一種釀酒酵母菌的馴化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種釀酒酵母菌的馴化方法為：釀酒酵母菌活化；將所述活化后的釀酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中進行培養(yǎng)，得到小酒母；所述玉米糖化醪和酶解糖液的質(zhì)量比為(80～90)：(10～20)；將所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中進行多代擴大培養(yǎng)，得到大酒母；在第一代擴大培養(yǎng)中，玉米糖化醪和酶解糖液的質(zhì)量比為(60～70)：(30～40)；以后每一代擴大培養(yǎng)中，逐漸增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液質(zhì)量大于70％。本發(fā)明馴化后的酵母菌適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境，可以代謝五碳糖和六碳糖，不用經(jīng)過脫毒即可直接進行乙醇發(fā)酵，而且保持較高的乙醇生產(chǎn)能力，降低了生產(chǎn)纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種釀酒酵母菌的馴化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及釀酒酵母菌的馴化方法。

【背景技術(shù)】
[0002]纖維素乙醇是指以纖維素生物質(zhì)為原料生產(chǎn)的乙醇。纖維素生物質(zhì)是由纖維素(30-50% )，半纖維素(20-40% )，和木質(zhì)素(15-30% )組成的復(fù)雜材料，其可以為農(nóng)作物秸桿、林業(yè)加工廢料、甘蔗渣等廢棄物。
[0003]纖維素乙醇的生產(chǎn)方法為:以纖維素生物質(zhì)為原料，通過纖維素酶使其中的纖維素水解為單糖，再通過釀酒酵母菌使所生成的單糖發(fā)酵生產(chǎn)出含有乙醇的成熟醪液，對醪液進行精餾、脫水就可以得到乙醇。其中，采用的釀酒酵母菌屬于酵母菌科，單細胞，卵圓形或球形。雖然釀酒酵母菌形態(tài)簡單，但是其生理卻比較復(fù)雜。在纖維素乙醇的生產(chǎn)中，釀酒酵母菌將葡萄糖、果糖、甘露糖等單糖吸入細胞內(nèi)，在無氧條件下，經(jīng)過內(nèi)酶的作用，將單糖分解為二氧化碳和酒精。
[0004]纖維質(zhì)生物質(zhì)中的糖以纖維素和半纖維素的形式存在。纖維素中的六碳糖和和玉米淀粉中含有的葡萄糖一樣，可以用傳統(tǒng)的酵母發(fā)酵成乙醇。而半纖維素中含有的糖主要為五碳糖，傳統(tǒng)的酵母無法經(jīng)濟地將其轉(zhuǎn)化為乙醇。而且，在將纖維素生物質(zhì)水解為單糖的過程中，會產(chǎn)生大量的弱酸、糠醛、5-羥甲基糖醛及芳香族化合物，這些物質(zhì)會抑制酵母菌種在處理后的酶解液中的生長和發(fā)酵，導(dǎo)致生產(chǎn)乙醇的能力下降。
[0005]因此馴化酵母菌株，對秸桿等纖維素生物質(zhì)的水解產(chǎn)物進行發(fā)酵，高效代謝五碳糖和六碳糖，對降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本，進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)具有重大意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種釀酒酵母菌的馴化方法，馴化得到的菌株可以有效利用發(fā)酵糖液中的五碳糖，生產(chǎn)乙醇的能力強。
[0007]本發(fā)明公開了一種釀酒酵母菌的馴化方法，包括以下步驟:
[0008](A)釀酒酵母菌活化；
[0009](B)將所述活化后的釀酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中進行培養(yǎng)，得到小酒母；所述玉米糖化醪和酶解糖液的質(zhì)量比為(80?90): (10?20)；
[0010](C)將所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中進行多代擴大培養(yǎng)，得到大酒母；在第一代擴大培養(yǎng)中，玉米糖化醪和酶解糖液的質(zhì)量比為￠0?70):(30?40)；以后每一代擴大培養(yǎng)中，逐漸增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液質(zhì)量大于70% ；
[0011]所述酶解糖液的制備方法為:
[0012]將農(nóng)作物秸桿進行汽爆預(yù)處理，然后添加纖維素酶進行酶解，得到酶解糖液；
[0013]所述汽爆預(yù)處理的蒸汽壓力為1.2?1.8MPa，汽爆預(yù)處理的時間為8?15分鐘。
[0014]優(yōu)選的，所述釀酒酵母菌為安琪釀酒干酵母。
[0015]優(yōu)選的，所述步驟(A)具體為:
[0016]將釀酒酵母菌液體培養(yǎng)基中進行活化，所述活化的溫度為35?40°C，活化時間為0.5?1.5小時。
[0017]優(yōu)選的，所述步驟(B)中，所述培養(yǎng)溫度25?35°C。
[0018]優(yōu)選的，所述步驟⑶中，所述培養(yǎng)時間為8?12小時。
[0019]優(yōu)選的，所述步驟⑶中，所述培養(yǎng)的PH值為4.0?5.0。
[0020]優(yōu)選的，所述步驟(C)中，所述玉米糖化醪的制備方法為:
[0021]將玉米粉在液化酶作用下于90?10(TC，液化90?120分鐘；然后加入糖化酶，50?60°C反應(yīng)30?40分鐘，得到玉米糖化醪。
[0022]優(yōu)選的，所述混合物中還包括:0.075%的磷酸二銨，0.075%的尿素和0.05%的硫酸鎂。
[0023]優(yōu)選的，所述步驟(C)中，所述擴大培養(yǎng)為2?10代。
[0024]優(yōu)選的，所述纖維素酶的添加量為預(yù)處理產(chǎn)物絕干質(zhì)量的I?1.5%。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用經(jīng)汽爆預(yù)處理及酶解得到的酶解糖液作為底物之一，逐漸增加其在培養(yǎng)中的比例，使普通釀酒酵母菌逐漸適應(yīng)所述酶解糖液的環(huán)境，加快對所述酶解糖液的代謝速度。所述酶解糖液中的組分復(fù)雜，含有五碳糖、六碳糖及抑制劑等物質(zhì)，因此用該酶解糖液馴化后的酵母菌適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境，可以代謝五碳糖和六碳糖，不用經(jīng)過脫毒即可直接進行乙醇發(fā)酵，而且保持較高的乙醇生產(chǎn)能力，降低了生產(chǎn)纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。

【具體實施方式】
[0026]為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。
[0027]本發(fā)明實施例公開了一種釀酒酵母菌的馴化方法，包括以下步驟:
[0028](A)釀酒酵母菌活化；
[0029](B)將所述活化后的釀酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中進行培養(yǎng)，得到小酒母；所述玉米糖化醪和酶解糖液的質(zhì)量比為(80?90): (10?20)；
[0030](C)將所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中進行多代擴大培養(yǎng)，得到大酒母；在第一代擴大培養(yǎng)中，玉米糖化醪和酶解糖液的質(zhì)量比為￠0?70):(30?40)；以后每一代擴大培養(yǎng)中，逐漸增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液質(zhì)量大于70% ；
[0031]所述酶解糖液的制備方法為:
[0032]將農(nóng)作物秸桿進行汽爆預(yù)處理，然后添加纖維素酶進行酶解，得到酶解糖液；
[0033]所述汽爆預(yù)處理的蒸汽壓力為1.2?1.8MPa，汽爆預(yù)處理的時間為8?15分鐘。
[0034]本發(fā)明利用組份復(fù)雜的酶解糖液培養(yǎng)釀酒酵母菌，增加酵母菌對于五碳糖和六碳糖的代謝能力，不用經(jīng)過脫毒即可直接進行乙醇發(fā)酵，而且保持較高的乙醇生產(chǎn)能力，降低了生產(chǎn)纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。
[0035]按照本發(fā)明，首先對釀酒酵母菌進行活化。所述釀酒酵母菌優(yōu)選為安琪釀酒干酵母。所述活化的方法優(yōu)選為:將釀酒酵母菌液體培養(yǎng)基中進行活化，所述活化的溫度為35?40°C，活化時間為0.5?1.5小時。本發(fā)明對于液體培養(yǎng)基的組成沒有特殊限制，選用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的活化培養(yǎng)基即可。
[0036]得到活化后的菌種后，將所述活化后的釀酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中進行培養(yǎng)，得到小酒母。所述玉米糖化醪制備方法優(yōu)選為:
[0037]將玉米粉在液化酶作用下于90?100°C，液化90?120分鐘；然后加入糖化酶，50?60°C反應(yīng)30?40分鐘，得到玉米糖化醪。
[0038]所述酶解糖液的制備方法為:
[0039]將農(nóng)作物秸桿進行汽爆預(yù)處理，然后添加纖維素酶進行酶解，得到酶解糖液；
[0040]所述汽爆預(yù)處理的蒸汽壓力為1.2?1.8MPa，汽爆預(yù)處理的時間為8?15分鐘。
[0041]在所述制備酶解糖液的過程中，所述纖維素酶的添加量優(yōu)選為預(yù)處理產(chǎn)物絕干質(zhì)量的I?1.5%，更優(yōu)選為1.2%?1.3%。所述酶解時的PH值優(yōu)選為4.0?5.0，更優(yōu)選為 4.3 ?4.8。
[0042]按照本發(fā)明，培養(yǎng)小酒母的過程中，所述玉米糖化醪和酶解糖液的質(zhì)量比為(80?90):(10?20)，優(yōu)選為90:10，85:15或88:12。所述混合物中，優(yōu)選的還可以加入營養(yǎng)鹽，如0.075%的磷酸二銨，0.075%的尿素和0.05%的硫酸鎂。所述培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為25?35°C，更優(yōu)選為28?32°C。所述培養(yǎng)時間優(yōu)選為8?12小時，更優(yōu)選為9?10小時。所述培養(yǎng)的PH值優(yōu)選為4.0?5.0,更優(yōu)選為4.3?4.8。
[0043]按照本發(fā)明，得到所述小酒母后，將所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中進行多代擴大培養(yǎng)，得到大酒母。所述混合物中，優(yōu)選的還可以加入營養(yǎng)鹽，如0.075%的磷酸二銨，0.075%的尿素和0.05%的硫酸鎂。所述多代指兩代及兩代以上。在擴大培養(yǎng)中使用的酶解糖液與所述培養(yǎng)小酒母過程中使用的酶解糖液相同。在第一代擴大培養(yǎng)中，玉米糖化醪和酶解糖液的質(zhì)量比為(60?70): (30?40)，優(yōu)選為70:30 ;然后在以后每一代擴大培養(yǎng)中，逐漸增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液質(zhì)量大于70%。本發(fā)明對每一代擴大培養(yǎng)中，酶解糖液的增加量沒有特殊限制，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的經(jīng)驗適當(dāng)調(diào)節(jié)。優(yōu)選的，每一代擴大培養(yǎng)中，酶解糖液的增加量為玉米糖化醪和酶解糖液重質(zhì)量的10%，直至所述混合物中的酶解糖液質(zhì)量為85%?95%。所述擴大培養(yǎng)的代數(shù)優(yōu)選為2?10代。所述擴大培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為25?35°C，更優(yōu)選為28?32°C。所述擴大培養(yǎng)時間優(yōu)選為8?12小時，更優(yōu)選為9?10小時。所述擴大培養(yǎng)的PH值優(yōu)選為4.0?5.0，更優(yōu)選為4.3?4.8。
[0044]為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的釀酒酵母菌的馴化方法進行說明，本發(fā)明的保護范圍不受以下實施例的限制。
[0045]將玉米粉在液化酶作用下于90°C，液化100分鐘；然后加入糖化酶，60°C反應(yīng)35分鐘，得到玉米糖化醪。以下實施例均采用所述的玉米糖化醪。
[0046]實施例1
[0047]配置活化培養(yǎng)基:將2%葡萄糖20ml，0.375克磷酸二銨，0.375克尿素，0.25克硫酸鎂混合，加水至500ml。
[0048]制備酶解糖液:將I噸農(nóng)作物秸桿在1.5MPa，190°C下汽相蒸煮8分鐘，迅速減壓，得到汽爆預(yù)處理產(chǎn)物；然后按照所述預(yù)處理產(chǎn)物絕干質(zhì)量的1.2%添加纖維素酶，在常壓，45°C，PH4.8條件下進行酶解，得到酶解糖液。
[0049]在所述活化培養(yǎng)基中添加干酵母0.5g，搖勻后置38°C水浴鍋活化I小時。
[0050]將20克所述活化的酵母加入到90ml玉米糖化醪和1ml酶解糖液中，置于30°C水浴鍋中，通風(fēng)培養(yǎng)10小時，得到小酒母。
[0051]將150ml成熟的小酒母加入到240ml玉米糖化醪和160ml酶解糖液的混合物中，調(diào)整PH為4.5，置于30°C水浴鍋中，通風(fēng)培養(yǎng)8小時，得到第一代大酒母；
[0052]將150ml第一代大酒母加入到120ml玉米糖化醪和280ml酶解糖液的混合物中，調(diào)整PH為4.5，置于30°C水浴鍋中，通風(fēng)培養(yǎng)8小時，得到第二代大酒母。所述第二代大酒母即可用于發(fā)酵。
[0053]采用所述第三代大酒母進行發(fā)酵:用100ml三角瓶添加475g酶解糖液，PH4.8，按5%的接種量，即25g成熟第二代大酒母接入，置培養(yǎng)箱厭氧發(fā)酵> 50小時。在50小時后，葡萄糖全部被代謝，乙醇濃度為62.0g/L，乙醇產(chǎn)率為0.48g/g，達到理論值得92%。五碳糖代謝60%，乙醇濃度0.71g/L，乙醇產(chǎn)率為0.05g/g。
[0054]在相同條件下，用100ml三角瓶添加475g酶解糖液，PH4.8，按5%的接種量，即25g活化后的釀酒酵母接入，置培養(yǎng)箱厭氧發(fā)酵72小時。五碳糖代謝40%，乙醇產(chǎn)率只有0.36g/g，糖占理論產(chǎn)率的70.1%。
[0055]實施例2
[0056]配置活化培養(yǎng)基:將2%葡萄糖20ml，0.375克磷酸二銨，0.375克尿素，0.25克硫酸鎂混合，加水至500ml。
[0057]制備酶解糖液:將I噸農(nóng)作物秸桿在1.5MPa，190°C下汽相蒸煮8分鐘，迅速減壓，得到汽爆預(yù)處理產(chǎn)物；然后按照所述預(yù)處理產(chǎn)物絕干質(zhì)量的1.2%添加纖維素酶，在常壓，45°C，PH4.8條件下進行酶解，得到酶解糖液。
[0058]在所述活化培養(yǎng)基中添加安琪釀酒干酵母0.5g，搖勻后置36°C水浴鍋活化1.2小時。
[0059]將20克所述活化的酵母加入到85ml玉米糖化醪和15ml酶解糖液中，調(diào)整PH為4.5，置于28°C水浴鍋中，通風(fēng)培養(yǎng)12小時，得到小酒母。
[0060]將150ml成熟的小酒母加入到280ml玉米糖化醪和120ml酶解糖液的混合物中，調(diào)整PH為4.5，置于30°C水浴鍋中，通風(fēng)培養(yǎng)8小時，得到第一代大酒母；
[0061]將150ml第一代大酒母加入到200ml玉米糖化醪和200ml酶解糖液的混合物中，調(diào)整PH為4.5，置于30°C水浴鍋中，通風(fēng)培養(yǎng)8小時，得到第二代大酒母；
[0062]將150ml第二代大酒母加入到120ml玉米糖化醪和280ml酶解糖液的混合物中，調(diào)整PH為4.5，置于30°C水浴鍋中，通風(fēng)培養(yǎng)8小時，得到第三代大酒母；所述第三代大酒母即可用于發(fā)酵。
[0063]實施例3
[0064]配置活化培養(yǎng)基:將2%葡萄糖20ml，0.375克磷酸二銨，0.375克尿素，0.25克硫酸鎂混合，加水至500ml。
[0065]制備酶解糖液:將I噸農(nóng)作物秸桿在1.5MPa，190°C下汽相蒸煮8分鐘，迅速減壓，得到汽爆預(yù)處理產(chǎn)物；然后按照所述預(yù)處理產(chǎn)物絕干質(zhì)量的1.2%添加纖維素酶，在常壓，45°C，PH4.8條件下進行酶解，得到酶解糖液。
[0066]在所述活化培養(yǎng)基中添加干酵母0.5g，搖勻后置38°C水浴鍋活化I小時。
[0067]將20克所述活化的酵母加入到90ml玉米糖化醪和1ml酶解糖液中，置于30°C水浴鍋中，通風(fēng)培養(yǎng)10小時，得到小酒母。
[0068]將150ml成熟的小酒母加入到240ml玉米糖化醪和160ml酶解糖液的混合物中，調(diào)整PH為4.2，置于28°C水浴鍋中，通風(fēng)培養(yǎng)8小時，得到第一代大酒母；
[0069]將150ml第一代大酒母加入到80ml玉米糖化醪和320ml酶解糖液的混合物中，調(diào)整PH為4.2，置于28°C水浴鍋中，通風(fēng)培養(yǎng)8小時，得到第二代大酒母。
[0070]將150ml第二代大酒母加入到400ml酶解糖液的混合物中，調(diào)整PH為4.2，置于28°C水浴鍋中，通風(fēng)培養(yǎng)8小時，得到第三代大酒母；所述第三代大酒母即可用于發(fā)酵。
[0071]第三代大酒母的顯微結(jié)構(gòu):細胞數(shù)彡3.0億/ml，出芽率彡15%，無死亡，個體較大且飽滿。
[0072]采用所述第三代大酒母進行發(fā)酵:用100ml三角瓶添加475g酶解糖液，PH4.8，按5%的接種量，即25g成熟第三代大酒母接入，置培養(yǎng)箱厭氧發(fā)酵> 50小時。在50小時后，葡萄糖全部被代謝，乙醇濃度為62.lg/L，乙醇產(chǎn)率為0.46g/g，達到理論值得90%。五碳糖代謝60%，乙醇濃度0.71g/L，乙醇產(chǎn)率為0.05g/g。
[0073]在相同條件下，用100ml三角瓶添加475g酶解糖液，PH4.8，按5%的接種量，即25g活化后的釀酒酵母接入，置培養(yǎng)箱厭氧發(fā)酵72小時。五碳糖代謝40%，乙醇產(chǎn)率只有0.36g/g，糖占理論產(chǎn)率的70.1%。
[0074]說明未經(jīng)馴化的酵母菌對組分復(fù)雜的酶解糖液的耐受能力較差。以上數(shù)據(jù)證明，馴化后酵母菌種的酶解糖液耐受能力、五碳糖代謝能力和乙醇產(chǎn)率均有明顯提高，馴化后可有效降低細胞質(zhì)膜上ATP合成酶對H+膜兩側(cè)梯度變化的敏感性，這保證了酵母細胞內(nèi)氧化磷酸化仍能正常使用，使得糖酵解過程順利進行，提高了細胞的耐受能力。
[0075]以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
[0076]對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種釀酒酵母菌的馴化方法，包括以下步驟: (A)釀酒酵母菌活化； (B)將所述活化后的釀酒酵母菌在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中進行培養(yǎng)，得到小酒母；所述玉米糖化醪和酶解糖液的質(zhì)量比為(80?90): (10?20)； (C)將所述小酒母在玉米糖化醪和酶解糖液的混合物中進行多代擴大培養(yǎng)，得到大酒母；在第一代擴大培養(yǎng)中，玉米糖化醪和酶解糖液的質(zhì)量比為(60?70):(30?40);以后每一代擴大培養(yǎng)中，逐漸增加酶解糖液比例，直至所述混合物中的酶解糖液質(zhì)量大于70% ； 所述酶解糖液的制備方法為: 將農(nóng)作物秸桿進行汽爆預(yù)處理，然后添加纖維素酶進行酶解，得到酶解糖液； 所述汽爆預(yù)處理的蒸汽壓力為1.2?1.8MPa，汽爆預(yù)處理的時間為8?15分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馴化方法，其特征在于，所述釀酒酵母菌為安琪釀酒干酵母。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的馴化方法，其特征在于，所述步驟(A)具體為: 將釀酒酵母菌液體培養(yǎng)基中進行活化，所述活化的溫度為35?40°C，活化時間為0.5?1.5小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馴化方法，其特征在于，所述步驟(B)中，所述培養(yǎng)溫度25?35。。。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馴化方法，其特征在于，所述步驟(B)中，所述培養(yǎng)時間為8?12小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馴化方法，其特征在于，所述步驟(B)中，所述培養(yǎng)的PH值為4.0 ?5.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馴化方法，其特征在于，所述步驟(C)中，所述玉米糖化醪的制備方法為: 將玉米粉在液化酶作用下于90?100°C，液化90?120分鐘；然后加入糖化酶，50?60°C反應(yīng)30?40分鐘，得到玉米糖化醪。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馴化方法，其特征在于，所述混合物中還包括:0.075%的磷酸二銨，0.075%的尿素和0.05%的硫酸鎂。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馴化方法，其特征在于，所述步驟(C)中，所述擴大培養(yǎng)為2?10代。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馴化方法，其特征在于，所述纖維素酶的添加量為預(yù)處理產(chǎn)物絕干質(zhì)量的I?1.5%。
【文檔編號】C12N1/18GK104450598SQ201410843473
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】生曉東, 劉玉金, 肖偉良, 李學(xué)業(yè) 申請人:松原光禾能源有限公司