豬肉質(zhì)性狀相關(guān)wnt10b基因分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于家畜分子分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及豬肉質(zhì)性狀相關(guān)WNT10B基因分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用。本發(fā)明所述的分子標(biāo)記由豬WNT10B基因克隆得到，其WNT10B分子標(biāo)記的序列如SEQ ID NO：1所示。WNT10B基因的多態(tài)性是利用比較基因組學(xué)方法根據(jù)人的WNT10B基因序列設(shè)計(jì)引物，以豬的基因組DNA為模板擴(kuò)增，擴(kuò)增片段利用測序篩選SNP，并利用PCR－RFLP進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)第552bp處有一個(gè)A/G的堿基突變，導(dǎo)致PCR-RFLP-Sal I多態(tài)性，為豬肉質(zhì)性狀標(biāo)記輔助選擇提供了新的分子標(biāo)記，可利用該標(biāo)記檢測中外豬種的情況。
【專利說明】豬肉質(zhì)性狀相關(guān)WNT10B基因分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家畜分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種包含如SEQ ID N0 :1所示豬肉質(zhì) 性狀相關(guān)基因核苷酸的核酸分子。本發(fā)明還涉及如SEQ ID N0 :1所示的WNT0B基因的分子 克隆方法及多核苷酸序列中的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)以及其在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬肉是我國13億人口餐桌上最主要的肉類，2009年我國出欄生豬數(shù)6. 45億頭，居 全球第一。國外品種豬的生長速度已達(dá)很高水平，但肉質(zhì)不良也是不爭的事實(shí)，豬肉質(zhì)問題 日益受到廣泛關(guān)注，在諸多影響因素中，肌內(nèi)脂肪含量（Intramuscular Fat Content, IMF) 是重要的影響因素，頂F是評價(jià)豬肉質(zhì)好壞的主要指標(biāo)，能影響豬肉的嫩度、風(fēng)味、大理石 紋、多汁性等，豬肌內(nèi)脂肪含量的遺傳力約為0. 6,在一定范圍內(nèi)，IMF越高，肉質(zhì)越好，地方 品種豬肌內(nèi)脂肪含量要遠(yuǎn)高于外來豬種，因而肉質(zhì)優(yōu)良。
[0003] WntlOb基因是經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成員，WntlOb是經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中 的信號蛋白。Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌與位于細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合，激活胞內(nèi)的各級 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，調(diào)節(jié)脂肪沉積。但是，畜禽中特別是豬中有關(guān)WntlOb基因介導(dǎo)的Wnt信號 轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究極少，與當(dāng)今基因功能基因組時(shí)代生物科學(xué)的飛速發(fā)展極不相稱。
[0004] Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一項(xiàng)重要功能是調(diào)控脂肪沉積，因此深入研究豬中WntlOb基 因的生物學(xué)功能及其應(yīng)用，從分子、細(xì)胞和組織水平研究對肌內(nèi)脂肪沉積調(diào)控機(jī)理，發(fā)掘和 開發(fā)新的遺傳標(biāo)記，對于改善肉質(zhì)，加速學(xué)科發(fā)展具有重要意義。WntlOb基因介導(dǎo)的信號途 徑的研究是豬功能基因組學(xué)學(xué)科發(fā)展和肉質(zhì)改良亟待解決的問題之一。
[0005]Wnt基因是同源基因wingless和int-1的合稱，Sharma等1973年在對果蠅胚胎 發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)了無翅基因wingless (wg)，Nusser等在研究小鼠乳腺腫瘤時(shí)，從小鼠乳 腺腫癌中克隆出一種原癌基因，當(dāng)時(shí)稱為int-1。近年來利用這些Wnt基因中保守序列設(shè)計(jì) 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從脊椎動(dòng)物到線蟲的許多物種中存在Wnt基因。
[0006] Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是一條多環(huán)節(jié)、多作用位點(diǎn)及動(dòng)物發(fā)育中的關(guān)鍵信號途徑，參與了從 人類到線蟲等不同物種的胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化及成體正常代謝等過程，Wnt及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的 研究主要集中在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育及多種疾病等方面。
[0007] Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是一條非常保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在水螅和人類中都發(fā)現(xiàn)該途徑，根 據(jù)Wnt轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的方式，Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分為經(jīng)典Wnt信號途徑（Canonical Wnt signal Pathway)和非經(jīng)典的 Wnt 信號途經(jīng)（Noncanonical Wnt Signal Pathway)。
[0008] 經(jīng)典Wnt信號途徑亦稱Wnt/0連環(huán)蛋白（0-catenin)信號途徑，在細(xì)胞質(zhì)中存 在著一個(gè)動(dòng)態(tài)的能夠感應(yīng)受體信號的蛋白復(fù)合體，該復(fù)合體又稱為3-catenin降解復(fù)合 體，由軸蛋白（Axin)、腺瘤狀息肉?。ˋdenomatous polyposis coli，APC)、糖原合成酶激酶 (Glycogensynthetasekinase-3P,GSK-3 6)、酪蛋白激酶（Caseinkinasela,CKla) 等組成。當(dāng)胞外無Wnt蛋白信號時(shí)，該蛋白復(fù)合體中的GSK-30磷酸化游離0-catenin 蛋白的特異位點(diǎn)，導(dǎo)致0-catenin降解，使細(xì)胞質(zhì)中的0-catenin處于較低的濃度；當(dāng)存 在胞外Wnt蛋白時(shí)，Wnt蛋白（如WntlOb)與其特異性受體卷曲蛋白（frizzled, Frz)及 輔助受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6 (low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LR P5/6)結(jié)合后，激活散亂蛋白（dishevlled，Dvl)，激活的Dvl蛋白抑制了 GSK-30活性，從而阻止胞質(zhì)內(nèi)游離的0-catenin降解，導(dǎo)致內(nèi)源性0-catenin在細(xì)胞 質(zhì)中積聚并進(jìn)入細(xì)胞核，與其下游信號分子T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子（Tcf/Lef)或 Tsh、Xs 〇X17及組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶糖結(jié)合蛋白（CBP)互相作用，激活經(jīng)典Wnt信號途徑的相 關(guān)靶基因，調(diào)控脂肪細(xì)胞。
[0009] 非經(jīng)典Wnt信號途徑中P -catenin不積聚的Wnt蛋白（如Wnt4、Wnt5a、Wntll) 通過其他方式轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞信號的途徑稱為非經(jīng)典Wnt信號途徑，在該途徑中，Wnt只與Frz作 用，不需要LRP5/6。Wnt/細(xì)胞平面極性途徑（planar cell polarity pathway)通過小G 蛋白R(shí)ho等，激活Jun激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK)，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的不對稱分布 和上皮細(xì)胞的協(xié)同極化、調(diào)節(jié)細(xì)胞的平面極性、胚胎發(fā)育的階段性調(diào)控等，最終導(dǎo)致核內(nèi)靶 基因表達(dá)。Wnt/Ca 2+信號途徑由Wnt5a和Wntll激活，通過細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)的Ca2+鈣調(diào)蛋白依 賴性蛋白激酶II和蛋白激酶C (protein kinase C，PKC)及f丐調(diào)磷酸酶（calcineurin，CAN) 等起作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放，從而影響細(xì)胞黏連和基因表達(dá)。
[0010] 目前，國內(nèi)外對豬WNT10B基因及其結(jié)合蛋白和該基因在不同組織和不同品種豬 表達(dá)差異的報(bào)道研究甚少，開展該基因的生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)譜的研究將為WNT10B 基因分子遺傳特性、在肌內(nèi)脂肪沉積等基因功能研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。本發(fā)明旨在為揭示 WNT10B基因?qū)ωi肌內(nèi)脂肪含量等肉質(zhì)性狀的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種豬肉質(zhì)性狀 相關(guān)WNT10B基因分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用，通過克隆豬WNT10B基因CDNA分子，尋找WNT10B 基因的突變位點(diǎn)以及檢測該基因的多態(tài)性，為豬肉質(zhì)性狀標(biāo)記輔助育種提供有用的分子標(biāo) 記。
[0012] 為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種豬肉質(zhì)性狀相關(guān)WNT10B基 因，其DNA序列如SEQ ID N0 :1所示，在SEQ ID N0 :1序列的552 bp處有1個(gè)A/G的堿基 突變，導(dǎo)致PCR-RFLP-Sal I多態(tài)性。
[0013] 本發(fā)明以人的WNT10B基因序列（GenBank收錄號為NM_003394. 3)為種子序列， 在 GenBank 中利用 BLASTN(Basic Local Alignment Search Tool Nucleotide)，參照其同 源性在80%以上的豬EST(Expression Sequence Tags)設(shè)計(jì)特異引物，利用RACE(Rapid Amplification of cDNA End)，克隆出豬WNT10B基因cDNA全長，該豬WNT10B基因的DNA序 列如SEQ ID N0:1所示。WNT10B基因的多態(tài)性是利用比較基因組學(xué)方法根據(jù)人的WNT10B 基因序列設(shè)計(jì)引物，以豬的基因組DNA為模板擴(kuò)增，擴(kuò)增片段利用測序篩選SNP，并利用 PCR-RFLP進(jìn)行基因分型技術(shù)，發(fā)現(xiàn)第552 bp處有一個(gè)A/G的堿基突變，導(dǎo)致PCR-RFLP-Sal I多態(tài)性，并利用該標(biāo)記檢測了中外豬種的情況。
[0014] 試驗(yàn)材料：25日齡沙子嶺豬由湖南省湘潭市沙子嶺豬資源場提供，取背最 長肌-80 °C 保存，5 ' -RACE Version 2. 0 試劑盒購于 Invitrogen 公司，3 ' -RACE SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒購于 Clontech 公司。
[0015] 總RNA提取與cDNA第1鏈的合成：用SUPERSCRIPT II RT酶和特異性引物GSP-1 對總RNA進(jìn)行基因第一鏈cDNA的合成，使用RNase Mix對合成的cDNA進(jìn)行去RNA處理，最 后對cDNA進(jìn)行純化。
[0016] 引物設(shè)計(jì)：據(jù)GenBank人WntlOb基因（登錄號NM_003394. 3)序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引 物，引物設(shè)計(jì)的軟件為Primer Premier 5. 0,引物設(shè)計(jì)的原則是特異性引物長度在23-28 個(gè)核苷酸，GC含量在50% -70%，退火溫度為65°C -70°C，使用巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增。
[0017] 編碼序列PCR擴(kuò)增：以合成的豬cDNA為模板，在保守區(qū)設(shè)計(jì)引物經(jīng)過克隆測序，獲 得該基因部分CDS(codingdomainsequence)序列。
[0018] 5' -RACE擴(kuò)增：使用TdT酶和dCTP對純化后的cDNA末端加上多聚C，使用引物 GSP5(Gene_Specific Primers)和試劑盒中的橋連鉚釘引物AUAP(表1)對已經(jīng)加dC尾的 cDNA進(jìn)行PCR第一輪擴(kuò)增；使用引物GSP-3和試劑盒里中的橋連通用擴(kuò)增引物AUAP進(jìn)行 巢式PCR第二輪擴(kuò)增，將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對目的條帶進(jìn)行切膠回收純化，純化后 的PCR產(chǎn)物與pMD18-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后對陽性克隆進(jìn)行測序，獲得268 bp的目的序列。
[0019] 3'-RACE擴(kuò)增：使用合成的cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。將第一輪PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物稀釋50倍，然后用引物GSP3和UPM(UniversalPrimerAMix)(表1)進(jìn)行第二輪 PCR擴(kuò)增。將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對目的條帶進(jìn)行切膠回收純化。純化后的PCR產(chǎn) 物與PMD18-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆測序。
[0020] 將擴(kuò)增得到的5' -RACE長度為268 bp、3' -RACE擴(kuò)增得到的長度910 bp和開 放閱讀框長度為1058 bp的編碼序列的序列拼接得WNT10B基因的全長cDNA序列，從而完 成本發(fā)明的WNT10B基因的克隆的內(nèi)容。
[0021] 表1本發(fā)明中使用的引物序列
[0022]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬肉質(zhì)性狀相關(guān)1階108基因，其0嫩序列如3￡〇10勵(lì)：1所示，在3￡〇10勵(lì)：1序列的552bp處有1個(gè)A/G的堿基突變，導(dǎo)致PCR-RFLP-Sall多態(tài)性。
2. 檢測權(quán)利要求1所述的豬肉質(zhì)性狀相關(guān)WNT10B基因的堿基突變的引物對，其 特征在于，所述引物對序列是：正向引物為5' -AATCTGAAGCGGAAATGC-3'，反向引物為 5， -TAAAGGGACTCCAGGGTT-3,。
3. 制備如權(quán)利要求1所述的豬肉質(zhì)性狀相關(guān)WNT10B基因的方法，其特征在于，該方法 是以豬的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求2所述的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用限制性內(nèi)切 酶Sal I對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，最后電泳檢測AA、AG和GG基因型的分布。
4. 權(quán)利要求1所述的豬WNT10B基因在豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求2所述的引物對在豬肉質(zhì)性狀相關(guān)WNT10B基因的分子標(biāo)記輔助選擇中的 應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450729SQ201410850623
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】馬海明, 王玲玉, 蔣雋 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)