用于中華鱘親子鑒定的ssr熒光標(biāo)記引物及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了用于中華鱘親子鑒定的SSR熒光標(biāo)記引物及應(yīng)用，本發(fā)明成功篩選并合成10對(duì)熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物，該引物可以用于建立中華鱘親子鑒定技術(shù)，并且公開(kāi)了所使用的親子鑒定的試劑盒。將所合成的不同熒光顏色的PCR產(chǎn)物混合后測(cè)定等位基因，進(jìn)行中華鱘親子鑒定分析。本發(fā)明所述鑒定方法操作簡(jiǎn)單、快捷、費(fèi)用低廉，具有高效、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便易行等特點(diǎn)，可以在中華鱘種質(zhì)鑒定、家系管理和良種選育進(jìn)行推廣應(yīng)用，并可對(duì)人工增殖放流效果進(jìn)行評(píng)估。
【專利說(shuō)明】用于中華鱘親子鑒定的SSR熒光標(biāo)記引物及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中的水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)鑒定領(lǐng)域，具體涉及用于中華舞親子 鑒定的SSR熒光標(biāo)記引物及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 中華舞（Acipenser sinensis)，隸屬于舞形目，舞科，舞屬，是一種在海洋中生長(zhǎng)， 淡水中繁殖的大型海河洄游性原始古魚(yú)類，至今存活已有1.4億年歷史。該物種主要分布 在長(zhǎng)江和珠江水系。目前珠江水系的中華舞已基本絕跡。葛洲壩修建后，阻斷了中華舞的 繁殖洄游通道，再加上過(guò)度捕撈，水域污染，生境退化，長(zhǎng)江中華舞資源量也嚴(yán)重下降。2010 年，中華舞被列入瀕危物種保護(hù)紅皮書(shū)，是國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物。
[0003] 微衛(wèi)星 DNA (microsatellite)，又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence R印eats, SSR)，是指一類重復(fù)單位在2?6個(gè)堿基的重復(fù)序列。微衛(wèi)星序列作為分子標(biāo)記 有諸多優(yōu)點(diǎn)：在真核基因組中分布廣泛、等位基因多、雜合度高；擴(kuò)增片段短、擴(kuò)增率高；靈 敏度比傳統(tǒng)的D NA指紋高得多，由于其結(jié)果可靠，方法簡(jiǎn)單，省時(shí)省力，在親子鑒定和遺傳 多樣性研宄中微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)正在逐步取代其他分子標(biāo)記技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)外的科研工作者 已利用微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了人類、小鼠、大鼠及幾個(gè)植物等物種的染色體遺傳圖譜，并將微衛(wèi) 星標(biāo)記廣泛應(yīng)于基因定位及克隆、疾病診斷、親緣分析或品種鑒定、繁殖育種以及進(jìn)化研宄 等領(lǐng)域。
[0004] 目前，還沒(méi)有將微衛(wèi)星分子標(biāo)記應(yīng)用到中華舞的親子鑒定和遺傳管理的報(bào)道。本 發(fā)明旨在利用微衛(wèi)星熒光標(biāo)記建立中華舞親子鑒定技術(shù)，為中華舞養(yǎng)殖場(chǎng)建立中華舞家系 譜系提供依據(jù)，以期合理的指導(dǎo)中華舞人工繁殖。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了用于中華舞親子鑒定的SSR熒光標(biāo)記引物，該引物可以 用于中華舞親子鑒定。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了用于中華舞親子鑒定的SSR熒光標(biāo)記引物的應(yīng) 用。包括利用該引物制備成用于中華舞親子鑒定的試劑盒，或利用該引物對(duì)中華舞進(jìn)行親 子鑒定，或利用其進(jìn)行種質(zhì)鑒定和家系管理。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0008] 用于中華舞親子鑒定的SSR熒光標(biāo)記引物，具體如下：
[0009] Asi-75067F:AGAGTTCTCGAAGCGGAAACAG ；R: CTGGTTCAAACTGGGAGCGAT
[0010] Asi-67648F:TCCGGTACTGGAAACCCTTG ；R:ATTCGCCTGGAAGAGCACAC
[0011] As i-67123F:AGCTAACAGCAGTGCATGGTATTT ；R:CTTGAGATAAAAGGCGCTGTAGAG
[0012] Asi-73843F:GGTGTTTGAAAGACAGCGAGAA ；R:TTCCTCCAGGACAGAGTTTGC
[0013] As i-72040F:AGCAGAGTCCACATCCCCCT ； R:GAGTGTCGCTCGAAAGCCCT
[0014] Asi-70421F:TGCCACAAATAAGATGCAGGAG ；R:TTTTGCTTTGGAAACTGTACTGC
[0015] Asi-56700F: CAACCTCTTCACTACCGCAAAC ；R: TGCAAAAAGGAATTGGAATCG
[0016] Asi-65194F:TACAAAATCGGCAGAAAGGCT ；R:GCAGGCATGATGAGAATAGGC
[0017] Asi-77057F:GGGTCCCGCACAGTTTAAAG ；R:GACGGCAAGGCAAGATAGGT
[0018] Asi-66034F:CCTACGCCAAGCTCAACCAG ；R:ACCGCAGAGTCACGGAGTTG ；
[0019] 以上分子標(biāo)記引物的正向引物標(biāo)記常用的熒光染料，包括FAM、HEX、TAMRA、ROX 等。用于中華舞親子鑒定的SSR熒光標(biāo)記引物的應(yīng)用，包括制備中華舞親子鑒定試劑盒，或 利用該引物進(jìn)行中華舞的親子鑒定。
[0020] 中華舞親子鑒定方法包括：
[0021] 提取待鑒定樣品DNA，使用本發(fā)明開(kāi)發(fā)的10對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增。使用常規(guī)軟件 統(tǒng)計(jì)等位基因數(shù)（Na)、期望雜合度（He)、排除概率（PE)以及累積排除概率（CPE)。
[0022] 本發(fā)明提供的中華舞親子鑒定試劑盒，其試劑盒包含10對(duì)中華舞微衛(wèi)星標(biāo)記引 物，以及10XPCR緩沖液，MgCl 2, dNTPs，rTaq DNA聚合酶和雙蒸水。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0024] 1)本發(fā)明提供的SSR分子標(biāo)記引物，可用于中華舞種質(zhì)鑒定和家系管理，從而合 理的指導(dǎo)中華舞人工繁殖，保護(hù)長(zhǎng)江中華舞的遺傳多樣性。對(duì)中華舞進(jìn)行種質(zhì)鑒定和家系 管理，指導(dǎo)人工繁殖，保護(hù)長(zhǎng)江中華舞的遺傳結(jié)構(gòu)。
[0025] 2)本發(fā)明采用合成不同的微衛(wèi)星熒光引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將多個(gè)PCR產(chǎn)物混合測(cè) 定基因型數(shù)據(jù)，從而達(dá)到在一個(gè)測(cè)序反應(yīng)中得到多個(gè)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行親子鑒定，這樣大大 減少了測(cè)序所花的時(shí)間和費(fèi)用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為引物Asi-75067測(cè)序圖。
[0027] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0028] 圖2為引物Asi-67648測(cè)序圖
[0029] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0030] 圖3為引物Asi-67123測(cè)序圖
[0031] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0032] 圖4為引物Asi-73843測(cè)序圖
[0033] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0034] 圖5為引物Asi-72040測(cè)序圖
[0035] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0036] 圖6為引物Asi-70421測(cè)序圖
[0037] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0038] 圖7為引物Asi-56700測(cè)序圖
[0039] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0040] 圖8為引物Asi-65194測(cè)序圖
[0041] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0042] 圖9為引物Asi-77057測(cè)序圖
[0043] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。
[0044] 圖10為引物Asi-66034測(cè)序圖
[0045] 從左至右依次為親本CS-I，非親本CS-6,子代1。

【具體實(shí)施方式】
[0046] 本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案。
[0047] 實(shí)施例1 :
[0048] 中華舞親子鑒定微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選：
[0049] 1)采用經(jīng)典的高鹽法提取宜昌22個(gè)野生中華舞DNA，稀釋至IOOng/μ L備用。
[0050] 2)將通過(guò)Primer Premier 5. 0設(shè)計(jì)的165對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記合成非焚光標(biāo)記引物， 以步驟1)中的DNA為模板，以如下PCR反應(yīng)條件擴(kuò)增：95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，最 適退火溫度下退火30s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；之后72°C延伸10min，4°C保存。利 用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行初步篩選分離，獲得了 24對(duì)多態(tài)性高并且能穩(wěn)定擴(kuò)增的 微衛(wèi)星標(biāo)記。
[0051] 3)將篩選出的中華舞多態(tài)引物繼續(xù)以步驟1)提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后 12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用軟件ATetra 1.2計(jì)算各微衛(wèi)星的等位基因數(shù)（Na)，期望雜 合度（He)，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（SW)，篩選出10對(duì)微衛(wèi)星引物特征如表1 :
[0052] 表110對(duì)中華舞微衛(wèi)星標(biāo)記特征
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 用于中華舞親子鑒定的SSR熒光標(biāo)記引物，包括： Asi-75067 F:AGAGTTCTCGAAGCGGAAACAG ；R: CTGGTTCAAACTGGGAGCGAT Asi-67648 F:TCCGGTACTGGAAACCCTTG ；R:ATTCGCCTGGAAGAGCACAC Asi-67123 F:AGCTAACAGCAGTGCATGGTATTT ；R: CTTGAGATAAAAGGCGCTGTAGAG Asi-73843 F:GGTGTTTGAAAGACAGCGAGAA ；R:TTCCTCCAGGACAGAGTTTGC Asi-72040 F:AGCAGAGTCCACATCCCCCT ；R:GAGTGTCGCTCGAAAGCCCT Asi-70421 F:TGCCACAAATAAGATGCAGGAG ；R: TTTTGCTTTGGAAACTGTACTGC Asi-56700 F:CAACCTCTTCACTACCGCAAAC ；R:TGCAAAAAGGAATTGGAATCG Asi-65194 F:TACAAAATCGGCAGAAAGGCT ；R:GCAGGCATGATGAGAATAGGC Asi-77057 F:GGGTCCCGCACAGTTTAAAG ；R:GACGGCAAGGCAAGATAGGT Asi-66034 F:CCTACGCCAAGCTCAACCAG ；R:ACCGCAGAGTCACGGAGTTG〇
2. 權(quán)利要求1所述引物在中華舞親子鑒定中的應(yīng)用。
3. 權(quán)利要求1所述引物在制備中華舞親子鑒定試劑盒中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，所述的試劑盒包含： 10XPCR Buffer，MgCl2, dNTPs，10 對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記引物，rTaq Enzyme，ddH20〇
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104498613SQ201410854788
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】張書(shū)環(huán), 辛苗苗, 危起偉 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所