末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置及末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離方法
【專利摘要】一種末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其具備金屬過濾器，所述金屬過濾器具有能夠捕捉體液中的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞的凹坑和形成于該凹坑中且能夠使末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞以外的體液細胞通過的孔。
【專利說明】末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置及末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離方法
[0001]

【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及用于分離體液中的末梢循環(huán)腫瘤細胞(Circulating Tumor Cell;以下也稱為“CTC”)或稀少細胞的、具備特定的多孔性金屬過濾器(以下也僅稱為“CTC分離過濾器”)的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置(以下也僅稱為“CTC分離裝置”)。
[0003]本發(fā)明還涉及從體液中分離末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞的方法，其包括使用上述裝置從癌癥患者的血液等體液中分離CTC或稀少細胞。

【背景技術】
[0004]在癌癥患者的血液中循環(huán)的腫瘤細胞或癌細胞被稱為CTC。CTC被認為是轉(zhuǎn)移癌的原因之一，暗示CTC檢測可能對轉(zhuǎn)移癌的早期診斷有效。但是，CTC為稀少細胞之一，在血中非常少，例如，每18?10 9個血細胞成分中約為I個，因此，提出了若干種CTC的分離方法。例如，分離方法中已知有:利用固定有抗EpCAM(上皮細胞粘附分子)抗體的磁性粒子或在柱狀結(jié)構等的樹脂表面上結(jié)合有捕捉抗體的微流體裝置的方法；以及利用CTC與血細胞的尺寸的差異、使用過濾器進行分離的方法等(Isolat1n of rare circulatingtumour cells in cancer patients by microchip technology.Sunitha Nagrath 等Nature, 2007，450:1235-1239)、(日本特開 2011-163830 號公報、日本特開 2013-42689 號公報、日本特開2005-10177號公報、日本特表2007-525642號公報、日本特開2009-106936號公報)。
[0005]在利用過濾器的CTC分離方法中，使用過濾器的材質(zhì)由聚對二甲苯(parylene)(美國專利申請第20110111412A1號)、聚碳酸醋(F.Farace等，Br.J.Cancer, 2011，105:847-853)等聚合物、硅、金屬(日本特開2013-42689號公報)等構成且在其表面上具有多個7?10 μ m的孔的微過濾器。從原理上而言，過濾器具有使血液細胞通過而將CTC捕捉到過濾器上的孔尺寸。
[0006]在日本特開2013-42689號公報記載的金屬過濾器中，作為優(yōu)選的金屬，從金、銀、銅、銷、鶴、镲、絡、不銹鋼或它們的合金中選擇，另外，優(yōu)選貫通孔的短邊的長度為5.0?15.0 μ m，平均孔隙率為0.1?50%，過濾器的厚度為3?100 μ m。在其實施例中，使用鎳過濾器(平均孔隙率:1.4%、孔的大小:8Χ30 μπκ孔的形狀:圓角長方形)，回收摻入在血液中的人類小細胞肺癌細胞系。在該實驗中，記載了癌細胞回收率為74.9±10.5%，殘留白細胞數(shù)為697±84。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]發(fā)明所要解決的問題
[0008]上述的【背景技術】中所記載的、使用過濾器的尺寸選擇性CTC濃縮裝置與磁珠方式相比，具有簡便、低成本等優(yōu)點。但是，由于需要對作為樣本的血液進行溶血的預處理、或者使用泵作為過濾的驅(qū)動力，因此，會對CTC造成細胞應激，或者，由于細胞的固定、流路的封閉性而難以進行活細胞的單細胞分離。
[0009]考慮到上述事實，本發(fā)明的目的在于實現(xiàn)存活的CTC或稀少細胞的高效回收，而且能夠?qū)崿F(xiàn)簡便、輕柔的單活細胞分離。
[0010]用于解決問題的方法
[0011]本發(fā)明包含以下特征。
[0012][I] 一種末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其具備金屬過濾器，所述金屬過濾器具有能夠捕捉體液中的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞的凹坑、和形成于該凹坑中且能夠使所述末梢循環(huán)腫瘤細胞或所述稀少細胞以外的體液細胞通過的孔。
[0013][2]如[I]所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其中，所述金屬過濾器的材質(zhì)為鈀或鈀鎳合金。
[0014][3]如[I]或[2]所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其中，所述凹坑的直徑為20?30 μ m，所述凹坑的深度為5?15 μ m。
[0015][4]如[I]?[3]中任一項所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其中，所述孔的直徑為7?10 μ m。
[0016][5]如[I]?[4]中任一項所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其中，所述凹坑和所述孔的孔密度為I X 14個/cm2?2 X 10 5個/cm2。
[0017][6]如[I]?[5]中任一項所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其中，所述金屬過濾器的厚度為10?40 μ m。
[0018][7]如[I]?[6]中任一項所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其中，具有用于安裝所述金屬過濾器的過濾器盒。
[0019][8] 一種末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離方法，其中，將選自癌癥患者的血液、腹水或腹腔清洗液中的體液注入到[I]?[7]中任一項所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置中，利用所述金屬過濾器的所述凹坑捕捉該體液中的所述末梢循環(huán)腫瘤細胞或所述稀少細胞后，在存活的狀態(tài)下回收。
[0020][9]如[8]所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離方法，其中，進一步包括對所述末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞進行特異性染色。
[0021][10]如[8]或[9]所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離方法，其中，包括對所述體液進行稀釋或預處理。
[0022][11]如[10]所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離方法，其中，所述預處理包括:將所述體液與含有磁性納米粒子的陽離子性核糖體混合，使所述體液中的所述末梢循環(huán)腫瘤細胞或所述稀少細胞和白細胞中攝入所述磁性納米粒子后，注入到通入所述金屬過濾器的流路中，利用配置在所述金屬過濾器前方的磁石將未攝入磁性納米粒子的紅細胞等細胞從該體液中除去。
[0023]發(fā)明效果
[0024]根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)崿F(xiàn)存活的CTC或稀少細胞的高效回收，而且能夠?qū)崿F(xiàn)簡便、輕柔的單活細胞分離。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1A是在含有金屬過濾器小片的培養(yǎng)基中將MKN-45細胞培養(yǎng)3天來考察金屬過濾器的細胞毒性。其示出了對照、鈀(Pd)-鎳(Ni)合金(80:20)過濾器存在下和鎳(Ni)過濾器存在下的細胞增殖曲線。Pd-Ni過濾器存在下的MKN-45細胞顯示出與對照基本相同的增殖速度(低細胞毒性)。Pd-Ni過濾器與Ni過濾器相比，細胞毒性明顯低。
[0026]圖1B是在含有金屬過濾器小片的培養(yǎng)基中將MKN-45細胞培養(yǎng)3天并觀察細胞的形態(tài)。其示出了第3天的細胞的形態(tài)。Ni過濾器存在下的MKN-45細胞與對照、Pd-Ni過濾器存在下相比，形態(tài)變圓，局部還觀察到凋亡的細胞。
[0027]圖2A是3D Pd-Ni過濾器的SEM圖像。凹坑的直徑30 μπκ凹坑的深度10 μπκ孔的直徑8 μπκ孔密度99178/cm2(超高孔密度)、交錯格子排列。
[0028]圖2B是3D Pd-Ni過濾器的SEM圖像。凹坑的直徑30 μπκ凹坑的深度10 μπκ孔的直徑8 μπκ孔密度71656/cm2(高孔密度)、交錯格子排列。
[0029]圖2C是2D Pd-Ni過濾器過濾器的SEM圖像。凹坑的直徑30 μπκ凹坑的深度I μπκ孔的直徑8 μπκ孔密度40000/cm2、格子排列。
[0030]圖2D是市售的聚碳酸醋過濾器(孔徑8 μπκ Whatman公司)的SEM圖像。
[0031]圖2E是示意性地表示圖2A所示的金屬過濾器的截面圖。
[0032]圖3A是裝置的外觀的模式圖。裝置例如寬度為15cm、進深為12cm、高度為22cm。
[0033]圖3B是裝置的構成部件的模式圖。
[0034]圖3C是示意性地表示將各單元組裝而成的裝置的主視圖。
[0035]圖4A是在凹坑中捕捉到癌細胞(箭頭)的3D過濾器的SEM圖像(右圖為左圖的放大圖)。
[0036]圖4B是將在10倍稀釋的正常人血液2mL中混合500個培養(yǎng)癌細胞(COLM5-EGFP)并用PBS稀釋10倍的試樣使用3D Pd-Ni過濾器(凹坑的直徑30 μπκ凹坑的深度10 μπκ孔的直徑8 μ m、孔密度99178/cm2、交錯格子排列)進行過濾，將細胞用PE標記的抗⑶45抗體進行染色。左上為GFP熒光圖像(癌細胞檢測)，右上為PE標記的抗⑶45抗體的染色圖像(白細胞檢測)。只觀察到少數(shù)白細胞，未觀察到癌細胞與白細胞存在于同一凹坑內(nèi)的圖像。右下為在過濾器盒上通過手動對操作器(玻璃毛細管)進行操作來對癌細胞進行單細胞分離時的亮視野圖像。箭頭為操作器。
[0037]圖5A是將在正常人血液2.5mL中混合500個培養(yǎng)癌細胞(COLM5-EGFP)并用PBS稀釋10倍的試樣使用3D Pd-Ni過濾器進行過濾，改變裝置的流速來考察癌細胞的回收率
(% )o
[0038]圖5B是將在正常人血液2.5mL中混合培養(yǎng)癌細胞(COLM5-EGFP)并用PBS稀釋10倍的試樣使用3D Pd-Ni過濾器進行過濾，改變癌細胞數(shù)來考察癌細胞的回收率(％ )。裝置的流速為2ml/分鐘。
[0039]圖6A是將從皮下移植有培養(yǎng)癌細胞(COLM5-EGFP)的裸鼠體內(nèi)在移植3個月后采集到的血液使用3D Pd-Ni過濾器進行過濾，觀察GFP熒光。左圖為GFP熒光圖像，右圖為相位差顯微鏡的亮視野圖像。箭頭為CTC。
[0040]圖6B是將從皮下移植有培養(yǎng)癌細胞(COLM5-EGFP)的裸鼠體內(nèi)在移植I?2個月后和2?3個月后采集到的血液使用3D Pd-Ni過濾器進行過濾，測定CTC數(shù)。
[0041]圖7A是將胃癌患者的末梢血使用3D Pd-Ni過濾器進行過濾，并將細胞用熒光標記抗體進行染色。左上為Alexa488標記的抗EpCAM抗體的染色圖像，右上為PE標記的抗⑶45抗體的染色圖像，左下為Hoechst33342的染色圖像，右下為亮視野圖像。箭頭為CTC。
[0042]圖7B是將乳腺癌患者的末梢血使用3D Pd-Ni過濾器進行過濾，并將細胞用熒光標記抗體進行染色。左起依次為Alexa488標記的抗EpCAM抗體的染色圖像、PE標記的抗⑶45抗體的染色圖像、Alexa350標記的抗CK Oscar抗體的染色圖像、亮視野圖像。箭頭為CTC0
[0043]圖7C是對漸進性乳腺癌患者(6名)、漸進性胃癌患者(4名)和正常人(4名)的末梢血5mL中的CTC數(shù)進行測定。
[0044]圖8A是對利用了使用X射線或紫外線的光刻和電鑄的鈀鎳過濾器的制造方法進行說明的模式圖。
[0045]圖SB是對利用了使用X射線或紫外線的光刻和電鑄的鈀鎳過濾器的制造方法進行說明的模式圖。
[0046]圖SC是對利用了使用X射線或紫外線的光刻和電鑄的鈀鎳過濾器的制造方法進行說明的模式圖。
[0047]圖8D是對利用了使用X射線或紫外線的光刻和電鑄的鈀鎳過濾器的制造方法進行說明的模式圖。
[0048]圖SE是對利用了使用X射線或紫外線的光刻和電鑄的鈀鎳過濾器的制造方法進行說明的模式圖。
[0049]圖8F是對利用了使用X射線或紫外線的光刻和電鑄的鈀鎳過濾器的制造方法進行說明的模式圖。

【具體實施方式】
[0050]對本發(fā)明的實施方式進行詳細說明。
[0051]1.分離末梢循環(huán)腫瘤細胞(CTC)或稀少細胞的金屬過濾器
[0052]本說明書中的“CTC”為癌癥患者的血液中含有的循環(huán)腫瘤細胞，是指與血液細胞等體液細胞相比細胞數(shù)非常少的稀少的細胞。
[0053]本說明書中的“稀少細胞”是指癌癥患者的腹水、腹腔清洗液、淋巴液、腦脊液等體液中含有的稀少的腫瘤細胞(“稀少癌細胞”)。
[0054]本實施方式的金屬過濾器17是在由特定的金屬構成的極薄板上均勻地或規(guī)則地形成有數(shù)量非常多的孔(孔密度I X 1Vcm2以上)的多孔性金屬過濾器?，F(xiàn)有公知的CTC分離過濾器由聚對二甲苯(parylene)、聚碳酸酯等樹脂(或聚合物)、硅形成。與此相對，本實施方式的CTC分離過濾器為金屬過濾器17，其具有以下所述的、不同于樹脂過濾器等的優(yōu)良特性。
[0055]金屬過濾器17的材質(zhì)例如包含鈀(Pd)、鉑(Pt)、金(Au)、銀(Ag)、銥(Ir)、銠(Rh)或?了 (Ru)中的至少一種。其材質(zhì)可以為韋巴(Pd)、鉬(Pt)、金(Au)、銀(Ag)、銥(Ir)、銘(Rh)或釕(Ru)的單質(zhì)金屬，或者也可以為例如鈀(Pd)-鎳(Ni)合金、鉑(Pt)-鎳(Ni)合金或金(Au)-镲(Ni)合金等。在合金的情況下，優(yōu)選相對于镲等對象金屬，上述金屬的比率高。這些金屬與例如鎳(Ni)等金屬相比，對CTC、稀少細胞等細胞的毒性非常低(圖1)。其理由在于，鈀(Pd)自身的毒性低，并且，Pd與鎳(Ni)的合金通過形成固溶體，能夠防止鎳(Ni)的溶出。其中，從金屬成本、低毒性的觀點出發(fā)，優(yōu)選鈀或鈀(Pd)-鎳(Ni)合金，在Pd-Ni合金的情況下，優(yōu)選Pd超過50% (重量)的合金，例如Pd80%-Ni20%的合金。Pd與Ni的合金過濾器、Pd過濾器等本實施方式的金屬過濾器具有耐酸性、耐熱性，能夠直接對過濾器進行FISH法等各種染色，并且能夠直接進行(正置)顯微鏡觀察。另外，具有硬度且耐久性高，即使不進行表面處理，細胞也不易粘附，因此，容易利用過濾器上的玻璃毛細管進行顯微操作(micromanipulat1n)(圖4B)。因此，本實施方式的金屬過濾器17具有能夠立即應對單細胞分離的自動化的優(yōu)良優(yōu)點。
[0056]金屬過濾器17的形狀只要能配置到安裝在CTC分離裝置的過濾單元中的過濾器圈(盒)上，則沒有特別限定，例如包括圓形、方形等形狀，優(yōu)選為圓形。另外，金屬過濾器17的尺寸可以考慮樣品(血液)量、孔徑、時間、流速、耐壓等物理因素、操作性、成本等來適當確定。例如，在處理5mL血液的情況下，直徑(圓形的情況下)或縱、橫的長度(方形的情況下)通常為約10?15mm，但也可以根據(jù)血液量將尺寸非限定性地設定為例如約5?20_的范圍。另外，金屬過濾器17的厚度考慮與孔密度、耐壓、成本等的關系來適當確定，通常為10?40 μπκ優(yōu)選為約15?40 μπι。
[0057]如圖2Α、圖2Β、圖2Ε所示，金屬過濾器17具有均勻且規(guī)則地配置的多個孔101。該孔101形成在后述的凹坑102中。每Cm2過濾器表面積的孔101的密度根據(jù)格子排列、交錯排列等排列的形態(tài)而不同，通常為IX 14?2 X 10 5/cm2、優(yōu)選為5 X 14?I X 10 5/cm2。另外，孔101的孔徑具有不使CTC或稀少細胞通過、且能夠使血細胞等血液成分等、CTC或稀少細胞以外的體液細胞通過的尺寸。人類血細胞成分的大小(長徑)的直方圖分析的結(jié)果是，紅細胞為約6?7 μ m，白細胞為約7?9 μ m，血小板小于5 μ m，與此相對，CTC或稀少細胞為約10?20 μπι。因此，孔101在凹坑102中的開口位置的孔徑通常為約7?10 μπκ優(yōu)選為約7.5?9 μ m、進一步優(yōu)選為約7.5?8.5 μ m。
[0058]金屬過濾器17還具有能夠捕捉CTC或稀少細胞的大小的凹坑102 (或凹部)。凹坑102的尺寸只要是能夠捕捉CTC或稀少細胞的尺寸即可，非限定性地例如直徑為20?30 μπι且深度為5?15 μm，優(yōu)選直徑為25?30 μπι且深度為10 μπι。上述的凹坑102可以形成在上述的全部或一部分的孔101的上部，為了維持高的孔密度，優(yōu)選這樣的形態(tài)。深度小于5 μ--時，CTC無法進入。為了使CTC幾乎完全進入，需要至少約5?15 μπι的深度。這樣的凹坑102的數(shù)量相對于孔101的數(shù)量優(yōu)選為80?100%、進一步優(yōu)選為100% (即，在所有的孔101的上部存在凹坑102)。
[0059]金屬過濾器17中，孔101 “規(guī)則地配置”為盡可能達到高密度的配置，是指所有的孔101以特定的規(guī)則性排列。這樣的規(guī)則性包括例如格子狀的排列、交錯格子的排列、放射狀的排列、同心圓狀的排列等(圖2Α、圖2Β和圖2C)。圖2Α、圖2Β(交錯格子排列)中，在孔101的上部形成有深度10 μπι的凹坑102，整體上形成立體結(jié)構，因此，在本說明書中，將這樣的形態(tài)的過濾器稱為3D過濾器。另一方面，圖2C (格子排列)中，在孔101的上部存在深度I ym的凹坑，但整體上具有接近于平面的結(jié)構，因此，在本說明書中，將這樣的凹坑的深度小于5 μ m的形態(tài)的過濾器稱為2D過濾器。該2D過濾器相當于日本特開2011-163830號公報的圖5所示的尺寸選擇性微腔陣列。該2D過濾器的凹坑相對于CTC或稀少細胞的大小而言過淺，因此，無法將孔中捕獲的該CTC或稀少細胞與周圍的殘留血液細胞隔離。與此相對，本實施方式的金屬過濾器17為3D過濾器，通過設置凹坑102，基于I)能夠在沒有血細胞污染的情況下將CTC逐個地排列(圖案化)；2)利用在一定的條件下產(chǎn)生的與重力反向的流動，優(yōu)化與水壓的平衡，由此能夠控制細胞被孔101捕獲的強度；等理由，通過操作能夠準確且簡便地進行輕柔的單細胞選取(圖4A)。但是，凹坑102的深度過深時(超過15 μ m時)，雖然對CTC的回收率、過濾速度沒有影響，但會相反地使單細胞圖案化變得不完全，在選取時可能會產(chǎn)生形成阻力等不良情況。
[0060]金屬過濾器17的周緣優(yōu)選以無孔的方式進行了鑲邊。通過存在緣部，CTC計測變得準確，另外，能夠使用鑷子夾持而不損傷金屬過濾器17。另外，通過設置凹坑102，有時會因電鑄的條件而使金屬過濾器17略微產(chǎn)生翹曲，但如果通過超聲波熔敷等從上下鑲有聚碳酸酯等支撐材料，則能夠矯正翹曲。
[0061]本實施方式的金屬過濾器17例如可以利用LIGA(Lithogaphie GalvanoformungAbfomung，光刻電鍍模塑)技術來制作(服部正、表面技術、Vol.62，N0.12，619-624，2011 ；ff.Elufeld and H.Lhe, Radiat.Phys.Chem.，45 (3): 340-365，1995)。作為一例，可以通過如下方法來制作電鑄過濾器，該方法包括:在基板上層疊抗蝕劑、吸收材料(任選成分)、掩模，照射紫外線、X射線或同步加速放射光(、> y夕口卜口 y放射光)而形成抗蝕劑圖案后，進行以基板作為電極進行電鑄的金屬鍍敷，在殘留預定開孔的時刻結(jié)束電鑄，進一步進行抗蝕劑的除去(參考圖8A?圖8F)。
[0062]2.末梢循環(huán)腫瘤細胞(CTC)或稀少細胞分離用裝置
[0063]本實施方式還提供用于從血液等體液中分離CTC或稀少細胞的裝置，其特征在于，具備多孔性的金屬過濾器17。
[0064]多孔性的金屬過濾器17已在上述1.的部分中進行了說明。從成本等方面考慮，優(yōu)選的過濾器為鈀(Pd)過濾器或鈀(Pd)-鎳(Ni)合金過濾器。
[0065]在本實施方式的裝置中，以使流路相對于金屬過濾器17垂直的方式安裝該金屬過濾器17。金屬過濾器17通常以可裝卸或不可裝卸的方式設置在過濾器盒16上，該過濾器盒16固定在裝置上。過濾器盒16由具備具有用于固定金屬過濾器17的適當寬度的緣且內(nèi)側(cè)形成開放空間的上下兩片構件(上、下過濾器圈)構成，金屬過濾器17被固定在該構件之間。根據(jù)需要，可以在該構件與金屬過濾器17之間夾入襯墊(例如，特氟龍(注冊商標)、橡膠、紙等)，由此，能夠防止金屬過濾器17的變形和漏液(圖3B?圖3C)。過濾器盒16的構件由樹脂(聚合物)、橡膠、金屬等材質(zhì)構成，兩個構件中設置有用于固定過濾器的機構。這樣的機構可以列舉例如螺紋等?；蛘?，過濾器盒16也可以為單純地通過來自上下的壓力將金屬過濾器17固定(壓入)的結(jié)構?；蛘?，也可以以金屬過濾器17與過濾器盒16成為一體的方式制作過濾器盒16，這種情況下，金屬過濾器17以無法拆卸的方式固定在過濾器盒16上。
[0066]除了包含安裝有金屬過濾器17的過濾器盒16的過濾單元11以外，裝置還可以進一步包括儲存單元10、流量調(diào)節(jié)單元12和廢液回收單元14 (儲液瓶)(圖3A)。
[0067]儲存單元10為裝入血液等體液樣品的容器，由玻璃、聚合物等能夠辨別液面的(例如透明的)材質(zhì)構成，根據(jù)需要，可以具有液量(即計量)刻度。
[0068]過濾單元11已在上文進行了說明，包括用于以可裝卸的方式安裝金屬過濾器17的過濾器盒16。
[0069]流量調(diào)節(jié)單元12具有用于對從儲存單元10、包含過濾器盒16的過濾單元11中通過并由于自重(即重力)而自然流下的血液等體液的流量或流速進行調(diào)節(jié)的裝置。這樣的裝置例如為具有銳角結(jié)構的尖端的旋入式凸型螺栓，將螺栓旋緊時，壓迫廢液管，流量減少或者為零(停止)，另一方面，打開螺栓時，流量增加。螺栓例如由金屬、樹脂、聚合物等材質(zhì)構成。
[0070]廢液回收單元14包含對過濾后的血液等體液、清洗裝置時的廢液等進行回收的容器(儲液瓶)。該廢液回收單元14例如由玻璃、樹脂、聚合物、金屬等材質(zhì)構成。
[0071]關于各單元間的固定，例如，可以利用通過旋轉(zhuǎn)進行安裝或拆卸的螺栓機構9(圖3A)來進行固定，也可以利用插入式的間隙配合18 (圖3C)來進行，或者，也可以利用其他慣用的固定工具來進行。此外，在上述各單元的基礎上，還可以設置用于設置將單元組裝而成的結(jié)構體的支架。
[0072]將裝置的一例示于圖3A (外觀)、圖3B (構成部件)和圖3C(組裝時的裝置的主視圖)中。圖中，過濾單元11包含過濾器盒16。流量調(diào)節(jié)單元12包含液量調(diào)節(jié)螺栓8。廢液回收單元14在其上面設置有儲液蓋13，在其側(cè)面上部設置有空氣孔7。裝置中還包含支架15。
[0073]從加工容易性、成本的方面考慮，優(yōu)選裝置的整體由丙烯酸樹脂等樹脂或聚合物形成。如果是透明的材質(zhì)，則能夠監(jiān)控液體的流下速度，因此優(yōu)選。關于裝置的大小，在不包括支架15的組裝結(jié)構體的情況下，為橫寬約10?15cm、高度約20?30cm、適合過濾約5?7.5mL的血液樣品的尺寸，即使在樣品的容量大的情況下，通過分成小份來施加，以該尺寸也能夠充分應對。
[0074]另外，以上的記載為試制機的規(guī)格，對于量產(chǎn)型機則另當別論，依照該試制機制作模具，例如利用樹脂、塑料等材料進行制作，因此，能夠生產(chǎn)低成本的一次性裝置。
[0075]本實施方式的裝置為利用自重(重力)獲得用于過濾的流速的無泵(即不使用泵)方式，因此為開放體系。這與公知的過濾器型CTC分離裝置中采用的泵式或負壓管式的驅(qū)動力不同。在這些以往的方式中，存在對細胞造成應激、或者由于細胞的固定、流路的密閉性而難以分離活細胞的單細胞等問題，但本實施方式的裝置能夠解決這些問題。
[0076]通過細胞毒性非常低的鈀等在金屬過濾器17中的應用、該金屬過濾器17的超高孔密度、平坦表面加工以及金屬過濾器17的3D化，本實施方式的裝置即使不對血液等體液進行預處理，也能夠在將CTC或稀少細胞被孔101捕獲的流速維持于較低流速的狀態(tài)下進行血液細胞的高速過濾。具體而言，包括清洗在內(nèi)能夠用約30分鐘將5ml的全血進行高速過濾，但從孔101中通過的流速卻較慢。另外，由于孔101具有極為平滑的表面性狀，因此對細胞造成的應激、傷害性低。
[0077]其結(jié)果，能夠在血細胞等的污染少的狀態(tài)下使CTC或稀少細胞進行排列。而且，通過在孔101的上方設置凹坑102，認為在一定的條件下會發(fā)生在流體力學上與重力反向的流動。因此，CTC不會很深地被孔101捕獲，因而能夠?qū)TC施加的剪切應力抑制在最低限度。因此，能夠?qū)TC或稀少細胞的細胞傷害抑制在最低限度，能夠以幾乎100%的存活率且以約80%以上的回收率分離CTC或稀少細胞。
[0078]3.末梢循環(huán)腫瘤細胞(CTC)或稀少細胞分離方法
[0079]本實施方式還提供使用上述中說明的安裝有金屬過濾器17的裝置從癌癥患者的體液中分離CTC或稀少細胞的方法。
[0080]具體而言，該方法為一種從體液中分離CTC或稀少細胞的方法，其中，包括:向本實施方式的裝置中注入癌癥患者的、選自例如血液、腹水、腹腔清洗液、腦脊液或淋巴液中的體液；以及通過僅依賴于重力的流速將CTC或稀少細胞分離到金屬過濾器17的上部。
[0081]作為樣本的癌癥患者的體液為含有CTC或稀少細胞的體液或者疑似含有CTC或稀少細胞的體液，主要為血液或淋巴液。
[0082]CTC或稀少細胞的分離中使用的體液的量(體積)通常為I?20mL，優(yōu)選為3?7mL。通常，體液(特別是血液)在使用磷酸緩沖生理鹽水(PBS)(根據(jù)目的使用含有0.25?ImM EDTA的PBS)稀釋例如2?20倍后進行過濾。特別是在血液量、血細胞數(shù)多的情況下，可以進行以下的預處理。
[0083]預處理例如包括:將體液與含有磁性納米粒子的陽離子性核糖體(MCL)混合，使體液中的CTC或稀少細胞和白細胞中攝入該磁性納米粒子后，注入到通入本實施方式的金屬過濾器17的流路中，利用配置在流路中途的磁石將未被磁化的紅細胞等細胞預先從該體液中除去(預過濾)。該預處理利用了如下性質(zhì):通常，紅細胞中不攝入磁性納米粒子，另一方面，CTC或稀少細胞、白細胞中攝入磁性納米粒子。通過該預過濾將紅細胞除去，解除磁力后，將CTC或稀少細胞和白細胞導入到該過濾器裝置中，由此，能夠在大幅減慢金屬過濾器17的流速的狀態(tài)下將白細胞除去，因此，CTC或稀少細胞殘留在金屬過濾器17的凹坑102中而不會被孔101強力地捕獲。在組合使用這樣的預處理和利用本實施方式的金屬過濾器17的處理的情況下，與單獨進行利用金屬過濾器17的處理的情況相比，對CTC或稀少細胞施加的剪切應力減小，能夠以更高的回收率(80?90% )進行回收(圖5A、圖5B)。
[0084]該方法是將體液注入到裝置中、通過重力下的流速進行過濾的簡單方法，但通過使用超高孔密度(例如，5X104?1.5X105/cm2)的3D金屬過濾器17，能夠?qū)崿F(xiàn)可容許的充分的快速處理。例如，包括清洗在內(nèi)能夠用約30分鐘處理約5.0mL的樣本(全血)。清洗液使用磷酸緩沖生理鹽水(PBS)，但根據(jù)需要也可以EDTA。
[0085]接著，為了對金屬過濾器17上的CTC或稀少細胞的數(shù)量進行計測，使用與CTC或稀少細胞特異性結(jié)合的熒光標記抗體例如Alexa488標記的抗EpCAM抗體、或與白細胞特異性結(jié)合的PE標記的抗CD45抗體等抗體混合物，對CTC或稀少細胞進行染色，利用顯微鏡計測CTC或稀少細胞的個數(shù)等。此時，染色可以直接在固定于裝置上的金屬過濾器17上進行。
[0086]染色后，將過濾器盒16從裝置中取出，直接使用過濾器盒16在正置型熒光顯微鏡下計數(shù)CTC數(shù)，進而，可以使用包含微細的玻璃毛細管的操作器將CTC或稀少細胞從金屬過濾器17的凹坑102中逐個回收。另外，用于考察有無基因擴增的FISH法可以通過將金屬過濾器17從過濾器盒16上取出并直接固定來進行。
[0087]另外，本實施方式的3D Pd-Ni合金過濾器裝置也可以用于荷瘤小鼠的末梢血中的CTC的測定。本發(fā)明人使用導入有GFP的大腸癌細胞系(COLM5-EGFP)、胃癌細胞系(GCIY-EGFP)等的皮下移植自然轉(zhuǎn)移模型，制作了能夠以良好的重現(xiàn)性檢測CTC的多個系的CTC模型(小鼠)。采集移植I?3個月后的小鼠后腔靜脈血，使用本實施方式的3DPd-Ni合金過濾器裝置進行過濾，以GFP熒光作為指標測定CTC數(shù)。結(jié)果確認，在小鼠血液中，與轉(zhuǎn)移的程度相關地檢測到CTC (圖6A、圖6B)。此外還確認，從回收的數(shù)個CTC中提取RNA、DNA,能夠?qū)μ囟ǖ幕虻谋磉_、基因突變進行分析。
[0088]進而，對于乳腺癌患者和胃癌患者等的實際的臨床樣本(末梢血)，也使用本實施方式的3D Pd-Ni合金過濾器裝置進行過濾，并測定了 CTC染色后的CTC數(shù)，結(jié)果，與小鼠CTC模型同樣，在轉(zhuǎn)移性患者樣本中，與正常人的血液相比，檢測到顯著多的CTC，從而也確認了本實施方式在臨床樣本中的有效性(圖7A、圖7B、圖7C)。
[0089]由上可以期待，本實施方式的方法今后在轉(zhuǎn)移復發(fā)的早期診斷、伴隨診斷和藥劑的治療效果的評價等轉(zhuǎn)移癌的診斷和治療方法這兩方面擔負重要的作用。另外可以預料，本實施方式的裝置和方法對于CTC在生物體內(nèi)的動態(tài)等轉(zhuǎn)移機制的闡明等基礎研宄也很有用。
[0090]實施例
[0091]以下示出實施例進一步對本實施方式進行詳細說明，但本實施方式的技術范圍不受這些具體例的限制。
[0092][實施例1]
[0093][鈀鎳過濾器的制造方法]
[0094]如圖8A所示，在基板19上以預定的厚度涂布感光性抗蝕劑20。需要說明的是，在使用不具有導電性的硅基板、玻璃基板作為基板19的情況下，附加導電膜層(例如銅)，但也可以為不銹鋼基板、鎳基板、銅基板等具有導電性的基板。
[0095]接著，如圖SB所示，通過描繪有預定圖案的Cr掩模21照射紫外線22，由此實施曝光。在此，在使用X射線代替紫外線22作為光源的情況下，使用X射線掩模代替Cr掩模
21ο
[0096]接著，如圖8C所示，經(jīng)過顯影工序?qū)⒏泄庑钥刮g劑20在基板19上圖案化。
[0097]接著，如圖8D所示，利用電鑄使鈀鎳合金(Pd-Ni) (Pd:Ni重量比、例如80:20)的析出成膜23從基板19的表面析出，以覆蓋圖案化的感光性抗蝕劑20的方式利用電鑄連續(xù)地實施Pd-Ni的析出成膜23的析出，在殘留預定的開孔24的時刻結(jié)束電鑄。
[0098]接著，如圖8Ε所示，利用有機溶劑將形成的感光性抗蝕劑20除去。該感光性抗蝕劑20的除去可以利用使用氧等離子體進行的干法蝕刻。
[0099]最后，如圖8F所示，將基板19剝離或蝕刻除去。
[0100]經(jīng)過這樣的工序，制成了鈀鎳過濾器(也稱為“3D過濾器”或“Pd-Ni過濾器”)。
[0101][實施例2]
[0102][鈀鎳過濾器的特征化]
[0103]該鈀鎳過濾器通過利用單獨且高度的電鑄技術進行微細加工而制作，因此，與其他的聚碳酸酯、聚對二甲苯或硅制的過濾器相比，能夠?qū)崿F(xiàn)100000/cm2以上的高孔密度和10%以上、通常為50%以上的高孔隙率。由此，能夠進行全血的高速過濾，也不會堵塞，能夠?qū)崿F(xiàn)CTC的高效且快速的回收(圖2A和圖2B)。另外，通過平滑的表面性狀、孔的均勻性等高精度的加工以及以細胞毒性少的鈀為材質(zhì)，還能夠大幅減小細胞損傷(圖1A、圖1B)。
[0104]另外，本鈀鎳過濾器能夠進行121°C、30分鐘的熱處理(Autoclave，高壓釜)，而且在利用次氯酸(市售的夕一)、1當量鹽酸進行的化學藥品耐性試驗(I小時)中，形狀沒有任何變化，另外，在CTC回收率等功能方面也未見變化。由此，能夠進行滅菌處理，能夠?qū)崿F(xiàn)醫(yī)療領域中的利用、再利用等低成本化。
[0105][實施例3]
[0106][使用培養(yǎng)癌細胞的細胞加標(CellSpike)實驗]
[0107]將人類胃癌細胞MKN-45、GCIY和人類大腸癌細胞COLM-5以1.0 X 16個/1cm皿接種到含有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中，在37°C /5% CO2的條件下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)3?4天后，抽吸除去培養(yǎng)基，用PBS(pH7.2)清洗后，添加0.2%胰蛋白酶/2mM EDTA，在370C /5% CO2的條件下溫育3?5分鐘。鏡檢確認細胞已從皿上剝離，加入含有血清的RPMI培養(yǎng)基，終止胰蛋白酶的作用后，進行吹吸，并回收細胞。將回收的細胞離心分離(1200rpm、3分鐘)，抽吸除去上清并重懸到新鮮的RPMI培養(yǎng)基中。通過使用臺盼藍(卜y/《>7''少一)的色素排除法計數(shù)活細胞數(shù)，制備成IX 16細胞/ml后，接種到新皿中。
[0108]細胞捕捉(Cell Spike，細胞加標)實驗中，使用作為在人類大腸癌細胞C0LM-5和人類胃癌細胞GCIY中強制表達綠色熒光蛋白(GFP)基因的細胞系的C0LM5-EGFP細胞、GCIY-EGFP細胞。使用如上制備的細胞懸浮液，在從正常人采集到裝有EDTA2Na的真空采血管內(nèi)的血液2?2.5ml中混合50、500或5000個培養(yǎng)癌細胞來準備樣品。
[0109][利用過濾器裝置的培養(yǎng)癌細胞的分離方法和檢測操作]
[0110]在安裝有3D過濾器的CTC分離裝置的儲存單元中導入含有ImM EDTA/0.5% BSA的PBS 5ml而對儲存和過濾器進行清洗后，將添加有導入或未導入GFP的培養(yǎng)癌細胞(50、500或5000個)的血液(2?2.5ml)用PBS稀釋5?10倍并導入。約10分鐘的過濾后，為了清洗殘留的血細胞成分，導入5ml PBSo在未導入GFP的培養(yǎng)癌細胞的情況下，使PBS清洗液流盡后，旋緊液量調(diào)節(jié)螺栓，關閉流路后，導入500 μ I的細胞染色液(Alexa488標記的抗EpCAM抗體、PE標記的抗CD45抗體和Hoechst33342 ;分別為0.5 μ g/ml)。在導入有GFP的培養(yǎng)癌細胞的情況下，導入由后兩者構成的細胞染色液。避光在室溫下反應30分鐘后，打開液量調(diào)節(jié)螺栓，排出細胞染色液。向儲存器中導入5ml含有ImM EDTA/0.5% BSA的PBS，對過濾器上的細胞進行清洗。僅使用PBS再進行一次該操作，旋緊液量調(diào)節(jié)螺栓后，立即將過濾器盒從CTC分離裝置中取出，向過濾器盒上部的儲液部中添加100?200 μ I的PBS，放置到顯微鏡載物臺上，直接進行熒光顯微鏡觀察。
[0111]為了對不具有透光性的金屬過濾器上捕捉、回收的癌細胞進行觀察，使用裝備有制冷C⑶相機(R1-1 ;尼康)的正置反射熒光顯微鏡(Eclipse LV100ND ;尼康)，為了對來自Hoechst33342、Alexa488、PE的熒光進行觀察，使用UV-1A、FITC、Cy3濾光片，分別獲取圖像。圖像獲取和分析軟件使用NIS-Elements (尼康)。
[0112][使用過濾器裝置的培養(yǎng)癌細胞的回收率的研宄]
[0113]在安裝有3D過濾器的CTC分離裝置中具有液量調(diào)節(jié)螺栓，通過對因自重而流過的液量進行調(diào)節(jié)，能夠控制流速。使用混合有500個培養(yǎng)癌細胞的10倍稀釋血液(將2.5ml的血液用PBS稀釋10倍)，對以2ml/分鐘、4ml/分鐘或8ml/分鐘改變流速時的回收率進行研宄。3D過濾器使用凹坑的直徑30 μπκ凹坑的深度10 μπκ孔的直徑8 μπκ孔密度99178/cm2、交錯格子排列的Pd-Ni過濾器。其結(jié)果，在2ml/分鐘、4ml/分鐘時分別顯示出約90%、80%的高回收率，但在8ml/分鐘時，為70%以下。可知在2?4ml/分鐘的流速下能夠得到80?90%的回收率，因此，以下的實驗以該范圍的流速進行(圖5A)。
[0114]接著，將2.5ml的血液用PBS稀釋10倍，混合10、50、500或5000個培養(yǎng)癌細胞，研宄癌細胞的回收率。裝置的流速為2ml/分鐘。從混合有50、500、5000個細胞的稀釋血液中回收的回收率為85?95% (圖5B)。從僅混合有10個細胞的稀釋血液回收的回收率平均為70%，考慮到細胞數(shù)的計數(shù)的偏差，表明即使是少數(shù)的細胞也具有高回收效率。
[0115][回收的細胞的存活率的研宄結(jié)果]
[0116]將混合有5000個培養(yǎng)癌細胞的稀釋血液(將2.5ml的血液用PBS稀釋10倍)用3D過濾器進行分離，通過使用臺盼藍的色素排除法對捕捉到的細胞的存活率進行計數(shù)。3D過濾器使用凹坑的直徑30 μ m、凹坑的深度10 μ m、孔的直徑8 μ m、孔密度99178/cm2的Pd-Ni過濾器。回收的細胞的存活率為99%，表明其為細胞傷害性非常低的回收方法。其中，在ImM以上的EDTA存在下進行過濾的情況下，觀察所回收的癌細胞的增殖性時，與對照(未添加EDTA)相比顯著低。但是，如果使用肝素作為抗凝劑、使用膠原蛋白包被皿來促進粘附，則增殖性顯著恢復。因此，認為在EDTA存在下進行過濾時回收癌細胞的增殖性降低的原因與其說是由過濾器裝置引起的應激，還不如說是長時間的EDTA處理。
[0117][使用3D過濾器的培養(yǎng)癌細胞的單細胞回收的研宄]
[0118]為了提高癌細胞的捕捉、排列和回收的效率，將金屬過濾器加工成如圖2A所示在貫通孔的上部設置有凹坑的3D形狀。該形狀期望直徑為20?30 μ m、深度為5?15 μ m，在使用尖端直徑加工為約40 μπι的玻璃毛細管對捕捉到的細胞進行抽吸回收的情況下，凹坑的直徑為30 μπι時最容易進行回收。關于凹坑的深度，如果將5 μπι與10 μπι進行比較，則深度為10 μπι時，與深度為5 μπι時相比，即使由于操作器等而使液面移動，細胞也不易從捕捉其的凹坑中移動出來，因此，能夠穩(wěn)定且無污染地回收作為目標的單細胞(圖4Β中示出了使用操作器回收I個癌細胞時的亮視野圖像)。使用肝素作為抗凝劑時，細胞對金屬過濾器的粘附性增強(需要說明的是，在EDTA存在下細胞對金屬過濾器幾乎不顯示粘附性)、利用操作器的細胞的回收率降低。因此，認為需要根據(jù)目的區(qū)別使用抗凝劑。
[0119][實施例4]
[0120][從CTC模型小鼠進行的CTC分離]
[0121]體外的培養(yǎng)細胞與體內(nèi)的CTC的細胞生存環(huán)境顯著不同，因此，僅通過在正常人血液中添加培養(yǎng)癌細胞的細胞加標實驗，難以準確地評價CTC分離裝置的性能。另一方面，對于患者的臨床樣本而言，如果不收集癌癥的進行度(stage，期)不同的多數(shù)病例、對其進行測定并進行統(tǒng)計性分析，則難以評價裝置的性能。與此相對，如果存在在癌細胞移植后隨時間推移以具有重現(xiàn)性的方式出現(xiàn)CTC的小鼠(以下稱為“CTC模型小鼠”)，則可望對CTC分離裝置的性能進行快速且準確的評價。另外，CTC模型小鼠對CTC在生物體內(nèi)的動態(tài)分析等CTC的基礎研宄也極為有用。因此，單獨進行了 CTC模型小鼠的制作。
[0122][CTC模型小鼠的制作及使用其的過濾器裝置的評價]
[0123]將通過導入GFP基因而發(fā)出高亮度的綠色熒光的、轉(zhuǎn)移性高的胃癌細胞系(GCIY-EGFP)和大腸癌細胞系(COLM5-EGFP)分別移植到裸鼠的皮下。經(jīng)時后處決小鼠，從后腔靜脈采取0.5?1.0ml的血液，用PBS稀釋10倍后，使用CTC分離裝置測定CTC。同時使用倒置型熒光顯微鏡研宄有無肺、肝、腎等的微小轉(zhuǎn)移。在大腸癌COLM5-EGFP皮下移植模型中，直至移植后I?2個月為止，肺轉(zhuǎn)移限于少數(shù)的微小轉(zhuǎn)移，CTC數(shù)也幾乎為O (零)，為偶爾檢測到I?2個CTC的程度。另一方面，在移植后2?3個月，肉眼也可觀察到肺轉(zhuǎn)移，少數(shù)在肝、腎也觀察到轉(zhuǎn)移，此時檢測到約10?100個CTC，多時檢測到1000個以上的CTC (結(jié)果示于圖6A和圖6B中)。在胃癌GCIY-EGFP皮下移植模型中，也與肉眼的轉(zhuǎn)移和全身轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)相應地檢測到CTC。使用該裝置在使用小鼠Lewis肺癌細胞系(Lewis-GFP)的肺癌模型中也同樣地進行實驗，明確了 CTC的出現(xiàn)與向肝、腎等的多器官轉(zhuǎn)移同步。由CTC與肉眼的轉(zhuǎn)移、全身性轉(zhuǎn)移同步出現(xiàn)暗示，CTC檢測可能對癌癥轉(zhuǎn)移的早期診斷有用。另外，由使用CTC模型小鼠的研宄表明，該裝置具有能夠準確地捕捉CTC在生物體內(nèi)動態(tài)的充分的靈敏度和精度。
[0124]對從模型小鼠分離的CTC進行各種基因分析。免疫熒光染色中，可以直接在金屬過濾器上進行染色，在HER2陽性胃癌荷瘤小鼠CTC中能夠檢測到HER2的過量表達。對使用操作器回收的CTC進行了基因分析，結(jié)果確認，對于I個?數(shù)個CTC，從其中提取、擴增RNA、DNA,能夠進行利用RT-PCR法的HER2等的基因表達的分析、利用直接測序法的K-Ras等的基因序列的分析等。
[0125][實施例5]
[0126][從胃癌患者和乳腺癌患者的末梢血進行的CTC分離]
[0127]使用裝有EDTA2Na的采血管從4名胃癌患者、6名乳腺癌患者、4名正常人的肘靜脈進行5ml的采血。4名胃癌患者和6名乳腺癌患者為在愛知縣癌癥中心中央醫(yī)院(日本、名古屋)住院的患者。從患者進行的采血獲得了愛知縣癌癥中心倫理委員會(日本、名古屋)的許可，并在自患者處獲得同意書后進行。
[0128]從各人進行采血后，在I小時以內(nèi)用PBS稀釋10倍，施加到CTC分離裝置中，進行過濾。CTC分離裝置的金屬過濾器使用凹坑的直徑24μm、凹坑的深度10μm、孔的直徑8 μm、孔密度136325/cm2的3D Pd-Ni過濾器。過濾以2.5ml/分鐘的流速進行。將過濾器盒上的細胞用PBS清洗，用10%福爾馬林在室溫下固定10分鐘，清洗后，將含有Alexa488標記的抗EpCAM抗體、PE標記的抗⑶45抗體、以及根據(jù)情況使用的Alexa350標記的抗CKOscar抗體的細胞染色液添加到過濾器盒上，在室溫下反應30分鐘。進一步用PBS清洗后，用H0echst33342進行核染色。用PBS清洗后，將每個過濾器盒轉(zhuǎn)移到正置型熒光顯微鏡上，將 EpCAM+/ (CK Oscar+) /CD45-/Hoechst33342+細胞判定為 CTC，計測 CTC 數(shù)。結(jié)果，在正常人中4名的CTC均為O個，與此相對，在4名漸進性胃癌患者中分別為0、2、4、11個，6名漸進性乳腺癌患者中分別為1、3、4、11、15、22個。將胃癌患者的染色圖像示于圖7A中，將乳腺癌患者的染色圖像示于圖7B中，將CTC數(shù)的測定結(jié)果示于圖7C中。
[0129][實施例6]
[0130][利用磁性納米粒子的細胞的磁分離的組合使用]
[0131]使用胃癌細胞N87，以CTC的全部回收為目標，將使用磁性納米粒子的磁分離(預處理)和使用3D Pd-Ni過濾器的利用大小進行的分離組合使用，嘗試提高回收率。使磁性陽離子脂質(zhì)體(直徑150nm) 10pg/細胞與100個N87細胞的細胞懸浮液作用2小時，混合到含有20萬個白細胞的牛血清中后，使用組合有磁分離流路和過濾器的裝置進行捕捉。能夠捕捉回收約80?90%的細胞，與單獨使用過濾器相比，觀察到回收率的提高。
[0132]產(chǎn)業(yè)實用性
[0133]安裝有本發(fā)明的金屬過濾器的裝置以高回收率實現(xiàn)了血液等體液中的CTC或稀少細胞的分離，并且能夠?qū)TC或稀少細胞以接近無傷(intact)的狀態(tài)回收，因此，不僅能夠用于CTC數(shù)量的評價，而且能夠用于單一 CTC細胞的基因分析，能夠有效地用于轉(zhuǎn)移性復發(fā)的早期診斷、治療效果的監(jiān)測、體液活檢(Liquid b1psy)等的可能性高。
[0134](標號說明)
[0135]7…空氣孔
[0136]8…液量調(diào)節(jié)螺栓
[0137]9…螺栓機構(固定用)
[0138]10…儲存單元
[0139]11…過濾單元(其中包含過濾器盒)
[0140]12…流量調(diào)節(jié)單元
[0141]13…儲液蓋
[0142]14…廢液回收單元(儲液瓶)
[0143]15…支架
[0144]16…過濾器盒(也稱為過濾器圈)
[0145]17…金屬過濾器
[0146]18…間隙配合(插入式)
[0147]19…基板
[0148]20…感光性抗蝕劑
[0149]21 …Cr 掩模
[0150]22…紫外線
[0151]23...鈕(Pd)-鎳(Ni)合金的析出成膜
[0152]24…開孔
【權利要求】
1.一種末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其具備金屬過濾器，所述金屬過濾器具有能夠捕捉體液中的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞的凹坑、和形成于該凹坑且能夠使所述末梢循環(huán)腫瘤細胞或所述稀少細胞以外的體液細胞通過的孔。
2.如權利要求1所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其中， 所述金屬過濾器的材質(zhì)為鈀或鈀鎳合金。
3.如權利要求1或2所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其中， 所述凹坑的直徑為20?30 μ m，所述凹坑的深度為5?15 μ m。
4.如權利要求1?3中任一項所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其中， 所述孔的直徑為7?10 μ m。
5.如權利要求1?4中任一項所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其中， 所述凹坑和所述孔的孔密度為I X 14個/cm2?2 X 10 5個/cm 2。
6.如權利要求1?5中任一項所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其中， 所述金屬過濾器的厚度為10?40 μπι。
7.如權利要求1?6中任一項所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置，其具有用于安裝所述金屬過濾器的過濾器盒。
8.一種末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離方法，其中， 將選自癌癥患者的血液、腹水或腹腔清洗液中的體液注入到權利要求1?7中任一項所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離用裝置中，利用所述金屬過濾器的所述凹坑捕捉該體液中的所述末梢循環(huán)腫瘤細胞或所述稀少細胞后，在存活的狀態(tài)下進行回收。
9.如權利要求8所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離方法，其中， 進一步包括對所述末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞進行特異性染色。
10.如權利要求8或9所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離方法，其中， 包括對所述體液進行稀釋或預處理的步驟。
11.如權利要求10所述的末梢循環(huán)腫瘤細胞或稀少細胞分離方法，其中， 所述預處理包括以下的步驟:將所述體液與含有磁性納米粒子的陽離子性核糖體混合，使所述體液中的所述末梢循環(huán)腫瘤細胞或所述稀少細胞和白血球細胞中攝入所述磁性納米粒子后，注入到通入所述金屬過濾器的流路中，利用配置在所述金屬過濾器前方的磁鐵將未攝入磁性納米粒子的紅血球等細胞從該體液中除去。
【文檔編號】C12M1/26GK104520420SQ201480001457
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年7月23日 優(yōu)先權日:2013年7月24日
【發(fā)明者】中西速夫, 伊藤誠二, 絹田精鎮(zhèn), 市野澤義行, 游佐亞希子, 本多裕之, 大河內(nèi)美奈 申請人:株式會社奧普特尼克斯精密