用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的剪膜器的制造方法
【專利摘要】本實用新型涉及一種用于絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的剪膜器，尤其應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化。所述剪膜器包括手持部和刀頭，所述刀頭包括一個由前邊、后邊和刀刃組成的三角形，且前邊與刀刃的夾角為40～50°，后邊與刀刃的夾角為25～35°；所述手持部與所述刀頭的后邊連接，并與所述刀頭的前邊平行設(shè)置。本實用新型剪膜器可一人操作、剪切均勻、應(yīng)用廣泛，勞動強度大大降低，轉(zhuǎn)化效率得到大大提高。
【專利說明】用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的剪膜器

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型屬于遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的剪膜器，尤其應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化。

【背景技術(shù)】
[0002]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化是近年建立起來的一種新方法，該方法已經(jīng)成為真菌菌種改良、新基因標(biāo)記及目的基因篩選、分離和克隆的重要方法之一。與PEG、基因槍等真菌轉(zhuǎn)化體系相比，該遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)具有方法簡單、材料易得、轉(zhuǎn)化效率高以及轉(zhuǎn)化子中T-DNA單拷貝插入比例高等特點，同時，該方法獲得的突變體遺傳穩(wěn)定，T-DNA插入位點克隆非常方便，解決了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法的瓶頸。目前，利用該方法已成功實現(xiàn)了多種真菌高通量突變體庫的構(gòu)建，且在各類真菌突變體庫構(gòu)建的基礎(chǔ)上，開展了相關(guān)基因的篩選和功能基因的研宄。隨著不同絲狀真菌遺傳研宄的進行，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化會得到更加廣泛的應(yīng)用。
[0003]絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化一般要經(jīng)過以下幾個步驟:農(nóng)桿菌活化及其誘導(dǎo)培養(yǎng)-農(nóng)桿菌與絲狀真菌二者共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化-轉(zhuǎn)化子的篩選-轉(zhuǎn)化子獲得與鑒定。其中，轉(zhuǎn)化子的篩選是獲得轉(zhuǎn)化子極其重要的一個環(huán)節(jié)，這一步驟的效率，直接影響著轉(zhuǎn)化子的數(shù)量和質(zhì)量，從而決定著下一步研宄。真菌屬于微生物，在一張轉(zhuǎn)化膜上轉(zhuǎn)化效率從幾個到上百個數(shù)量不等，由于轉(zhuǎn)化過程中，T-DNA插入位點的多樣性、T-DNA插入時間差異等，決定著突變體之間生長、發(fā)育和物質(zhì)能量代謝的差異，同時，有些絲狀真菌在營養(yǎng)生長的同時，進行著生殖作用，就會產(chǎn)生孢子等繁殖體，這些繁殖體具有穩(wěn)定的抗性，因此，這一步驟的處理效率、處理質(zhì)量決定著獲得轉(zhuǎn)化子的多少及其轉(zhuǎn)化子的有效性。
[0004]目前，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的篩選一般是農(nóng)桿菌與絲狀真菌混合物均勻涂布在透性膜玻璃紙或硝酸纖維素膜(稱為轉(zhuǎn)化膜)上，共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化48h后，轉(zhuǎn)化膜剪成條狀，均勻地放置到含有相應(yīng)抗生素篩選平板上。由于這個過程中，一般有兩個人共同操作完成，其中一個人負(fù)責(zé)剪膜，另一個人負(fù)責(zé)輔助展開轉(zhuǎn)化膜及其擺放膜條，而且需要用到剪刀、多個鑷子，操作過程會出現(xiàn)多種問題，如下:
[0005]1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率非常高，一張大小約4cmX 5cm的膜上，出現(xiàn)幾十個甚至上百個轉(zhuǎn)化子，有的轉(zhuǎn)化子還可能產(chǎn)生孢子等繁殖體，雙人操作，且必須懸空操作，膜的震動性大，多個鑷子剪刀，且較長時間接觸轉(zhuǎn)化膜，容易出現(xiàn)外源污染或交叉污染，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)“雙胞胎”和“多胞胎”現(xiàn)象；
[0006]2.若是玻璃紙轉(zhuǎn)化膜，由于其含水量較少，在超凈工作臺上，風(fēng)速相對較大，操作時間較長，玻璃紙容易風(fēng)干卷曲，風(fēng)干卷曲的膜，不利于剪膜，同時，卷曲的膜條可能多處懸空不能夠接觸篩選培養(yǎng)基，導(dǎo)致因營養(yǎng)缺乏而轉(zhuǎn)化子無法生長，這直接影響到轉(zhuǎn)化子的獲得，也給轉(zhuǎn)化子的篩選帶來很大的限制；
[0007]3.在剪膜過程中，由雙人操作完成，由于膜在懸空進行，穩(wěn)定性差，且滯留時間較長，長時間操作容易疲勞，剪切膜條之間均勻性差，膜條寬窄不一，在篩選培養(yǎng)基上放置不均勻，不能有效利用篩選培養(yǎng)基；
[0008]4.費工費時，效率低下。目前進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化，共培養(yǎng)后進行轉(zhuǎn)化子篩選，需要轉(zhuǎn)移在轉(zhuǎn)化膜到一新的篩選培養(yǎng)基上，在此過程中，通常轉(zhuǎn)化膜需要剪切成條狀，這需要雙人合作才能完成，工作效率較低。
[0009]因此，探索一種在轉(zhuǎn)化子篩選過程中，有效減少污染、操作方便、高效、有效利用培養(yǎng)皿空間，同時提高轉(zhuǎn)化子收獲的數(shù)量與質(zhì)量的途徑，是絲狀真菌轉(zhuǎn)化子篩選過程中的一種當(dāng)務(wù)之急。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對上述問題，本實用新型提供了一種用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的剪膜器，該剪膜器可一人操作、剪切均勻、應(yīng)用廣泛。
[0011]本實用新型技術(shù)方案如下:
[0012]設(shè)計一種用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的剪膜器，包括手持部和刀頭，所述刀頭包括一個由前邊、后邊和刀刃組成的三角形，且前邊與刀刃的夾角為40?50°，后邊與刀刃的夾角為25?35° ;所述手持部與所述刀頭的后邊連接，并與所述刀頭的前邊平行設(shè)置。
[0013]優(yōu)選的，所述刀頭還包括一個柄部，該柄部與后邊固定連接，并與前邊平行設(shè)置；所述手持部與該柄部活動連接。
[0014]更優(yōu)選的，所述手持部的一端設(shè)置有夾持裝置(便于更換刀頭)，該夾持裝置與所述柄部活動連接。
[0015]更優(yōu)選的，所述夾持裝置為與所述柄部匹配的螺栓緊固裝置。
[0016]優(yōu)選的，所述前邊與刀刃的夾角為45°，后邊與刀刃的夾角為30°。
[0017]優(yōu)選的，所述手持部與所述刀頭的前邊對齊設(shè)置。
[0018]優(yōu)選的，所述刀頭為片狀，所述手持部為柱狀。
[0019]優(yōu)選的，所述手持部上設(shè)置有橡膠或皮制防滑套。
[0020]優(yōu)選的，所述刀頭由不銹鋼材料制成。
[0021]本實用新型具有積極有益的技術(shù)效果:
[0022](I)利用本實用新型剪膜，改變了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化膜剪切方式，可進行單人操作，使用簡單，剪膜效率高，時間短，在剪切過程中不需要剪刀、鑷子等輔助工具，與外源物質(zhì)接觸少，無交叉污染和外源污染，克服了絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化過程中長期以來剪膜困難的技術(shù)難題。
[0023](2)應(yīng)用本實用新型，可在培養(yǎng)基上直接切割轉(zhuǎn)化膜，培養(yǎng)基起到支持作用，不用懸空操作，受力均勻，不宜疲勞，而常規(guī)的雙人操作剪膜后必須立即放置，剪膜過程中不能夠停止。應(yīng)用本實用新型的單人剪膜操作不受這個限制，中間可以停止，放置轉(zhuǎn)化膜時也可以中間休息，勞動強度大大降低。
[0024](3)應(yīng)用本實用新型進行膜剪切能避免膜震動，轉(zhuǎn)化膜剪切后平整均勻，能緊貼篩選培養(yǎng)基，使其得到有效利用，轉(zhuǎn)化效率得到大大提高。
[0025](4)本實用新型結(jié)構(gòu)簡單，制作成本低廉，其應(yīng)用廣泛，使用范圍在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌轉(zhuǎn)化的整個過程中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本實用新型剪膜器結(jié)構(gòu)示意圖；
[0027]圖2為本實用新型剪膜器的刀頭結(jié)構(gòu)示意圖。
[0028]圖中，I為手持部、2為刀頭、3為夾持裝置、4為防滑套、5為前邊、6為后邊，7為刀刃，8為柄部。

【具體實施方式】
[0029]為了使本實用新型的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本實用新型進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本實用新型，并不用于限定本實用新型。
[0030]實施例1:一種用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的剪膜器，參見圖1、2，包括手持部和刀頭(由不銹鋼材料制成)，所述刀頭包括一個由前邊、后邊和刀刃(長18mm)組成的三角形和一個柄部(寬2mm)，前邊與刀刃的夾角為45°，后邊與刀刃的夾角為30°，這兩種角度參數(shù)的設(shè)置，便于在培養(yǎng)皿中利用刃尖靈活的進行切割，柄部與后邊固定連接(在本實施例為一體結(jié)構(gòu))，并與前邊平行并對齊設(shè)置。在所述手持部的一端設(shè)置有夾持裝置，該夾持裝置通過螺栓緊固方式與所述柄部活動連接。所述刀頭為片狀，所述手持部為柱狀，手持部上設(shè)置有橡膠防滑套。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化一般采用透性玻璃紙和硝酸纖維素膜作為轉(zhuǎn)化膜，本實用新型剪膜器的使用方法如下:
[0031]1.剪膜器消毒:沾少許酒精，在酒精燈快速燃燒殺菌，確保剪膜器無菌化；
[0032]2.轉(zhuǎn)化膜二分法剪切:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌轉(zhuǎn)化，一般使用直徑為9.0 cm的培養(yǎng)皿，在5cmX4cm的矩形轉(zhuǎn)化膜實現(xiàn)共轉(zhuǎn)化；共轉(zhuǎn)化結(jié)束后，采用二分剪切法剪切轉(zhuǎn)化膜，第一刀沿5cm邊中線切開，依次再取中線切開，如此經(jīng)3級切割，最后切成寬度約為0.6cm條膜；
[0033]3.膜條擺放:共轉(zhuǎn)化膜剪切完成后，用無菌鑷子輕輕放置膜條于另一個適當(dāng)抗生素的篩選培養(yǎng)基上，膜條之間保持1.0cm的距離，且膜條均勻分布于篩選培養(yǎng)基上，為轉(zhuǎn)化子的生長提供足夠的空間，以利于轉(zhuǎn)化子的挑選。
【權(quán)利要求】
1.一種用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化的剪膜器，包括手持部和刀頭，其特征在于:所述刀頭包括一個由前邊、后邊和刀刃組成的三角形，且前邊與刀刃的夾角為40?50°，后邊與刀刃的夾角為25?35° ;所述手持部與所述刀頭的后邊連接，并與所述刀頭的前邊平行設(shè)置。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的剪膜器，其特征在于:所述刀頭還包括一個柄部，該柄部與后邊固定連接，并與前邊平行設(shè)置；所述手持部與該柄部活動連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的剪膜器，其特征在于:所述手持部的一端設(shè)置有夾持裝置，該夾持裝置與所述柄部活動連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的剪膜器，其特征在于:所述夾持裝置為與所述柄部匹配的螺栓緊固裝置。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的剪膜器，其特征在于:所述前邊與刀刃的夾角為45°，后邊與刀刃的夾角為30°。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的剪膜器，其特征在于:所述手持部與所述刀頭的前邊對齊設(shè)置。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的剪膜器，其特征在于:所述手持部為柱狀。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的剪膜器，其特征在于:所述手持部上設(shè)置有橡膠或皮制防滑套。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的剪膜器，其特征在于:所述刀頭由不銹鋼材料制成。
【文檔編號】C12Q1/04GK204211750SQ201420517133
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月10日
【發(fā)明者】梁慎, 徐小利, 趙衛(wèi)星, 常高正, 李曉慧, 王龍飛, 程丹丹 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所