)和終濃度 10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)組成，pH = 5 ;
[0065] 工作液C:質(zhì)量濃度為2 %溶菌酶；
[0066] 工作液D: 10mg/mL蛋白酶K;
[0067] 工作液E :質(zhì)量濃度20 %的十二烷基硫酸鈉（SDS);
[0068] 工作液F :體積比為酚：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液；
[0069] 工作液G :體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液；
[0070] 工作液H :體積濃度80 %無水乙醇；
[0071] 工作液I :由終濃度3mol/L鹽酸胍和終濃度10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)組成，pH = 6. 0,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為30% ;
[0072] 工作液J :由終濃度50mmol/L NaCl和終濃度5mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)組成，pH = 7.0,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為80%。
[0073] 所述RNA吸附柱為硅膠膜RNA吸附柱，購買自北京天恩澤公司，產(chǎn)品編號： 60911-50。
[0074] 實施例3
[0075] -種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，所述試劑盒由吸附柱及以下工作液 組成：
[0076] 工作液A :由終濃度0? 30mol/L磷酸二氫鉀和終濃度0? 18mol/L氫氧化鈉組成，pH =7 ；
[0077] 工作液B :由終濃度15mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)和終濃度 5mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA)組成，pH = 6. 5 ;
[0078] 工作液C:質(zhì)量濃度為1. 5 %溶菌酶；
[0079] 工作液D:15mg/mL蛋白酶K;
[0080] 工作液E :質(zhì)量濃度15 %的十二烷基硫酸鈉（SDS);
[0081] 工作液F :體積比為酚：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液；
[0082] 工作液G :體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液；
[0083] 工作液H :體積濃度70-80 %無水乙醇；
[0084] 工作液I:由終濃度6mol/L鹽酸胍和終濃度30mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)組成，pH= 7. 0,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為40% ;
[0085] 工作液J :由終濃度35mmol/L NaCl和終濃度3. 5mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸 鹽（Tris-HCl)組成，pH = 8. 0,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為90%。
[0086] 所述RNA吸附柱為硅膠膜RNA吸附柱，購買自北京天恩澤公司，產(chǎn)品編號： 60911-50。
[0087] 實施例4
[0088] 利用實施例1的試劑盒，提取動物糞便微生物RNA，具體包括以下步驟：
[0089] 1)糞便的前處理：分別稱取兩管0. 3g狗的新鮮糞便于2ml離心管中，加入1ml工 作液A振蕩lmin，3000rpm/min離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清至滅菌的離心管中，10000rpm/min離 心10min，棄上清，保留沉淀；
[0090] 2)糞便中微生物細胞的裂解：在上述沉淀中加入450 y 1工作液B和50 y 1工作 液C，混勻后，37°C水浴lh，加入65 y 1工作液D和65 y 1工作液E，混勻后，37°C水浴2h ;
[0091] 3)RNA的游離與雜蛋白的抽除：在上述溶液中加入600 yl工作液F，振蕩器震蕩 60s后，13000rpm/min離心lOmin，轉(zhuǎn)移一次上清液至滅菌的離心管中，加入與一次上清液 等體積的工作液G，13000rpm/min離心lOmin，將二次上清液移至滅菌的離心管中；
[0092] 4)RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：加入與二次上清液等體積的工作液H，混合均勻 后，加到RNA吸附柱上，13000rpm/min離心lmin，倒掉液體，然后加入500ul工作液I， 13000rpm/min離心lmin，倒掉液體，然后加入500ul工作液J，13000rpm/min離心lmin，倒 掉液體，然后再次加入500ul工作液J，13000rpm/min離心lmin，倒掉液體，將RNA吸附柱吹 干后加入50ul DEPC水，13000rpm/min離心lmin，收集液體，獲得所述動物奠便微生物RNA。
[0093] 實施例5
[0094] 本發(fā)明的快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，其提取方法包括以下步驟：
[0095] 1)糞便的前處理：稱取0. 5g新鮮糞便于3ml離心管中，加入2ml工作液A振蕩 2min，5000rpm/min離心20min，轉(zhuǎn)移上清至滅菌的離心管中，12000rpm/min離心20min，棄 上清，保留沉淀；
[0096] 2)糞便中微生物細胞的裂解：在上述沉淀中加入600 y 1工作液B和60 y 1工作 液C，混勻后，40°C水浴2h，加入70 y 1工作液D和70 y 1工作液E，混勻后，60°C水浴lh ;
[0097] 3) RNA的游離與雜蛋白的抽除：在上述溶液中加入800 y 1工作液F，振蕩器震蕩 30s后，12000rpm/min離心20min，轉(zhuǎn)移一次上清液至滅菌的離心管中，加入與一次上清液 等體積的工作液G，12000rpm/min離心20min，將二次上清液移至滅菌的離心管中；
[0098] 4)RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：加入與二次上清液等體積的工作液H，混勻后將 樣品加到RNA吸附柱上，12000rpm/min離心2min，倒掉液體，然后加入600ul工作液I， 12000rpm/min離心2min，倒掉液體，然后加入600ul工作液J，12000rpm/min離心2min，倒 掉液體，然后再次加入600ul工作液J，12000rpm/min離心2min，倒掉液體，將RNA吸附柱吹 干后加入60u 1 DEPC水，12000rpm/min離心2min，收集液體，獲得所述動物奠便微生物RNA。
[0099] 利用實施例1的試劑盒，按照實施例4的提取方法提取的動物糞便微生物RNA的 電泳檢測結(jié)果見圖1，其中泳道1，2均是利用本發(fā)明試劑盒提取到的動物糞便微生物RNA 檢測結(jié)果，泳道3為TAKARA DL2000DNA Marker。提取到的動物糞便微生物RNA，其純度用 〇W〇D28tol比值來衡量，濃度和純度見表1。
[0100] 表1狗糞便微生物RNA濃度和純度
[0101]
【權利要求】
1. 一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒由吸附柱及 以下工作液組成： 工作液A :由終濃度0? 25-0. 37mol/L磷酸二氫鉀和終濃度0? 175-0. 2mol/L氫氧化鈉 組成，pH=7-8 ; 工作液B :由終濃度10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和終濃度l-10mmol/L乙二 胺四乙酸組成，pH=5.0-8.0 ; 工作液C :質(zhì)量濃度為1-2%溶菌酶； 工作液D : 10-20mg/mL蛋白酶K ; 工作液E :質(zhì)量濃度10-20%的十二烷基硫酸鈉； 工作液F :體積比為酚：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液； 工作液G :體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液； 工作液H :體積濃度70-80%無水乙醇； 工作液I :由終濃度3-6mol/L鹽酸胍和終濃度10-30mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 組成，pH=6. 0-7. 0,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為30-40% ; 工作液J :由終濃度20-50mmol/L NaCl和終濃度2-5mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 組成，pH=7. 0-8. 0,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為80-90%。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，其特征在于： 所述工作液I由終濃度5mol/L鹽酸胍和終濃度20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽組成， pH=6. 6,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為38%。
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，其特征在于： 所述工作液J由終濃度20mmol/L NaCl和終濃度2mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽組成， pH=7. 5,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為85%。
4. 一種如權利要求1至3之一所述試劑盒的提取方法，其特征在于：其包括以下步驟： 1) 糞便的前處理：稱取糞便于離心管中，每〇. 3-0. 5g糞便加入l-2ml工作液A振蕩 l_2min，3000-5000rpm/min 離心 10_20min，轉(zhuǎn)移上清至滅菌的離心管中，10000-12000rpm/ min離心10-20min，棄上清，保留沉淀； 2) 糞便中微生物細胞的裂解：在上述沉淀中加入450-600 yl工作液B和50-60 yl工 作液C，混勻后，37-40° C水浴l-2h，加入65-70 y 1工作液D和65-70 y 1工作液E，混勻 后，37-60°(：水浴1-211; 3. RNA的游離與雜蛋白的抽除：在上述溶液中加入600-800 y 1工作液F，振蕩器震蕩 30_60s后，12000-13000rpm/min離心10_20min，轉(zhuǎn)移一次上清液至滅菌的離心管中，加入 與一次上清液等體積的工作液G，12000-13000rpm/min離心10-20min，將二次上清液移至 滅菌的離心管中； 4. RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：加入與二次上清液等體積的工作液H，混合均勻后， 加到RNA吸附柱上，12000-13000rpm/min離心l_2min，倒掉液體，然后加入500_600ul 工作液I，12000-13000rpm/min離心l_2min，倒掉液體，然后加入500-600ul工作液 J，12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，然后再次加入500-600ul工作液J， 12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，將RNA吸附柱吹干后加入50-60ul DEPC水， 12000-13000 rpm/min離心l-2min，收集液體，獲得所述動物奠便微生物RNA。
【文檔編號】C12N15/10GK104450685SQ201410837321
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月29日 優(yōu)先權日:2014年12月29日
【發(fā)明者】王清水, 余彥 申請人:福建師范大學
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒及提取方法，該試劑盒主要利用硅膠模吸附柱吸附糞便微生物RNA，再采用特有的去蛋白液和漂洗液洗去蛋白等雜質(zhì)，與常規(guī)的動物糞便糞便微生物RNA提取方法相比，該試劑盒不僅節(jié)省了大量提取時間，同時簡化了實驗步驟，能夠更有效、快速、經(jīng)濟地提取到動物糞便微生物RNA。
【專利說明】一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒及提取方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒 及提取方法。
【背景技術】
[0002] 在腸道微生物的傳統(tǒng)研宄方法中，顯微鏡方法對于菌群計數(shù)非常有價值，該方法 由于所需設備簡單、操作簡便、耗時短，很適宜臨床應用。但該法并不能完全反映腸道菌群 的狀態(tài)，更不能對微生物種類和數(shù)量進行精確定量，且操作過程受主觀因素影響較大，最 重要的一點是不能獲得純培養(yǎng)物，不能對其進行下一步的研宄，有較大局限。
[0003] 隨著分子生物學的迅猛發(fā)展，越來越多的技術被應用到腸道微生物的研宄中來， 其中最主要的兩種分子物質(zhì)，DNA和RNA日益成為腸道微生物研宄的重點。RNA是以DNA的 一條鏈為模板，以堿基互補配對原則，轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈，主要功能是實現(xiàn)遺傳信息在 蛋白質(zhì)上的表達，是遺傳信息傳遞過程中的橋梁，RNA的提取是分子生物學的基礎實驗，對 于cDNA文庫構建、熒光定量PCR、RT-PCR、Northern雜交等下游分子生物學實驗來說，都需 要質(zhì)量好的，完整性高的RNA。Chomczyski和Sacchi第一次提出了用異硫氰酸胍法提取細 胞內(nèi)的RNA，使得RNA的提取過程變得簡便快捷。
[0004] 目前，關于動物糞便微生物RNA提取的報道較少，因為糞便中含有較為復雜的物 質(zhì)，傳統(tǒng)方法提取時間過長，常會造成提取到的糞便微生物RNA降解。因此，研宄一種快速、 便捷的動物糞便微生物RNA提取方法顯得至關重要，這對于我們開展動物糞便微生物RNA 的后續(xù)研宄有著重大的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒及提取方法， 該試劑盒主要利用硅膠模吸附柱吸附柱吸附糞便微生物RNA，再采用特有的去蛋白液（工 作液I)和漂洗液（工作液J)洗去蛋白等雜質(zhì)，利用該試劑盒可以快速提取到動物糞便微 生物RNA。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0007] -種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，所述試劑盒由吸附柱及以下工作液 組成：
[0008] 工作液A :由終濃度0? 25-0. 37mol/L磷酸二氫鉀和終濃度0? 175-0. 2mol/L氫氧 化鈉組成，pH= 7-8 ;
[0009] 工作液B :由終濃度10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)和終濃度 l-10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA)組成，pH = 5. 0-8. 0 ;
[0010] 工作液C :質(zhì)量濃度為1-2%溶菌酶；
[0011] 工作液D:10-20mg/mL蛋白酶K;
[0012] 工作液E :質(zhì)量濃度10-20 %的十二烷基硫酸鈉（SDS);
[0013] 工作液F:體積比為酚：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液；
[0014] 工作液G :體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液；
[0015] 工作液H:體積濃度70-80%無水乙醇；
[0016] 工作液I :由終濃度3-6mol/L鹽酸胍和終濃度10-30mmol/L三羥甲基氨基甲烷 鹽酸鹽（Tris-HCl)組成，pH = 6. 0-7. 0,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為 30-40% ；
[0017] 工作液J :由終濃度20-50mmol/L NaCl和終濃度2-5mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽 酸鹽（Tris-HCl)組成，pH = 7. 0-8.0,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為 80-90 %〇
[0018] 所述RNA吸附柱為硅膠膜RNA吸附柱，購買自北京天恩澤公司，產(chǎn)品編號： 60911-50。
[0019] 本發(fā)明所述終濃度是指溶液在工作液中的終濃度，例如工作液A :由終濃度 0? 25-0. 37mol/L磷酸二氫鉀和終濃度0? 175-0. 2mol/L氫氧化鈉組成，pH = 7-8 ;是指 磷酸二氫鉀在工作液A中的濃度為0. 25-0. 37mol/L，氫氧化鈉在工作液A中的濃度為 0? 175-0. 2mol/L，工作液 A 的 pH = 7-8〇
[0020] 進一步，所述工作液I由終濃度5mol/L鹽酸胍和終濃度20mmol/L三羥甲基氨基 甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)組成，pH = 6. 6,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為 38%〇
[0021] 進一步，所述工作液J由終濃度20mmol/L NaCl和終濃度2mmol/L三羥甲基氨基 甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)組成，pH = 7. 5,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度 為 85%。
[0022] 所述試劑盒的提取方法，包括糞便的前處理、糞便中微生物細胞的裂解、RNA的游 離與雜蛋白的抽除，RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除，具體步驟如下：
[0023] 1)糞便的前處理：稱取0. 3-0. 5g新鮮糞便于2ml離心管中，加入l-2ml工 作液A振蕩l_2min，3000-5000rpm/min離心10_20min，轉(zhuǎn)移上清至滅菌的離心管中， 10000-12000rpm/min 離心 10_20min，棄上清，保留沉淀；
[0024] 2)糞便中微生物細胞的裂解：在上述沉淀中加入450-600 yl工作液B和 50-60 y 1工作液C，混勻后，37-40°C水浴l-2h，加入65-70 y 1工作液D和65-70 y 1工作液 E，混勻后，37-60°C水浴l_2h ;
[0025] 3) RNA的游離與雜蛋白的抽除：在上述溶液中加入600-800 y 1工作液F，振蕩器震 蕩30_60s后，12000-13000rpm/min離心10_20min，轉(zhuǎn)移一次上清液至滅菌的離心管中，加 入與一次上清液等體積的工作液G，12000-13000rpm/min離心10-20min，將二次上清液移 至滅菌的離心管中；
[0026] 4)RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：加入與二次上清液等體積的工作液H，混合均勻 后，加到RNA吸附柱上，12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，然后加入500-600ul 工作液I，12000-13000rpm/min離心l_2min，倒掉液體，然后加入500-600ul工作液 J，12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，然后再次加入500-600ul工作液J， 12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，將RNA吸附柱吹干后加入50-60ul DEPC水， 12000-13000rpm/min離心l-2min，收集液體，獲得所述動物奠便微生物RNA。
[0027] 本發(fā)明采用以上技術方案，所述試劑盒主要利用硅膠模吸附柱吸附糞便微生物 RNA，再采用特有的去蛋白液（工作液I)和漂洗液（工作液J)洗去蛋白等雜質(zhì)，具體步驟 包括糞便的前處理、糞便中微生物細胞的裂解、RNA的游離與雜蛋白的抽除，RNA的吸附以 及雜質(zhì)的去除。常規(guī)的動物糞便糞便微生物RNA提取方法操作時間需要12小時以上，本發(fā) 明試劑盒僅需要4小時即可提取到動物糞便糞便微生物RNA，由于RNA容易被降解，本發(fā)明 減少操作時間可以大大降低動物糞便糞便微生物RNA被降解的風險。本發(fā)明試劑盒不僅節(jié) 省了大量提取時間，同時簡化了實驗步驟，能夠更有效、快速、經(jīng)濟地提取到動物糞便微生 物 RNA〇
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028] 圖1為利用本發(fā)明試劑盒提取的動物糞便微生物RNA的電泳檢測圖：
[0029] 泳道1，2分別是利用本發(fā)明試劑盒提取到的動物糞便微生物RNA檢測結(jié)果；
[0030] 泳道 3 為TAKARADL2000DNAMarker。
【具體實施方式】
[0031] 一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，所述試劑盒由吸附柱及以下工作液 組成：
[0032] 工作液A :由終濃度0? 25-0. 37mol/L磷酸二氫鉀和終濃度0? 175-0. 2mol/L氫氧 化鈉組成，pH = 7-8 ;
[0033] 工作液B :由終濃度10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)和終濃度 l-10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA)組成，pH = 5. 0-8. 0 ;
[0034] 工作液C:質(zhì)量濃度為1-2%溶菌酶；
[0035]工作液D : 10-20mg/mL蛋白酶K ;
[0036] 工作液E:質(zhì)量濃度10-20 %的十二烷基硫酸鈉（SDS);
[0037] 工作液F :體積比為酚：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液；
[0038] 工作液G :體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液；
[0039] 工作液H:體積濃度70-80 %無水乙醇；
[0040] 工作液I :由終濃度3-6mol/L鹽酸胍和終濃度10-30mmol/L三羥甲基氨基甲烷 鹽酸鹽（Tris-HCl)組成，pH = 6. 0-7. 0,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為 30-40% ；
[0041] 工作液J :由終濃度20-50mmol/L NaCl和終濃度2-5mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽 酸鹽（Tris-HCl)組成，pH = 7. 0-8.0,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為 80-90 %〇
[0042] 所述RNA吸附柱為硅膠膜RNA吸附柱，購買自北京天恩澤公司，產(chǎn)品編號： 60911-50。
[0043] 所述試劑盒的提取方法，包括糞便的前處理、糞便中微生物細胞的裂解、RNA的游 離與雜蛋白的抽除，RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除，具體步驟如下：
[0044] 1)糞便的前處理：稱取0. 3-0. 5g新鮮糞便于2ml離心管中，加入l-2ml工 作液A振蕩l_2min，3000-5000rpm/min離心10_20min，轉(zhuǎn)移上清至滅菌的離心管中， 10000-12000rpm/min 離心 10_20min，棄上清，保留沉淀；
[0045] 2)糞便中微生物細胞的裂解：在上述沉淀中加入450-600 yl工作液B和 50-60 y 1工作液C，混勻后，37-40°C水浴l-2h，加入65-70 y 1工作液D和65-70 y 1工作液 E，混勻后，37-60°C水浴l_2h ;
[0046] 3) RNA的游離與雜蛋白的抽除：在上述溶液中加入600-800 y 1工作液F，振蕩器震 蕩30_60s后，12000-13000rpm/min離心10_20min，轉(zhuǎn)移一次上清液至滅菌的離心管中，加 入與一次上清液等體積的工作液G，12000-13000rpm/min離心10-20min，將二次上清液移 至滅菌的離心管中；
[0047] 4)RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：加入與二次上清液等體積的工作液H，混合均勻 后，加到RNA吸附柱上，12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，然后加入500-600ul 工作液I，12000-13000rpm/min離心l_2min，倒掉液體，然后加入500-600ul工作液 J，12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，然后再次加入500-600ul工作液J， 12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，將RNA吸附柱吹干后加入50-60ul DEPC水， 12000-13000rpm/min離心l-2min，收集液體，獲得所述動物奠便微生物RNA。
[0048] 實施例1
[0049] 一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，所述試劑盒由吸附柱及以下工作液 組成：
[0050] 工作液A :由終濃度0. 25磷酸二氫鉀和終濃度0. 175氫氧化鈉組成，pH = 7. 2 ;
[0051] 工作液B :由終濃度10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)和終濃度 lmmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA)組成，pH = 8. 0 ;
[0052] 工作液C :質(zhì)量濃度為1 %溶菌酶；
[0053] 工作液D : 20mg/mL蛋白酶K ;
[0054] 工作液E :質(zhì)量濃度10 %的十二烷基硫酸鈉（SDS);
[0055] 工作液F :體積比為酚：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液；
[0056] 工作液G :體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液；
[0057] 工作液H :體積濃度70 %無水乙醇；
[0058] 工作液I :由終濃度5mol/L鹽酸胍和終濃度20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)組成，pH = 6. 6,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為38% ;
[0059] 工作液J :由終濃度20mmol/L NaCl和終濃度2mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)組成，pH = 7. 5,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為85%。
[0060] 所述RNA吸附柱為硅膠膜RNA吸附柱，購買自北京天恩澤公司，產(chǎn)品編號： 60911-50。
[0061] 實施例2
[0062] -種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，所述試劑盒由吸附柱及以下工作液 組成：
[0063] 工作液A :由終濃度0? 37mol/L磷酸二氫鉀和終濃度0? 2mol/L氫氧化鈉組成，pH =8 ；
[0064] 工作液B:由終濃度20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)和終濃度 10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA)組成，pH = 5 ;
[0065] 工作液C:質(zhì)量濃度為2 %溶菌酶；
[0066] 工作液D: 10mg/mL蛋白酶K;
[0067] 工作液E :質(zhì)量濃度20 %的十二烷基硫酸鈉（SDS);
[0068] 工作液F :體積比為酚：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液；
[0069] 工作液G :體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液；
[0070] 工作液H :體積濃度80 %無水乙醇；
[0071] 工作液I :由終濃度3mol/L鹽酸胍和終濃度10mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)組成，pH = 6. 0,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為30% ;
[0072] 工作液J :由終濃度50mmol/L NaCl和終濃度5mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)組成，pH = 7.0,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為80%。
[0073] 所述RNA吸附柱為硅膠膜RNA吸附柱，購買自北京天恩澤公司，產(chǎn)品編號： 60911-50。
[0074] 實施例3
[0075] -種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，所述試劑盒由吸附柱及以下工作液 組成：
[0076] 工作液A :由終濃度0? 30mol/L磷酸二氫鉀和終濃度0? 18mol/L氫氧化鈉組成，pH =7 ；
[0077] 工作液B :由終濃度15mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl)和終濃度 5mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA)組成，pH = 6. 5 ;
[0078] 工作液C:質(zhì)量濃度為1. 5 %溶菌酶；
[0079] 工作液D:15mg/mL蛋白酶K;
[0080] 工作液E :質(zhì)量濃度15 %的十二烷基硫酸鈉（SDS);
[0081] 工作液F :體積比為酚：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液；
[0082] 工作液G :體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液；
[0083] 工作液H :體積濃度70-80 %無水乙醇；
[0084] 工作液I:由終濃度6mol/L鹽酸胍和終濃度30mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)組成，pH= 7. 0,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為40% ;
[0085] 工作液J :由終濃度35mmol/L NaCl和終濃度3. 5mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸 鹽（Tris-HCl)組成，pH = 8. 0,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為90%。
[0086] 所述RNA吸附柱為硅膠膜RNA吸附柱，購買自北京天恩澤公司，產(chǎn)品編號： 60911-50。
[0087] 實施例4
[0088] 利用實施例1的試劑盒，提取動物糞便微生物RNA，具體包括以下步驟：
[0089] 1)糞便的前處理：分別稱取兩管0. 3g狗的新鮮糞便于2ml離心管中，加入1ml工 作液A振蕩lmin，3000rpm/min離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清至滅菌的離心管中，10000rpm/min離 心10min，棄上清，保留沉淀；
[0090] 2)糞便中微生物細胞的裂解：在上述沉淀中加入450 y 1工作液B和50 y 1工作 液C，混勻后，37°C水浴lh，加入65 y 1工作液D和65 y 1工作液E，混勻后，37°C水浴2h ;
[0091] 3)RNA的游離與雜蛋白的抽除：在上述溶液中加入600 yl工作液F，振蕩器震蕩 60s后，13000rpm/min離心lOmin，轉(zhuǎn)移一次上清液至滅菌的離心管中，加入與一次上清液 等體積的工作液G，13000rpm/min離心lOmin，將二次上清液移至滅菌的離心管中；
[0092] 4)RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：加入與二次上清液等體積的工作液H，混合均勻 后，加到RNA吸附柱上，13000rpm/min離心lmin，倒掉液體，然后加入500ul工作液I， 13000rpm/min離心lmin，倒掉液體，然后加入500ul工作液J，13000rpm/min離心lmin，倒 掉液體，然后再次加入500ul工作液J，13000rpm/min離心lmin，倒掉液體，將RNA吸附柱吹 干后加入50ul DEPC水，13000rpm/min離心lmin，收集液體，獲得所述動物奠便微生物RNA。
[0093] 實施例5
[0094] 本發(fā)明的快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，其提取方法包括以下步驟：
[0095] 1)糞便的前處理：稱取0. 5g新鮮糞便于3ml離心管中，加入2ml工作液A振蕩 2min，5000rpm/min離心20min，轉(zhuǎn)移上清至滅菌的離心管中，12000rpm/min離心20min，棄 上清，保留沉淀；
[0096] 2)糞便中微生物細胞的裂解：在上述沉淀中加入600 y 1工作液B和60 y 1工作 液C，混勻后，40°C水浴2h，加入70 y 1工作液D和70 y 1工作液E，混勻后，60°C水浴lh ;
[0097] 3) RNA的游離與雜蛋白的抽除：在上述溶液中加入800 y 1工作液F，振蕩器震蕩 30s后，12000rpm/min離心20min，轉(zhuǎn)移一次上清液至滅菌的離心管中，加入與一次上清液 等體積的工作液G，12000rpm/min離心20min，將二次上清液移至滅菌的離心管中；
[0098] 4)RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：加入與二次上清液等體積的工作液H，混勻后將 樣品加到RNA吸附柱上，12000rpm/min離心2min，倒掉液體，然后加入600ul工作液I， 12000rpm/min離心2min，倒掉液體，然后加入600ul工作液J，12000rpm/min離心2min，倒 掉液體，然后再次加入600ul工作液J，12000rpm/min離心2min，倒掉液體，將RNA吸附柱吹 干后加入60u 1 DEPC水，12000rpm/min離心2min，收集液體，獲得所述動物奠便微生物RNA。
[0099] 利用實施例1的試劑盒，按照實施例4的提取方法提取的動物糞便微生物RNA的 電泳檢測結(jié)果見圖1，其中泳道1，2均是利用本發(fā)明試劑盒提取到的動物糞便微生物RNA 檢測結(jié)果，泳道3為TAKARA DL2000DNA Marker。提取到的動物糞便微生物RNA，其純度用 〇W〇D28tol比值來衡量，濃度和純度見表1。
[0100] 表1狗糞便微生物RNA濃度和純度
[0101]
【權利要求】
1. 一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒由吸附柱及 以下工作液組成： 工作液A :由終濃度0? 25-0. 37mol/L磷酸二氫鉀和終濃度0? 175-0. 2mol/L氫氧化鈉 組成，pH=7-8 ; 工作液B :由終濃度10-20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和終濃度l-10mmol/L乙二 胺四乙酸組成，pH=5.0-8.0 ; 工作液C :質(zhì)量濃度為1-2%溶菌酶； 工作液D : 10-20mg/mL蛋白酶K ; 工作液E :質(zhì)量濃度10-20%的十二烷基硫酸鈉； 工作液F :體積比為酚：氯仿：異戊醇=25:24:1的混合液； 工作液G :體積比為氯仿：異戊醇=24:1的混合液； 工作液H :體積濃度70-80%無水乙醇； 工作液I :由終濃度3-6mol/L鹽酸胍和終濃度10-30mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 組成，pH=6. 0-7. 0,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為30-40% ; 工作液J :由終濃度20-50mmol/L NaCl和終濃度2-5mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 組成，pH=7. 0-8. 0,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為80-90%。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，其特征在于： 所述工作液I由終濃度5mol/L鹽酸胍和終濃度20mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽組成， pH=6. 6,使用前加乙醇，使得工作液I中乙醇體積濃度為38%。
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種快速提取動物糞便微生物RNA的試劑盒，其特征在于： 所述工作液J由終濃度20mmol/L NaCl和終濃度2mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽組成， pH=7. 5,調(diào)完pH后加入乙醇，使得工作液J中的乙醇濃度為85%。
4. 一種如權利要求1至3之一所述試劑盒的提取方法，其特征在于：其包括以下步驟： 1) 糞便的前處理：稱取糞便于離心管中，每〇. 3-0. 5g糞便加入l-2ml工作液A振蕩 l_2min，3000-5000rpm/min 離心 10_20min，轉(zhuǎn)移上清至滅菌的離心管中，10000-12000rpm/ min離心10-20min，棄上清，保留沉淀； 2) 糞便中微生物細胞的裂解：在上述沉淀中加入450-600 yl工作液B和50-60 yl工 作液C，混勻后，37-40° C水浴l-2h，加入65-70 y 1工作液D和65-70 y 1工作液E，混勻 后，37-60°(：水浴1-211; 3. RNA的游離與雜蛋白的抽除：在上述溶液中加入600-800 y 1工作液F，振蕩器震蕩 30_60s后，12000-13000rpm/min離心10_20min，轉(zhuǎn)移一次上清液至滅菌的離心管中，加入 與一次上清液等體積的工作液G，12000-13000rpm/min離心10-20min，將二次上清液移至 滅菌的離心管中； 4. RNA的吸附以及雜質(zhì)的去除：加入與二次上清液等體積的工作液H，混合均勻后， 加到RNA吸附柱上，12000-13000rpm/min離心l_2min，倒掉液體，然后加入500_600ul 工作液I，12000-13000rpm/min離心l_2min，倒掉液體，然后加入500-600ul工作液 J，12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，然后再次加入500-600ul工作液J， 12000-13000rpm/min離心l-2min，倒掉液體，將RNA吸附柱吹干后加入50-60ul DEPC水， 12000-13000 rpm/min離心l-2min，收集液體，獲得所述動物奠便微生物RNA。
【文檔編號】C12N15/10GK104450685SQ201410837321
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月29日 優(yōu)先權日:2014年12月29日
【發(fā)明者】王清水, 余彥 申請人:福建師范大學
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0180182... 來自[江蘇省常州市電信] 2018年12月05日 16:14我們用的biog糞便RNA提取試劑盒，比進口的便宜，安全無毒，效果也不錯。操作簡便快速，糞便預處理后，可在15分鐘內(nèi)完成。提取RNA純度高，無抑制劑
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