肺炎衣原體檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及肺炎衣原體檢測(cè)試劑盒。本實(shí)用新型提供了一種肺炎衣原體檢測(cè)試劑盒，包括：盒體（1）；盒體（1）內(nèi)設(shè)置有海綿墊（2）、八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3）和說(shuō)明書（4）；海綿墊（2）設(shè)置有5個(gè)容器孔（5），容器孔放置有：樣本處理液管（51）、反應(yīng)液A管（52）、反應(yīng)液B管（53）、陽(yáng)性對(duì)照管（54）、陰性對(duì)照管（55）。本實(shí)用新型提供的試劑盒組成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，其中配制有八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3），提高了使用的方便性，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)肺炎衣原體的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】肺炎衣原體檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及肺炎衣原體檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae，CP)是一種嚴(yán)格真核細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞 微生物，與鸚鵡熱嗜衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、豚鼠嗜衣原體、貓嗜衣原體、獸類嗜衣^體共同 組成嗜衣原體屬。肺炎衣原體基因組大小約1. 2Mbp、由21個(gè)Pmp基因、一個(gè)III型分泌毒 力因子系統(tǒng)基因、3個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因和2個(gè)磷脂酶一D樣蛋白基因組成。其 染色體DNA G+Cmol%含量為40%,但與沙眼衣原體和鸚鵡熱衣原體的同源性小于10%，限制 性內(nèi)切酶圖譜極不相同。世界不同地區(qū)分離得到的肺炎衣原體不同株 DNA的同源性可達(dá) 94%以上，限制性內(nèi)切酶圖譜基本一致，標(biāo)準(zhǔn)株為TW-I83和AR-39。肺炎衣原體只有一個(gè)血 清型，代表株為TWAR。肺炎衣原體具有屬特異性抗原和種特異性抗原，屬特異性抗原主要 有兩個(gè)抗原決定簇表位，一個(gè)是肺炎衣原體LPS核心多糖的第三個(gè)KD0殘基，一個(gè)是分子量 為39. 5KDa的主要外膜蛋白（M0MP)，這兩個(gè)抗原決定簇均對(duì)甲醇敏感，與其它衣原體種間 存在交叉；肺炎衣原體的種特異性抗原為98KDa的主要外膜蛋白（M0MP)，該抗原對(duì)丙酮敏 感，并不與沙眼衣原體和鸚鵡熱衣原體抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0003] 肺炎衣原體的感染極為普遍，無(wú)顯著的性別和地區(qū)差異，一年四季均可發(fā)生，主要 引起人類的呼吸道感染和非典型性肺炎，與人口密度呈正相關(guān)，臨床上多以隱性、持續(xù)性感 染的形式存在，其反復(fù)遷延導(dǎo)致難以治療的并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)肺炎衣原體與哮喘、支氣管 炎、慢性阻塞性肺疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病等心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展密 切相關(guān)。肺炎衣原體的感染率隨著年齡的增加迅速上升,兒童感染率在20%左右，青壯年 感染率可達(dá)50-60%，老年的感染率為70-80%。肺炎衣原體通過(guò)呼吸道分泌物進(jìn)行人與人 傳播，在家庭、學(xué)校、軍隊(duì)以及其他人口集中的工作區(qū)域可存在小范圍的流行。目前，肺炎 衣原體已是繼肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌之后引起社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia, CAP)的主要病原體，肺炎衣原體急性感染率占23%，肺炎病人僅占感染者的小 部分，70-90%為亞臨床表現(xiàn)。肺炎衣原體感染的潛伏期為15-23天，可引起上呼吸道感染， 如鼻竇炎、中耳炎和咽炎，也可引起下呼吸道感染，如支氣管炎和肺炎。呼吸道感染多數(shù)表 現(xiàn)為咽痛、發(fā)熱、咳嗽，病情通常較輕，有自限性。老年肺炎衣原體肺炎病人癥狀可能較為嚴(yán) 重，有時(shí)甚至致死，尤其是在合并細(xì)菌性感染或存在慢性阻塞性肺疾病時(shí)，其致死幾率大大 增加。因此，肺炎衣原體感染早期診斷對(duì)于盡早發(fā)現(xiàn)和治療肺炎衣原體感染性疾病非常重 要。
[0004]目前對(duì)肺炎衣原體的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有病原體分離培養(yǎng)技術(shù)、血清學(xué)診斷技 術(shù)和核酸檢測(cè)技術(shù)等方法。因?yàn)榉窝滓略w是一種極難培養(yǎng)的衣原體，其抵抗力較弱，對(duì)室 溫或冰凍敏感，難以從臨床標(biāo)本中分離培養(yǎng)成功，傳代也比較困難，所以不適合采用病原體 分離培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行診斷。目前臨床上常用的肺炎衣原體的檢測(cè)方法主要是檢測(cè)特異性抗體 的方法。由于病原體進(jìn)入機(jī)體進(jìn)行復(fù)制、抗原刺激到產(chǎn)生抗體需要一定時(shí)間，導(dǎo)致這種方法 仍不能滿足早期病原體確診的需要，進(jìn)而不能滿足進(jìn)行早期積極治療的臨床需求。
[0005] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近些年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種核酸檢測(cè)技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光 定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)p CR 進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。因?yàn)閷?shí)時(shí)焚光定量PCR技術(shù)的 檢測(cè)物為致病病原體基因核酸，所以能夠準(zhǔn)確檢測(cè)處于疾病各個(gè)時(shí)期的病原體。目前實(shí)時(shí) 熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可以分為兩種：熒光探針和熒光染料。由于 Tacpan探針具 有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、對(duì)引物及試劑要求不高等優(yōu)點(diǎn)，使該類型的熒光探針常用于實(shí)時(shí)熒 光定量PCR。
[0006] 因此，為了實(shí)現(xiàn)將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于肺炎衣原體的檢測(cè)，很有必要提 供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，能夠快速檢測(cè)肺炎衣原體的核酸檢測(cè)試劑盒。 實(shí)用新型內(nèi)容
[0007] 有鑒于此，本實(shí)用新型提供了肺炎衣原體檢測(cè)試劑盒。該試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可用于 肺炎衣原體感染的臨床快速診斷。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述實(shí)用新型目的，本實(shí)用新型提供以下技術(shù)方案：
[0009] 本實(shí)用新型提供了一種肺炎衣原體檢測(cè)試劑盒，包括：盒體（1);
[0010] 盒體（1)內(nèi)設(shè)置有海綿墊（2)、八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3)和說(shuō)明書（4);
[0011] 海綿墊（2)設(shè)置有5個(gè)容器孔（5)，容器孔放置有：樣本處理液管（51 )、反應(yīng)液A管 (52)、反應(yīng)液B管（53)、陽(yáng)性對(duì)照管（54)、陰性對(duì)照管（55)。
[0012] 作為優(yōu)選，海綿墊（2)的體積占盒體（1)容積的二分之一。
[0013]海綿墊（2)上設(shè)置有容器孔，可將溶液管固定于盒體內(nèi)。一方面使各試劑之間便 于區(qū)分，另一方面減少運(yùn)輸或使用過(guò)程中試劑之間的相互碰撞或傾倒。
[0014] 作為優(yōu)選，八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3)為0. 2mL的高管或0. lmL的矮管。
[0015] 作為優(yōu)選，八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3)帶有八聯(lián)管蓋。
[0016] 優(yōu)選的，八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3 )裝于自封袋中。
[0017] 作為優(yōu)選，八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3)的數(shù)量為4條。
[0018] 作為優(yōu)選，樣本處理液管（51)內(nèi)裝有樣品處理液，所述樣品處理液pH值為8. 0,包 括：
[0019] Tri^?l 1 Ommol/L； EDTA 1 mmol/L; NaCl 0.15mol/L; NP-40 0 lrng/mL; SDS lmg/mL?
[0020] 作為優(yōu)選，反應(yīng)液A管（52)內(nèi)裝有反應(yīng)液A，包括：
[0021] Trts-Hci i 細(xì) 〇勵(lì) KCl 5 mmol/L; MgCl2 di^TP/dUTP Mixture SOO^imol/L ； BSA Img/niL; 上游引物 100nmdl/l4 下游引物 lOOnmol/L;
[0022] ## 5QitmoML,
[0023] 優(yōu)選的，上游引物序列為：5 ' -TTCCCCTTGCCMCAGACG-3 ' ；
[0024] 下游引物序列為：5' -GGCTGAGCAATGCGGATGT-3' ；
[0025] 探針序列為：5 ' FAM-CGACCATCMTTATC-MGB3 '。
[0026] 作為優(yōu)選，反應(yīng)液B管（53)內(nèi)裝有反應(yīng)液B，包括：Taq DNA聚合酶與UDG酶，其中 Taq DNA聚合酶與UDG酶的體積比為10:1。
[0027] 作為優(yōu)選，陽(yáng)性對(duì)照管（54)內(nèi)裝有陽(yáng)性對(duì)照液，包括：肺炎衣原體質(zhì)粒。
[0028] 優(yōu)選的，肺炎衣原體質(zhì)粒的濃度為104Copies/y L。
[0029] 作為優(yōu)選，陰性對(duì)照管（54)內(nèi)裝有陰性對(duì)照液，陰性對(duì)照頁(yè)的PH值為8. 0,其中包 括：
[0030] Tris-HCl 10mmol/L ；
[0031] EDTA lmmol/L〇
[0032] 本實(shí)用新型提供了一種肺炎衣原體檢測(cè)試劑盒，包括：盒體（1);盒體（1)內(nèi)設(shè)置 有海綿墊（2)、八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3)和說(shuō)明書（4);海綿墊（2)設(shè)置有5個(gè)容器孔（5)，容器 孔放置有：樣本處理液管（51)、反應(yīng)液A管（ 52 )、反應(yīng)液B管（53 )、陽(yáng)性對(duì)照管（54)、陰性對(duì) 照管（55)。本實(shí)用新型提供的試劑盒組成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，其中配制有八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3)，且試 劑的拿取方便，不易混淆，提高了使用的方便性，且使用本實(shí)用新型提供的試劑盒能夠在2h 內(nèi)完成對(duì)肺炎衣原體的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肺炎衣原體快速準(zhǔn)確檢測(cè)的目的。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1示本實(shí)用新型提供的肺炎衣原體檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖；其中1為盒體，2為 海綿墊，3為八聯(lián)PCR反應(yīng)管，4為說(shuō)明書，5為容器孔，51為樣本處理液管，52為反應(yīng)液A 管，53為反應(yīng)液B管，54為陽(yáng)性對(duì)照管，δ5為陰性對(duì)照管。

【具體實(shí)施方式】
[0034]本實(shí)用新型公開(kāi)了一種肺炎衣原體檢測(cè)試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi) 容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本實(shí)用新型內(nèi)。本實(shí)用新型已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例 進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本實(shí)用新型內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本實(shí) 用新型技術(shù)。
[0035] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本實(shí)用新型。
[0036] 實(shí)施例1肺炎衣原體核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒的結(jié)構(gòu)
[0037] 如圖1所示，本實(shí)用新型一種肺炎衣原體核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其包括盒體（1)和 海綿墊（2)，海綿墊（2)的體積大小為盒體的二分之一，上面設(shè)有五個(gè)容器孔（5)，分別用于 放置：樣本處理液管（51)、反應(yīng)液A管（52)、反應(yīng)液B管（53)、陽(yáng)性對(duì)照管（54)、陰性對(duì)照管 (55)。盒體中另一半空間用于放置八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3)和說(shuō)明書（4)。
[0038] 實(shí)施例2肺炎衣原體核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒的制備
[0039] 1、配制各溶液：
[0040] a、樣本處理液：樣本處理液配制使用的試劑級(jí)別均為分析純，稱取所需重量后，以 滅菌超純水配制成，其中 Tris-HCl (ρΗ8· 0) 10mmol/L ;EDTA(pH8. 0) lmmol/L ;NaC10. 15mol/ L ；NP-401mg/mL ；SDSlmg/mL〇
[0041] b、反應(yīng)液 A:
[0042] 其中包括：Tris-HCl lmmol/L ;KCl5mmol/L ;MgCl24. 8mmol/L ;dNTP/dUTP Mixture200ymol/L ;BSAlmg/mL ;上游引物 lOOnmol/L ;下游引物 lOOnmol/L ;探針 50nmol/ L〇
[0043] 上游引物序列為：5' -TTCCCCTTGCCAACAGACG-3'
[0044] 下游引物序列為：5，-GGCTGAGCAATGCGGATGT-3 '，
[0045] 探針序列為：5' FAM-CGACCATCAATTATC-MGB3'
[0046] 根據(jù)需求取所需量，加滅菌超純水混合均勻后即得。
[0047] c、反應(yīng)液B :CP PCR反應(yīng)液B由Taq DNA聚合酶、UDG酶組成。其中Taq DNA聚合 酶的酶活力為5U/μ L，購(gòu)買自寶生物工程(大連）有限公司；UDG酶的酶活力為5U/μ L，購(gòu) 買自New England Biolabs公司。根據(jù)實(shí)際需求，取Taq DNA聚合酶與UDG酶按照體積比 10:1進(jìn)行混合，即得，低溫保存?；旌虾螅琓aq DNA聚合酶的酶活力為4. 5U/ μ L ;UDG酶的酶 活力為〇. 4δυ/μ L，
[0048] d、陰性對(duì)照：由 Tris-Hcl 和 EDTA 組成，其中 Tris-Hcl 的濃度為 10ramol/L，EDTA 的濃度為lram〇l/L，以無(wú)菌超純水配制調(diào)節(jié)pH為8. 0。
[0049] e、陽(yáng)性對(duì)照：肺炎衣原體質(zhì)粒，濃度為l〇4Copies/ μ L。
[0050] 2、按照市場(chǎng)需求，將所得樣本處理液、反應(yīng)液Α、反應(yīng)液Β、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照分 裝至分別獨(dú)立包裝，貼標(biāo)簽后，置于試劑盒盒體內(nèi)的海綿墊上，在盒體內(nèi)裝入八聯(lián)PCR反應(yīng) 管和說(shuō)明書，即得。
[0051] 實(shí)施例3肺炎衣原體核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒的使用
[0052] 取實(shí)施例2制得的試劑盒，考察本實(shí)用新型提供的試劑盒在檢測(cè)肺炎衣原體 98KDa Μ0ΜΡ基因中的應(yīng)用。
[0053] 本實(shí)用新型提供的試劑盒適用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，該試劑盒適用于實(shí)時(shí)熒光定 量PCR，使用時(shí)，以試劑盒中所帶的陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照作為檢測(cè)模板，根據(jù)擴(kuò)增曲線定性 判定檢測(cè)結(jié)果。
[0054] 質(zhì)控結(jié)果判定必須符合下述條件：
[0055] 陰性對(duì)照：陰性無(wú)擴(kuò)增，結(jié)果為陰性。
[0056]陽(yáng)性對(duì)照：結(jié)果為陽(yáng)性，且在FAM熒光通道下的Ct值為25 < Ct彡29。
[0057]以上兩項(xiàng)需在一次試驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，全部實(shí)驗(yàn)應(yīng)重新進(jìn)行。 [0058] 樣本檢測(cè)結(jié)果判定：
[0059] FAM熒光通道下結(jié)果判斷：根據(jù)儀器的要求設(shè)置好基線和閾值后，儀器會(huì)自動(dòng)分 析并計(jì)算出每個(gè)樣本的ct值，其中擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)典型的"S"型且Ct < 37,則判斷結(jié)果為陽(yáng) 性；無(wú) ct值或Ct值為40,則判斷結(jié)果為陰性；如37 < Ct值< 40之間，建議此樣本重做， 若重新檢查Ct值< 40則判斷為陽(yáng)性，否則判斷為陰性。
[0060]以104Copies/ μ L肺炎衣原體質(zhì)粒為模板，按照30 μ L的體系配制PCR反應(yīng)體系， 其中：
[0061] 反應(yīng)液 A 27. 78 μ L，
[0062] 反應(yīng)液 Β 0. 22 μ L,
[0063] 模板 2 μ L。
[0064] 按照下列反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)：
[0065]

【權(quán)利要求】
1. 一種肺炎衣原體檢測(cè)試劑盒，包括：盒體（1); 所述盒體（1)內(nèi)設(shè)置有海綿墊（2)、八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3)和說(shuō)明書（4); 所述海綿墊（2)設(shè)置有5個(gè)容器孔（5)，所述容器孔（5)放置有：樣本處理液管（51)、反 應(yīng)液A管（52 )、反應(yīng)液B管（53 )、陽(yáng)性對(duì)照管（54)、陰性對(duì)照管（55 )。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述海綿墊（2)的體積占所述盒體（1) 容積的二分之一。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3)為0. 2mL的高 管或0. lmL的矮管。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3)帶有八聯(lián)管 蓋。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述八聯(lián)PCR反應(yīng)管（3)的數(shù)量為4條。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK204039404SQ201420194714
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】柳輝 申請(qǐng)人:深圳康美生物科技股份有限公司