生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，尤其涉及在同一個(gè)空間內(nèi)合并進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR：Polymerase Chain Reaction)及DNA微陣列而能夠進(jìn)行生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析的方法。
【專利說(shuō)明】生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，尤其涉及在同一個(gè)空間內(nèi)合并進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR:Polymerase Chain React1n)及DNA微陣列而能夠進(jìn)行生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)前在分子診斷中廣泛施行的分析物質(zhì)的靶基因檢查方法大體上有定量方法(quantitative method)和定性方法(qualitative)。
[0003]定量方法是相對(duì)地測(cè)量或者絕對(duì)地測(cè)量靶基因的表達(dá)程度和基因個(gè)數(shù)(copynumber)的方法。另一方面，定性方法是分析革El基因的存在與否以及基因型(genotyping)的方法。
[0004]作為定量檢查的方法有利用實(shí)時(shí)PCR(Real-time Polymerase Chain React1n)的方法。利用實(shí)時(shí)PCR的檢查方法具有能夠進(jìn)行定量分析的優(yōu)點(diǎn)，而且利用實(shí)時(shí)PCR的檢查方法可在試劑混合之后不開(kāi)封試管的情況下獲得基因擴(kuò)增信號(hào)，從而具有能夠減少由空氣引起的污染危險(xiǎn)的優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛使用。然而，難以進(jìn)行在一個(gè)試管內(nèi)可同時(shí)確認(rèn)的熒光數(shù)量為最多6個(gè)不同種類以上，因而在需要檢查數(shù)十個(gè)基因變異和基因型的領(lǐng)域的情況下，存在需要分配多個(gè)試管來(lái)進(jìn)行檢查的難點(diǎn)。
[0005]作為定性檢查的對(duì)靶的方法有利用DNA微陣列的方法。對(duì)于利用DNA微陣列的檢查方法而言，在表面固定多個(gè)靶探針，從而具有一次用一個(gè)種類的熒光能夠檢查多樣的基因型的優(yōu)點(diǎn)，然而卻存在不能進(jìn)行定量分析的局限性。
[0006]最近，正在研宄彌補(bǔ)這樣的定性檢查或定量檢查的缺點(diǎn)的定量及定性檢查方法。作為這種研宄的環(huán)節(jié)開(kāi)發(fā)出了如下種技術(shù)，即，在一個(gè)容器內(nèi)以實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行定量分析，并將擴(kuò)增的基因與固定于同一容器的固體底面的探針進(jìn)行反應(yīng)，由此使多重分析變?yōu)榭赡?。然而，?duì)于所述技術(shù)而言，存在為了獲取探針信號(hào)，在開(kāi)封容器或清洗容器后，需要利用專門的掃描器讀取信號(hào)的局限性。
[0007]作為現(xiàn)有技術(shù)有韓國(guó)公開(kāi)專利公報(bào)第10-2010-0102560號(hào)(2010.09.24.公開(kāi))，在上述文獻(xiàn)中公開(kāi)有實(shí)時(shí)核酸分析合并裝置及利用該裝置的靶核酸的檢測(cè)方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]技術(shù)問(wèn)題
[0009]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種可從固定有探針的生物芯片同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的定量及定性分析的方法，所述探針用于對(duì)在單一反應(yīng)容器內(nèi)利用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)而被擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析及鑒別革El基因。
[0010]技術(shù)方案
[0011]根據(jù)本發(fā)明的一方面可提供一種生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，包括如下步驟:(a)準(zhǔn)備生物物質(zhì)檢測(cè)用元件，該生物物質(zhì)檢測(cè)用元件包括上部形成有開(kāi)口部的反應(yīng)容器和通過(guò)所述開(kāi)口部而可裝卸于所述反應(yīng)容器的元件部，其中所述元件部包括結(jié)合于所述反應(yīng)容器的開(kāi)口部的蓋和朝所述蓋的下部延伸而形成的桿，所述桿具有表面固定有第三探針的生物芯片；(b)向所述反應(yīng)容器內(nèi)添加包含第一探針-第二探針復(fù)合體、正向引物、反向引物、堿磷酸去氧核苷酸(dNTP，deoxynucleotide triphosphate)、具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶、包含靶基因的樣本及緩沖溶液的反應(yīng)溶液，其中，所述第一探針包含互補(bǔ)于所述樣本內(nèi)靶基因的核酸序列的寡核苷酸(oligonucleotide)序列，且包含能夠產(chǎn)生第一熒光信號(hào)的第一熒光體和能夠猝滅所述第一熒光體的第一猝滅體，所述第二探針包含互補(bǔ)于所述第三探針的寡核苷酸序列，而不包含互補(bǔ)于所述樣本內(nèi)靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列，所述正向引物及所述反向引物是為了擴(kuò)增所述樣本內(nèi)靶基因而包含互補(bǔ)于所述靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列的引物；(C)進(jìn)行包含所述樣本內(nèi)靶基因的變性反應(yīng)、所述樣本內(nèi)靶基因和所述復(fù)合體、所述正向引物及所述反向引物的雜化反應(yīng)以及由具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶引起的所述引物的延長(zhǎng)反應(yīng)的聚合酶鏈反應(yīng)，其中，通過(guò)所述雜化反應(yīng)而僅在所述靶基因和所述復(fù)合體中的所述第一探針之間進(jìn)行雜化反應(yīng)，在進(jìn)行由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的延長(zhǎng)反應(yīng)的期間，從所述復(fù)合體分解并釋放所述第二探針及所述第一熒光體；(d)被釋放的所述第二探針和固定于所述生物芯片的所述第三探針進(jìn)行雜化之后通過(guò)所述聚合酶而所述第二探針在所述第三探針上延長(zhǎng)，其中，所述第三探針包含能夠產(chǎn)生第二熒光信號(hào)的第二熒光體和能夠猝滅所述第二熒光體的第二猝滅體，隨著所述第二探針在所述第三探針上延長(zhǎng)，第二猝滅體從所述第二熒光體分開(kāi)而產(chǎn)生發(fā)光；以及(e)檢測(cè)由所述第一熒光體引起的第一熒光信號(hào)以及由所述第二熒光體引起的第二熒光信號(hào)。
[0012]發(fā)明效果
[0013]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，可消除根據(jù)基因型而需要數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)反應(yīng)容器(管)的現(xiàn)有技術(shù)的不便性和非經(jīng)濟(jì)型。
[0014]此外，本發(fā)明通過(guò)在單個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)實(shí)時(shí)地合并進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR及DNA微陣列而能夠同時(shí)進(jìn)行定量及定性分析。這也可以消除難以應(yīng)用于定量分析的DNA微陣列的缺點(diǎn)。
[0015]尤其，根據(jù)本發(fā)明的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法具有如下效果:在反應(yīng)容器內(nèi)實(shí)時(shí)地獲取DNA芯片信號(hào)，從而可在不開(kāi)封容器或不清洗容器的情況下進(jìn)行定量及定性分析，而且在包括感染性疾患檢查、耐藥性、體細(xì)胞突變、單一堿基變異等多種分子診斷領(lǐng)域中，可一次性地、經(jīng)濟(jì)地、可靠地、同時(shí)執(zhí)行定量分析和基因型檢查。
[0016]因此，根據(jù)本發(fā)明的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量定性分析方法不限于原來(lái)是定量分析的還是基因型檢查的檢查種類，可以在分子診斷的整個(gè)領(lǐng)域中容易使用的優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為概略地示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的生物物質(zhì)檢查元件的反應(yīng)容器的圖。
[0018]圖2為概略地示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的生物物質(zhì)檢測(cè)元件的元件部的圖。
[0019]圖3為示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的反應(yīng)容器與元件部結(jié)合的生物物質(zhì)檢測(cè)元件的圖。
[0020]圖4為概略地示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的生物物質(zhì)檢測(cè)元件內(nèi)的反應(yīng)的圖。
[0021]圖5為示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中所使用的聚合酶的活性溫度的圖。
[0022]圖6為示出在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中所進(jìn)行的實(shí)時(shí)PCR的延長(zhǎng)溫度條件的圖。
[0023]圖7為與根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的第三元件部相關(guān)而示出按照溫度變化的第二熒光信號(hào)的變化的圖。
[0024]圖8為與根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的第三元件部相關(guān)而示出按照時(shí)間變化的第二熒光信號(hào)的變化的圖。
[0025]圖9和圖10為概略地示出根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析過(guò)程的圖。
[0026]圖11至圖13為示出熒光信號(hào)檢測(cè)方法的示例的圖，其中圖11為示出直線型(trans type)熒光信號(hào)檢測(cè)方法的圖，圖12為示出傾斜型(oblique type)熒光信號(hào)檢測(cè)方法的圖，圖13為示出側(cè)面型(epi type)熒光信號(hào)檢測(cè)方法的圖。

【具體實(shí)施方式】
[0027]為了更加容易理解本發(fā)明，為方便起見(jiàn)在本申請(qǐng)中定義特定術(shù)語(yǔ)。除非在本申請(qǐng)中另外進(jìn)行定義，否則本發(fā)明所使用的科學(xué)術(shù)語(yǔ)以及技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的意思。此外，除非在上下文中特別指定，否則應(yīng)當(dāng)被理解為單數(shù)形態(tài)的術(shù)語(yǔ)也包含復(fù)數(shù)形態(tài)，復(fù)數(shù)形態(tài)的術(shù)語(yǔ)也包含單數(shù)形態(tài)。
[0028]此外，對(duì)于構(gòu)成本發(fā)明所公開(kāi)的任意的方法的各個(gè)步驟而言，除非明確地說(shuō)明為不同，否則并不表示必須要按照所記載的順序準(zhǔn)確地進(jìn)行，而且為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，可在本發(fā)明的技術(shù)思想的范圍內(nèi)進(jìn)行多樣地修改和變更。
[0029]以下，將詳細(xì)說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的生物物質(zhì)的定量及定性分析方法。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面可提供生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，包括如下步驟:(a)準(zhǔn)備生物物質(zhì)檢測(cè)用元件，該生物物質(zhì)檢測(cè)用元件包括上部形成有開(kāi)口部的反應(yīng)容器和通過(guò)所述開(kāi)口部而可裝卸于所述反應(yīng)容器的元件部，其中所述元件部包括結(jié)合于所述反應(yīng)容器的開(kāi)口部的蓋和朝所述蓋的下部延伸而形成的桿，所述桿具有表面固定有第三探針的生物芯片；(b)向所述反應(yīng)容器內(nèi)添加包含第一探針-第二探針復(fù)合體、正向(forward)引物、反向(reverse)引物、喊磷酸去氧核苷酸(dNTP:deoxynucleotidetriphosphate)、具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶、包含革E基因的樣本及緩沖溶液的反應(yīng)溶液，其中所述第一探針包含互補(bǔ)于所述樣本內(nèi)靶基因的核酸序列的寡核苷酸(oligonucleotide)序列，且包含能夠產(chǎn)生第一熒光信號(hào)的第一熒光體和能夠猝滅所述第一熒光體的第一猝滅體，所述第二探針包含互補(bǔ)于所述第三探針的寡核苷酸序列，而不包含互補(bǔ)于所述樣本內(nèi)靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列，所述正向引物及所述反向引物是為了擴(kuò)增所述樣本內(nèi)靶基因而包含互補(bǔ)于所述靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列的引物；(C)進(jìn)行包含所述樣本內(nèi)靶基因的變性反應(yīng)、所述樣本內(nèi)靶基因和所述復(fù)合體、所述正向引物及所述反向引物的雜化反應(yīng)以及由具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶引起的所述引物的延長(zhǎng)反應(yīng)的聚合酶鏈反應(yīng)，通過(guò)所述雜化反應(yīng)而僅在所述靶基因和所述復(fù)合體中的所述第一探針之間進(jìn)行雜化反應(yīng)，在進(jìn)行由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的延長(zhǎng)反應(yīng)的期間，從所述復(fù)合體分解并釋放所述第二探針及所述第一熒光體；(d)被釋放的所述第二探針和固定于所述生物芯片的所述第三探針進(jìn)行雜化之后通過(guò)所述聚合酶而所述第二探針在所述第三探針上延長(zhǎng)，其中，所述第三探針包含能夠產(chǎn)生第二熒光信號(hào)的第二熒光體和能夠猝滅所述第二熒光體的第二猝滅體，隨著所述第二探針在所述第三探針上延長(zhǎng)，第二猝滅體從所述第二熒光體分開(kāi)而產(chǎn)生發(fā)光；以及(e)檢測(cè)由所述第一熒光體引起的第一熒光信號(hào)以及由所述第二熒光體引起的第二熒光信號(hào)。
[0031]首先，公開(kāi)準(zhǔn)備用于應(yīng)用在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法的生物物質(zhì)檢測(cè)用元件的步驟(步驟(a))。
[0032]參照?qǐng)D1至圖3，所述生物物質(zhì)檢測(cè)用元件200包括上部形成有開(kāi)口部的反應(yīng)容器210和通過(guò)所述開(kāi)口部而可裝卸于所述反應(yīng)容器210的元件部220，其中所述元件部220包括結(jié)合于所述反應(yīng)容器210的開(kāi)口部的蓋221和朝所述蓋221的下部延伸而形成的桿222，所述桿具有表面固定有第三探針的生物芯片223。
[0033]此時(shí)，所述桿222朝下部延伸形成使其在以后的步驟(b)中向所述反應(yīng)容器210內(nèi)添加反應(yīng)溶液240時(shí)具有使所述生物芯片223能夠浸漬于所述反應(yīng)溶液的長(zhǎng)度。
[0034]所述生物芯片223可設(shè)置于選自所述桿222的外周面和下部的至少一個(gè)區(qū)域，在此，設(shè)置所述生物芯片223的至少一個(gè)區(qū)域位于能夠浸漬于所述反應(yīng)溶液的位置。
[0035]在一個(gè)實(shí)施例中，所述蓋221可由透光率為50%以上的物質(zhì)形成。此時(shí)，如直線型(trans type)熒光信號(hào)檢測(cè)方法那樣能夠在不開(kāi)放蓋的狀態(tài)下以所述蓋221上部方向檢測(cè)熒光信號(hào)。更具體地，所述蓋221可由選自玻璃、石英、煅制氧化硅(Fumed Silica)、丙烯酸、聚碳酸酯、環(huán)烯烴共聚物(COC)和環(huán)烯烴聚合物(COP)中的材料形成。
[0036]在另一實(shí)施例中，如傾斜性(oblique type)焚光信號(hào)檢測(cè)方法或側(cè)面性(epitype)熒光信號(hào)檢測(cè)方法那樣不會(huì)從所述蓋221的上部方向檢測(cè)熒光信號(hào)的情況下，所述蓋221的透光率沒(méi)有必要是50%以上。
[0037]并且，在一個(gè)實(shí)施例中，所述桿222可由具有9.0x 10_6/m.Κ以下的較低的熱膨脹系數(shù)的物質(zhì)形成。如果所述桿222的熱膨脹系數(shù)超過(guò)9.0x 10_6/πι.Κ，則整體上的元件部的耐久性降低，且有可能發(fā)生故障。優(yōu)選地，所述桿222可由具有5.5x 10_7/m.K?9.0xΙΟ—6/!!!.K以下的較低的熱膨脹系數(shù)的物質(zhì)形成。這是因?yàn)榭紤]到如下情形，即，如果桿的熱膨脹系數(shù)過(guò)低，則由于隨著溫度變化而與其他元件的熱膨脹系數(shù)之間的差異的存在，從而就精確檢測(cè)熒光而言可能變得困難。具有這種熱膨脹系數(shù)的材料的非限制性的示例有石英、煅制氧化硅、選自COC及COP中的至少一個(gè)高分子。
[0038]在一個(gè)實(shí)施例中，所述桿222具備其表面固定有所述第三探針的生物芯片223。此時(shí)，所述第三探針可根據(jù)5’末端或3’末端的高分子物質(zhì)而直接或間接地固定于所述生物芯片223。優(yōu)選地，所述第三探針的5’末端或3’末端的高分子物質(zhì)可以是聚-T尾部(poly-T tail)或聚-A尾部(poly-A tail)。并且，所述高分子物質(zhì)的末端，即固定于所述生物芯片223的部分，可根據(jù)所述生物芯片223的特性而改性為特定官能團(tuán)之后使用。
[0039]例如，所述生物芯片223由醛(CHO)涂層基板、異硫氰酸醋(isoth1cyanate)(NCS)涂層基板、環(huán)氧化物涂層基板、羧化基板或磷酸化基板構(gòu)成的情況下，可將所述第三探針的聚-T尾部或聚-A尾部的末端，即，固定于所述生物芯片223的部分胺化而使其固定于所述基板。另一方面，所述生物芯片223由胺化基板構(gòu)成的情況下，可將所述第三探針的聚-T尾部或聚-A尾部的末端，即，固定于所述生物芯片223的部分羧化或磷酸化而使其固定于所述基板。
[0040]如上所述，在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的方法中，步驟(a)的目的在于提供一種通過(guò)在一個(gè)單個(gè)反應(yīng)容器內(nèi)實(shí)時(shí)地合并進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR及DNA微陣列而能夠同時(shí)進(jìn)行定量及定性分析的生物物質(zhì)檢測(cè)用元件200。
[0041]在使用所述生物物質(zhì)檢測(cè)用元件200的情況下，可在所述元件部220結(jié)合于所述反應(yīng)容器210的狀態(tài)，即所述生物物質(zhì)檢測(cè)用元件200沒(méi)有被開(kāi)放的狀態(tài)下合并進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR及DNA微陣列。而且，在以多次的反復(fù)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR及DNA微陣列的期間，所述生物物質(zhì)檢測(cè)用元件200也以所述元件部220結(jié)合于所述反應(yīng)容器210的狀態(tài)，即，所述生物物質(zhì)檢測(cè)用元件200沒(méi)有被開(kāi)放的狀態(tài)存在，因此可由外部的污染因子隔絕，從而可以去掉需要反復(fù)清洗所述生物物質(zhì)檢測(cè)用元件200的必要性。
[0042]接著，公開(kāi)向所述反應(yīng)容器210內(nèi)添加反應(yīng)溶液的步驟(步驟(b))。此時(shí)，在所述步驟(b)中，將所述反應(yīng)溶液添加至使設(shè)置于所述桿222的所述生物芯片223，更具體地，固定(附著)于所述生物芯片223的第三探針能夠充分地浸漬于所述反應(yīng)溶液中。
[0043]此外，在選自所述桿222的外周面和下部中的至少一個(gè)區(qū)域中設(shè)有多個(gè)所述生物芯片223的情況下，將所述反應(yīng)溶液添加至使設(shè)置所述生物芯片223的至少一個(gè)區(qū)域，更具體地使固定(附著)在設(shè)置于所述至少一個(gè)區(qū)域的所述多個(gè)生物芯片223的所有的第三探針能夠充分地浸漬于所述反應(yīng)溶液中。在此，在所述反應(yīng)溶液(水溶性相)內(nèi)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，而在固定于所述生物芯片223的第三探針(固體表面相)中進(jìn)行DNA微陣列。
[0044]所述反應(yīng)溶液包含第一探針-第二探針復(fù)合體、正向(forward)引物、反向(reverse)引物、喊磷酸去氧核苷酸(dNTP:deoxynucleotide triphosphate)、具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶、包含革E基因的樣本及緩沖溶液。
[0045]所述第一探針包含互補(bǔ)于所述樣本內(nèi)靶基因的核酸序列的寡核苷酸(oligonucleotide)序列，且包含能夠產(chǎn)生第一熒光信號(hào)的第一熒光體和能夠猝滅所述第一焚光體的第一猝滅體。
[0046]所述第二探針包含互補(bǔ)于所述第三探針的寡核苷酸序列，而不包含互補(bǔ)于所述樣本內(nèi)靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列。
[0047]此時(shí)，對(duì)于所述第一探針及第二探針的長(zhǎng)度而言，能夠與各個(gè)靶基因及第三探針形成適宜的二聚體(dimer)的程度的長(zhǎng)度即可，其長(zhǎng)度不受特別限制。例如，所述探針的大小可在15mer?50mer之間適宜地選擇，但不是必須受限于此。
[0048]此外，所述第一探針及所述第二探針將相同或不同的靶基因設(shè)定為靶(target)，從而可構(gòu)成為包含互不相同的寡核苷酸序列的探針。即，可使用由將所述靶基因的單個(gè)或多個(gè)靶區(qū)域作為目標(biāo)或者將多個(gè)靶基因的單個(gè)或多個(gè)靶區(qū)域作為目標(biāo)的所述第一探針及第二探針構(gòu)成的相互不同的復(fù)合體。
[0049]例如，第一探針⑴與第二探針⑴形成復(fù)合體，而第一探針⑴與第二探針(Y)形成復(fù)合體。在此，所述第一探針⑴可以與所述靶基因的互補(bǔ)的靶區(qū)域⑴進(jìn)行雜化，且所述第一探針(Y)可以與所述靶基因的互補(bǔ)的靶區(qū)域(Y)進(jìn)行雜化。并且，包含于所述第一探針(X)的所述第一熒光體(X)和包含于所述第一探針(Y)的所述第一熒光體(Y)可包含產(chǎn)生在相互不同的波長(zhǎng)帶上被檢測(cè)到的熒光信號(hào)的熒光物質(zhì)。
[0050]追加地，所述第三探針也可以使用為多個(gè)。S卩，第三探針(X)可以與所述第二探針(X)雜化，且第三探針⑴可以與所述第二探針⑴雜化。
[0051]本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)“探針”表示包含可被雜化于特定核苷酸序列的脫氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide)和核糖核苷酸(ribonucleotide)的自然或變形的單體或具有結(jié)合的線性的低聚物。優(yōu)選地，為了在雜化中的最大效率，探針是單鏈。探針優(yōu)選為脫氧核糖核苷酸。
[0052]本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)“核苷酸”或“多核苷酸”是以單鏈或雙鏈形態(tài)存在的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，在沒(méi)有特別提及的情況下，包含自然的核苷酸的類似物。
[0053]在此，所述反應(yīng)溶液內(nèi)第一探針及第二探針以復(fù)合體狀態(tài)存在。所述復(fù)合體可以是所述第一探針和所述第二探針直接結(jié)合的形態(tài)或者是所述第一探針和所述第二探針通過(guò)適宜的連接體(linker)連接的形態(tài)。
[0054]所述正向引物及所述反向引物為是為了擴(kuò)增所述樣本內(nèi)靶基因而包含互補(bǔ)于所述靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列的引物。
[0055]本說(shuō)明書所使用的“引物”表示寡核苷酸，其在誘導(dǎo)互補(bǔ)于核酸鏈(模板)的引物延長(zhǎng)產(chǎn)物的合成的條件(即，諸如核苷酸和DNA聚合酶之類的聚合物的存在以及適宜的溫度和PH的條件)下作為起始點(diǎn)而發(fā)揮作用。優(yōu)選地，引物是脫氧核糖核苷酸(deoxyribonuc1etide)且是單鏈。
[0056]所述正向引物及所述反向引物(引物對(duì))應(yīng)具有在聚合酶的存在下能夠引發(fā)延長(zhǎng)產(chǎn)物的合成的程度的長(zhǎng)度。引物的適宜的長(zhǎng)度根據(jù)多種因素，例如，溫度、應(yīng)用領(lǐng)域以及引物的源(source)而存在變數(shù)，然而通?？稍?5mer?50mer之間的范圍內(nèi)進(jìn)行適宜地選擇。
[0057]所述引物對(duì)包含靶-特異性序列(靶-雜化寡核苷酸序列)，在此，靶-特異性序列是指互補(bǔ)于所述樣本內(nèi)靶基因的核酸序列的序列，在所述引物對(duì)內(nèi)位于3’方向。
[0058]本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)(comp I ementary) ”表示具有在某種特定的雜化(hybridizat1n)或退火(annealing)條件下能夠選擇性地雜化于前述的核苷酸序列的程度的互補(bǔ)性，且表示將實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)(substantially complementary)和完全互補(bǔ)(perfectly complementary)的情形均包含在內(nèi)，然而優(yōu)選為表示完全互補(bǔ)的情形。
[0059]優(yōu)選地，具有所述外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶可具有5’外切核酸酶活性，更優(yōu)選地，是具有5’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定性聚合酶。在此，熱穩(wěn)定性是指在高溫的聚合條件下所述聚合酶穩(wěn)定，而沒(méi)有變性，更具體地，在50°C?65°C的溫度范圍內(nèi)可維持所述聚合酶的穩(wěn)定性。因此，所述熱穩(wěn)定性聚合酶在50°C?65°C的溫度范圍內(nèi)處于被活性化的狀態(tài)(參照?qǐng)D5)。
[0060]所述熱穩(wěn)定性聚合酶可從能夠獲得熱穩(wěn)定性(DNA)聚合酶的細(xì)菌(bacteria)分離并使用，所述細(xì)菌有 Thermus aquaticus (Taq)、Thermus thermophiIus (Tth)、ThermusfiIiformiS、Thermis flavus、Thermococcus Iiteralis 以及 Pyrococcus fur1sus (Pfu)等。進(jìn)一步更優(yōu)選地，具有所述外切核酸酶活性的聚合酶優(yōu)選具有5’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定性Taq聚合酶。
[0061]所述樣本包括包含靶基因的溶液、體液、血液、細(xì)胞、組織以及器官等，但不是必須受限于此。
[0062]所述反應(yīng)溶液中具有外切核酸酶活性的聚合酶可以以每反應(yīng)為在0.1單位(unit)?I單位(unit)的范圍內(nèi)選擇的量來(lái)使用，所述反應(yīng)溶液中第一探針-第二探針復(fù)合體可以以每反應(yīng)為在0.5pmole?1pmole的范圍內(nèi)選擇的量來(lái)使用。隨著逐漸增加所述聚合酶及所述復(fù)合體各自的使用量，反應(yīng)性表現(xiàn)為高斯(Gaussian)形態(tài)的曲線圖，在前述范圍內(nèi)，實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)性能夠被最大限度地維持。
[0063]此外，所述反應(yīng)溶液中所述正向(forward)引物及所述反向(reverse)引物可以以對(duì)稱或非對(duì)稱濃度來(lái)使用。
[0064]接著，公開(kāi)用于擴(kuò)增所述樣本內(nèi)靶基因的實(shí)時(shí)PCR步驟(步驟(C))。所述實(shí)時(shí)PCR步驟包括所述樣本內(nèi)靶基因的變性反應(yīng)、所述樣本內(nèi)靶基因和所述復(fù)合體、所述正向引物及所述反向引物的雜化反應(yīng)以及由具有外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶引起的所述引物的延長(zhǎng)反應(yīng)的聚合酶鏈反應(yīng)。
[0065]在此，將所述變性反應(yīng)、雜化反應(yīng)以及延長(zhǎng)反應(yīng)依次進(jìn)行一次的情形稱為I循環(huán)，所述實(shí)時(shí)PCR步驟中所述變性反應(yīng)、雜化反應(yīng)以及延長(zhǎng)反應(yīng)可依次進(jìn)行多次(η) (η循環(huán))。
[0066]根據(jù)所述步驟(C)的實(shí)時(shí)PCR步驟是在所述生物物質(zhì)檢測(cè)用元件200內(nèi)的反應(yīng)溶液中進(jìn)行。
[0067]首先，所述樣本內(nèi)靶基因的變性反應(yīng)為如下反應(yīng):將所述靶基因的雙鏈(doublestrand)形態(tài)的模板DNA分離為單鏈(single strand)，以使各個(gè)單鏈形態(tài)的模板DNA作為針對(duì)所述正方向引物及所述反向引物的模板(template)而發(fā)揮作用。所述變性反應(yīng)可在920C?980C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。
[0068]在所述雙鏈形態(tài)的模板DNA變性為單鏈形態(tài)的模板DNA的情況下，接著，所述正向引物和所述反向引物與各個(gè)單鏈形態(tài)的模板DNA進(jìn)行雜化(或者退火)，所述第一探針-第二探針也雜化到所述各個(gè)單鏈形態(tài)的模板DNA的一個(gè)區(qū)域。
[0069]本申請(qǐng)所使用的術(shù)語(yǔ)“雜化(hybridizat1n) ”是指兩個(gè)單鏈核酸通過(guò)互補(bǔ)的堿基序列的配對(duì)(pairing)而形成雙鏈結(jié)構(gòu)(duplex structure)的意思。雜化是在單鏈核酸序列之間的互補(bǔ)性完整的情況下(完美匹配(perfect match))發(fā)生，或者即使存在部分錯(cuò)配序列(mismatch)的堿基也可以引起雜化。雜化所需的互補(bǔ)性的程度可以根據(jù)雜化反應(yīng)條件而變得不同，尤其可以通過(guò)溫度來(lái)調(diào)節(jié)。
[0070]此時(shí)，通過(guò)所述雜化反應(yīng)而僅在所述靶基因和所述復(fù)合體中的所述第一探針之間進(jìn)行雜化反應(yīng)，所述第二探針結(jié)合于所述第一探針，但沒(méi)有雜化到所述靶基因的狀態(tài)存在。
[0071]接著，通過(guò)具有所述外切核酸酶活性的聚合酶而進(jìn)行所述引物的延長(zhǎng)反應(yīng)。此時(shí)，在進(jìn)行由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的延長(zhǎng)反應(yīng)的期間，如果所述聚合酶到達(dá)至與所述靶基因雜化的所述復(fù)合體，則所述聚合酶通過(guò)自身的活性來(lái)分解所述復(fù)合體的情況下，進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)。此時(shí)，從所述復(fù)合體分解出所述第二探針及所述第一熒光體并將其釋放到所述反應(yīng)溶液內(nèi)。
[0072]分解之前所述復(fù)合體內(nèi)的所述第一熒光體被所述第一猝滅體而處于猝滅的狀態(tài)。只是，如果隨著所述復(fù)合體通過(guò)所述聚合酶而被分解從而釋放所述第一熒光體，則所述第一熒光體從猝滅狀態(tài)脫離，并在相關(guān)的波長(zhǎng)帶下產(chǎn)生第一熒光信號(hào)。
[0073]因此，在所述樣本內(nèi)不存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因的情況下，所述反應(yīng)溶液內(nèi)不存在被分解而釋放的第二探針及第一熒光體。此外，在所述樣本內(nèi)不存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因的情況下，所述第一熒光體被第一猝滅體而處于猝滅狀態(tài)，從而不會(huì)產(chǎn)生由所述第一熒光體引起的第一熒光信號(hào)。
[0074]相反，在所述樣本內(nèi)存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因的情況下，在引起所述靶基因的雙鏈形態(tài)的模板DNA的變性之后，所述第一探針-第二探針復(fù)合體中的第一探針和所述正向引物及所述反向引物被雜化到所述靶基因中互補(bǔ)的位置，而所述第二探針結(jié)合于所述第一探針，但以沒(méi)有雜化到所述靶基因的狀態(tài)存在。
[0075]接著，在所述引物的延長(zhǎng)溫度下通過(guò)具有5’外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶而進(jìn)行所述引物的延長(zhǎng)反應(yīng)，且在進(jìn)行所述引物的延長(zhǎng)反應(yīng)的期間，通過(guò)所述聚合酶而從雜化于所述靶基因中互補(bǔ)位置的所述復(fù)合體分解并釋放所述第二探針及所述第一熒光體。
[0076]在此，由所述聚合酶引起的所述引物的延長(zhǎng)可在50°C?70°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選為在55°C?68°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，更加優(yōu)選為在60°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。所述引物的延長(zhǎng)溫度與所述引物的延長(zhǎng)效率有直接的關(guān)聯(lián)性(參照?qǐng)D6)。
[0077]在所述樣本內(nèi)不存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因，或者在所述樣本內(nèi)存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因但在所述靶基因中互補(bǔ)的位置上沒(méi)有雜化有所述復(fù)合體的情況下，所述復(fù)合體不會(huì)通過(guò)具有所述5’外切核酸酶(exonuclease)活性的聚合酶而被分解。因此，在所述反應(yīng)溶液內(nèi)不會(huì)存在被分解而釋放的第二探針及第一熒光體。即，所述靶基因與所述復(fù)合體的雜化成為所述反應(yīng)溶液內(nèi)是否存在游離(free)狀態(tài)的第二探針和第一熒光體的前提條件。
[0078]因此，在所述樣本內(nèi)存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因的情況下，所述靶基因?qū)?huì)隨著通過(guò)所述步驟(c)的實(shí)時(shí)PCR的反復(fù)次數(shù)(循環(huán))而逐漸擴(kuò)增，且所述靶基因擴(kuò)增的同時(shí)，所述反應(yīng)溶液內(nèi)游離狀態(tài)的第二探針和第一熒光體的量也會(huì)增加。
[0079]所述反應(yīng)溶液內(nèi)增加的第一熒光體的量將會(huì)增加第一熒光信號(hào)的強(qiáng)度。
[0080]接著，公開(kāi)由在所述實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的結(jié)果下釋放到所述反應(yīng)溶液內(nèi)的所述第二探針引起的在所述生物芯片223中的DNA微陣列步驟(步驟(d))。
[0081]如前所述，所述生物芯片223的表面固定有所述第三探針。此時(shí)，所述第三探針包含能夠產(chǎn)生第二熒光信號(hào)的第二熒光體和能夠猝滅所述第二熒光體的第二猝滅體。在此，包含于所述第三探針的所述第二熒光體和所述第二猝滅體布置在相鄰的位置，從而可以由所述第二猝滅體所述第二焚光體被猝滅的二級(jí)結(jié)構(gòu)(例如，環(huán)(loop)或發(fā)夾(hairpin))的形態(tài)存在(分子指示標(biāo)(molecular beacon))。
[0082]此時(shí)，如上所述，當(dāng)使用將所述靶基因的多個(gè)靶區(qū)域作為目標(biāo)的由所述第一探針及第二探針構(gòu)成的互不相同的復(fù)合體時(shí)，在所述樣本內(nèi)存在具有與所述第一探針(X)及第一探針(Y)互補(bǔ)的序列的靶基因的情況下，通過(guò)所述步驟(C)的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果，從所述多個(gè)復(fù)合體所述第二探針(X)及第二探針(Y)從所述復(fù)合體分解而被釋放到所述反應(yīng)溶液內(nèi)，且所述第二探針(X)及第二探針(Y)可以與多個(gè)第三探針，即，第三探針(X)及第三探針(Y)雜化。
[0083]所述步驟(d)為在所述步驟(C)中被釋放的所述第二探針和固定于所述生物芯片的所述第三探針進(jìn)行雜化之后通過(guò)所述聚合酶而所述第二探針在所述第三探針上延長(zhǎng)的步驟，所述第二探針在所述第三探針上延長(zhǎng)，從而所述第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)被解開(kāi)，由此，所述第二熒光體從由于所述第二猝滅體而所處在的猝滅狀態(tài)脫離出來(lái)。
[0084]為了更詳細(xì)說(shuō)明所述步驟(d)而對(duì)所述步驟(C)和步驟(d)的關(guān)系進(jìn)行說(shuō)明，則通過(guò)所述步驟(C)的實(shí)時(shí)PCR和通過(guò)所述步驟(d)的DNA微陣列可在一個(gè)單一(同一個(gè))生物物質(zhì)檢測(cè)用元件200內(nèi)可以以多次反復(fù)循環(huán)的方式依次或獨(dú)立地進(jìn)行。即，所述步驟(C)和步驟(d)無(wú)需一定要依次進(jìn)行。
[0085]S卩，根據(jù)第一次循環(huán)下的步驟(C)而第二探針從所述復(fù)合體中分解出來(lái)并被釋放到所述反應(yīng)溶液內(nèi)之后，所述第二探針在第二次循環(huán)下的步驟(C)的雜化反應(yīng)溫度下與固定于所述生物芯片223的所述第三探針雜化。
[0086]在實(shí)時(shí)PCR的第一次循環(huán)結(jié)束而所述第二探針被釋放到所述反應(yīng)溶液內(nèi)的狀態(tài)下開(kāi)始進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的第二次循環(huán)，且在發(fā)生所述第二次循環(huán)的變性反應(yīng)(靶基因的雙鏈形態(tài)的模板DNA的變性)的溫度條件下所述第三探針以自身的二級(jí)結(jié)構(gòu)被解開(kāi)的狀態(tài)存在。即，在發(fā)生所述第二次循環(huán)的變性反應(yīng)的溫度條件下，包含于所述第三探針的所述第二熒光體以沒(méi)有被所述第二猝滅體猝滅的狀態(tài)存在。
[0087]然后，在發(fā)生所述實(shí)時(shí)PCR的第二次循環(huán)的雜化反應(yīng)的溫度條件下，所述第二探針雜化到所述第三探針的互補(bǔ)的區(qū)域，且在發(fā)生由所述聚合酶引起的延長(zhǎng)反應(yīng)的溫度條件下，所述第二探針在所述第三探針上延長(zhǎng)，由此所述第三探針可維持為二級(jí)結(jié)構(gòu)解開(kāi)的狀
--τ O
[0088]如上所述，在進(jìn)行所述步驟(C)的溫度條件下，所述第三探針是所述第二探針雜化到所述第三探針后延長(zhǎng)從而與將所述第三探針的二級(jí)機(jī)構(gòu)維持為解開(kāi)狀態(tài)與否無(wú)關(guān)，均以二結(jié)構(gòu)被解開(kāi)的狀態(tài)存在，因此包含于所述第三探針的所述第二熒光體以沒(méi)有被所述第二猝滅體猝滅的狀態(tài)存在。
[0089]因此，在所述步驟(d)之后，還可包括降低溫度致使所述第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)恢復(fù)的步驟，在所述步驟中，所述第三探針中所述第二探針沒(méi)有被雜化而延長(zhǎng)的第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)，從而所述第二熒光體可再次被所述第二猝滅體猝滅。即，所述追加的步驟為第二熒光體的猝滅步驟，從而可以排除以在所述第三探針上沒(méi)有延長(zhǎng)第二探針的狀態(tài)產(chǎn)生的第二熒光體的非特異性第二熒光信號(hào)。
[0090]此時(shí)，可恢復(fù)所述第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)的溫度為50°C以下(參照?qǐng)D7)。S卩，優(yōu)選地，被設(shè)計(jì)為在50°C以下的溫度下能夠恢復(fù)所述第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)。更具體的說(shuō)明，則所述第三探針包括所述第二熒光體及第二猝滅體，且所述第二熒光體是以用于通過(guò)存在于相鄰位置的所述第二猝滅體而被猝滅的狀態(tài)存在的二級(jí)結(jié)構(gòu)形態(tài)存在，所述第三探針可以是以在發(fā)生所述靶基因的雙鏈形態(tài)的模板DNA的變性的溫度條件下被解開(kāi)的狀態(tài)存在的二級(jí)結(jié)構(gòu)形態(tài)存在。此外，以二級(jí)結(jié)構(gòu)被解開(kāi)的狀態(tài)存在的所述第三探針在處于沒(méi)有雜化而延長(zhǎng)的所述第二探針的狀態(tài)的情況下，在50°C以下的溫度條件下使得能夠再次恢復(fù)所述二級(jí)結(jié)構(gòu)的方式存在。
[0091]所述第三探針在沒(méi)有雜化而延長(zhǎng)的所述第二探針的狀態(tài)下隨著溫度的減小可以恢復(fù)原來(lái)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在56°C以下的溫度下第二熒光信號(hào)開(kāi)始減少，優(yōu)選為在50°C以下的溫度下達(dá)到完全猝滅狀態(tài)，更加優(yōu)選為在48°C以下的溫度下達(dá)到完全猝滅狀態(tài)。
[0092]此外，可恢復(fù)所述第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)的時(shí)間條件為，在所述溫度范圍內(nèi)可以是5秒以上(參照?qǐng)D8) ο處于沒(méi)有雜化并延長(zhǎng)的所述第二探針的狀態(tài)的第三探針將會(huì)隨著50°C以下的溫度維持時(shí)間而逐漸喪失第二熒光信號(hào)，此時(shí)的溫度維持時(shí)間為3秒以上，優(yōu)選為5秒以上。
[0093]根據(jù)所述追加的第三探針的猝滅步驟，在所述反應(yīng)溶液內(nèi)不存在游離(free)第二探針的情況下，不會(huì)從所述第三探針產(chǎn)生由所述第二熒光體引起的第二熒光信號(hào)。
[0094]最后，公開(kāi)用于檢測(cè)從所述生物物質(zhì)檢測(cè)用元件產(chǎn)生的第一熒光信號(hào)及第二熒光信號(hào)的步驟(步驟(e))。所述第一熒光信號(hào)從所述第一熒光體產(chǎn)生，所述第二熒光信號(hào)從所述第二熒光體產(chǎn)生。此時(shí)，所述第一熒光體及所述第二熒光體全部應(yīng)當(dāng)以沒(méi)有被各自的猝滅體猝滅的狀態(tài)存在。
[0095]所述步驟(e)是在所述元件部220結(jié)合于所述反應(yīng)容器210的狀態(tài)下通過(guò)所述熒光測(cè)量?jī)x實(shí)時(shí)地進(jìn)行的。此時(shí)，所述步驟(e)，優(yōu)選地，在所述步驟(d)之后所述第三探針中沒(méi)有與所述第二探針雜化的第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)之后，同時(shí)檢測(cè)所述第一熒光信號(hào)及第二熒光信號(hào)(參照?qǐng)D9)。
[0096]在此，雖然所述第一熒光信號(hào)的檢測(cè)優(yōu)選與第二熒光信號(hào)的檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，但是為了提高檢測(cè)效率，在專門的時(shí)期，相互獨(dú)立地進(jìn)行針對(duì)各自的熒光信號(hào)的檢測(cè)。即，在一次性地檢測(cè)根據(jù)所述步驟(c)的實(shí)時(shí)PCR而從所述復(fù)合體分解并釋放的所述第一熒光體產(chǎn)生的所述第一熒光信號(hào)之后，經(jīng)過(guò)所述步驟(d)和所述第三探針的追加的猝滅步驟而以所述第二探針雜化并延長(zhǎng)于所述第三探針的狀態(tài)存在的情況下，可以二次性的檢測(cè)由包含于所述第三探針的所述第二熒光體產(chǎn)生的所述第二熒光信號(hào)(參照?qǐng)D10)。
[0097]在所述樣本內(nèi)存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因的情況下，第一熒光信號(hào)及第二熒光信號(hào)的強(qiáng)度隨著反應(yīng)的反復(fù)循環(huán)的次數(shù)的增加而增加。此外，在所述元件部220結(jié)合于所述反應(yīng)容器210的狀態(tài)下可通過(guò)所述熒光測(cè)量?jī)x而同時(shí)檢測(cè)所述第一熒光信號(hào)及第二熒光信號(hào)。此時(shí)，優(yōu)選地，所述第一熒光體及第二熒光體產(chǎn)生在互不相同的波長(zhǎng)帶下檢測(cè)到的熒光信號(hào)。
[0098]此外，在其他實(shí)施例中，為了增加定量及定性分析靈敏度，所述第一熒光體及所述第二熒光體中的至少一個(gè)構(gòu)成為包含用于產(chǎn)生在互不相同的波長(zhǎng)帶下檢測(cè)到的熒光信號(hào)的多個(gè)熒光物質(zhì)。
[0099]例如，所述熒光信號(hào)是通過(guò)所述生物物質(zhì)檢測(cè)用元件200的上部由相機(jī)來(lái)獲取圖像來(lái)獲得的，此時(shí)如上所述，通過(guò)多種探針的設(shè)計(jì)能夠進(jìn)行多重分析，且熒光信號(hào)與基因擴(kuò)增成比例地變化，從而可進(jìn)行定量定性分析。
[0100]在一個(gè)實(shí)施例中，所述第一熒光信號(hào)及第二熒光信號(hào)可通過(guò)沿所述蓋的上部方向進(jìn)行的直線型(trans type)熒光信號(hào)檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)(參照?qǐng)D11)，在另一實(shí)施例中，所述第一熒光信號(hào)及第二熒光信號(hào)可通過(guò)沿針對(duì)所述生物芯片的表面具有一定的傾斜的方向進(jìn)行的傾斜性(oblique type)熒光信號(hào)檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)(參照?qǐng)D12)，在又一實(shí)施例中，所述第一熒光信號(hào)及第二熒光信號(hào)可通過(guò)在所述生物芯片的側(cè)面方向上利用二向色性物質(zhì)(dichroic material)來(lái)進(jìn)行的側(cè)面型(epi type)焚光信號(hào)檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)(參照?qǐng)D13)。
[0101]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的方法可在能夠自動(dòng)控制反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及反復(fù)循環(huán)次數(shù)的溫度循環(huán)裝置(thermal cycler)內(nèi)進(jìn)行。此時(shí)，所述反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及反復(fù)循環(huán)次數(shù)可在所述元件部220結(jié)合于所述反應(yīng)容器210的狀態(tài)下被所述溫度循環(huán)裝置自動(dòng)地控制。此外，所述溫度循環(huán)裝置還包括熒光測(cè)量?jī)x，從而可在一個(gè)裝置內(nèi)進(jìn)行生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析。
[0102] 以上，對(duì)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行了說(shuō)明，但是對(duì)于本領(lǐng)域中具有通常知識(shí)的技術(shù)人員而言，在不脫離權(quán)利要求書所記載的本發(fā)明的思想的范圍內(nèi)，可通過(guò)構(gòu)成要素的增加、變更、刪除或追加等來(lái)多樣地修改及變更本發(fā)明，且這也包含于本發(fā)明的權(quán)利范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，包括如下步驟: (a)準(zhǔn)備生物物質(zhì)檢測(cè)用元件，該生物物質(zhì)檢測(cè)用元件包括上部形成有開(kāi)口部的反應(yīng)容器和通過(guò)所述開(kāi)口部而可裝卸于所述反應(yīng)容器的元件部，其中所述元件部包括結(jié)合于所述反應(yīng)容器的開(kāi)口部的蓋和朝所述蓋的下部延伸而形成的桿，所述桿具有表面固定有第三探針的生物芯片； (b)向所述反應(yīng)容器內(nèi)添加包含第一探針-第二探針復(fù)合體、正向引物、反向引物、堿磷酸去氧核苷酸、具有外切核酸酶活性的聚合酶、包含靶基因的樣本及緩沖溶液的反應(yīng)溶液，其中，所述第一探針包含互補(bǔ)于所述樣本內(nèi)靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列，且包含能夠產(chǎn)生第一熒光信號(hào)的第一熒光體和能夠猝滅所述第一熒光體的第一猝滅體，所述第二探針包含互補(bǔ)于所述第三探針的寡核苷酸序列，而不包含互補(bǔ)于所述樣本內(nèi)靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列，所述正向引物及所述反向引物是為了擴(kuò)增所述樣本內(nèi)靶基因而包含互補(bǔ)于所述靶基因的核酸序列的寡核苷酸序列的引物； (c)進(jìn)行包含所述樣本內(nèi)靶基因的變性反應(yīng)、所述樣本內(nèi)靶基因和所述復(fù)合體、所述正向引物及所述反向引物的雜化反應(yīng)以及由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的所述引物的延長(zhǎng)反應(yīng)的聚合酶鏈反應(yīng)，其中，通過(guò)所述雜化反應(yīng)而僅在所述靶基因和所述復(fù)合體中的所述第一探針之間進(jìn)行雜化反應(yīng)，在進(jìn)行由具有外切核酸酶活性的聚合酶引起的延長(zhǎng)反應(yīng)的期間，從所述復(fù)合體分解并釋放所述第二探針及所述第一熒光體； (d)被釋放的所述第二探針和固定于所述生物芯片的所述第三探針進(jìn)行雜化之后通過(guò)所述聚合酶而所述第二探針在所述第三探針上延長(zhǎng)，其中，所述第三探針包含能夠產(chǎn)生第二熒光信號(hào)的第二熒光體和能夠猝滅所述第二熒光體的第二猝滅體，隨著所述第二探針在所述第三探針上延長(zhǎng)，第二猝滅體從所述第二熒光體分開(kāi)而產(chǎn)生發(fā)光；以及 (e)檢測(cè)由所述第一熒光體引起的第一熒光信號(hào)以及由所述第二熒光體引起的第二熒光信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在所述步驟(b)中，將所述反應(yīng)溶液添加為使設(shè)置于桿的生物芯片浸漬于反應(yīng)溶液中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述生物芯片可設(shè)置于選自所述桿的外周面以及下部的至少一個(gè)區(qū)域， 其中，設(shè)置所述生物芯片的至少一個(gè)區(qū)域以浸漬于所述反應(yīng)溶液的狀態(tài)存在。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述第三探針通過(guò)第三探針的5’末端或3’末端的高分子物質(zhì)固定于所述生物芯片。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述反應(yīng)溶液中具有外切核酸酶活性的聚合酶以每反應(yīng)為在0.1單位?I單位的范圍內(nèi)選擇的量來(lái)使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述反應(yīng)溶液中第一探針-第二探針復(fù)合體以每反應(yīng)為在0.5pmole?1pmole的范圍內(nèi)選擇的量來(lái)使用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述反應(yīng)溶液中所述正向引物及所述反向引物以對(duì)稱或非對(duì)稱濃度來(lái)使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述步驟(C)是在所述反應(yīng)溶液內(nèi)進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在所述樣本內(nèi)不存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因的情況下，所述反應(yīng)溶液內(nèi)不存在被分解而釋放的第二探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在所述樣本內(nèi)不存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因的情況下，所述第一熒光體被第一猝滅體而處于猝滅狀態(tài)，所述第二熒光體被第二猝滅體而處于猝滅狀態(tài)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在所述樣本內(nèi)不存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因的情況下，不發(fā)生由所述第一熒光體引起的第一熒光信號(hào)及由所述第二熒光體引起的第二熒光信號(hào)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在所述樣本內(nèi)存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因的情況下， 在引起所述靶基因的雙鏈形態(tài)的模板DNA的變性之后，所述第一探針-第二探針復(fù)合體中的第一探針和所述正向引物及所述反向引物被雜化到所述靶基因中互補(bǔ)的位置， 所述第二探針結(jié)合于所述第一探針，但沒(méi)有雜化到所述靶基因的狀態(tài)存在。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述靶基因的雙鏈形態(tài)的模板DNA的變性是在92°C?98°C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述步驟(c)的延長(zhǎng)反應(yīng)是在所述引物的延長(zhǎng)溫度下通過(guò)具有5’外切核酸酶活性的聚合酶而進(jìn)行， 在進(jìn)行所述引物的延長(zhǎng)反應(yīng)的期間，通過(guò)所述聚合酶而從雜化于所述靶基因中互補(bǔ)位置的所述復(fù)合體分解并釋放所述第二探針及所述第一熒光體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，由所述聚合酶引起的所述引物的延長(zhǎng)在50 °C?70 0C的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述聚合酶在50°C?65°C的溫度范圍內(nèi)被活性化。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，從所述復(fù)合體分解出的所述第一熒光體不會(huì)被所述第一猝滅體猝滅。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在所述樣本內(nèi)不存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因，或者在所述樣本內(nèi)存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因但在所述靶基因中互補(bǔ)的位置上沒(méi)有雜化有所述復(fù)合體的情況下， 所述復(fù)合體不會(huì)通過(guò)具有所述5’外切核酸酶活性的聚合酶而被分解。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，包含于所述第三探針的所述第二熒光體和所述第二猝滅體布置在相鄰的位置，從而以所述第二熒光體能夠被所述第二猝滅體猝滅的二級(jí)結(jié)構(gòu)的形態(tài)存在。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在發(fā)生所述靶基因的雙鏈形態(tài)的模板DNA的變性的溫度下，所述第三探針以二級(jí)結(jié)構(gòu)被解開(kāi)的狀態(tài)存在。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在發(fā)生所述靶基因的雙鏈形態(tài)的模板DNA的變性的溫度下，所述第二熒光體不會(huì)被所述第二猝滅體猝滅。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在從所述步驟(c)釋放的所述第二探針雜化到所述第三探針之前，所述第三探針以二級(jí)結(jié)構(gòu)被解開(kāi)的狀態(tài)存在。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，從所述步驟(C)釋放的所述第二探針被雜化到以二級(jí)結(jié)構(gòu)被解開(kāi)的狀態(tài)存在的所述第三探針之后，所述第二探針通過(guò)所述聚合酶而在所述第三探針上延長(zhǎng)，從而維持為所述第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)解開(kāi)的狀態(tài)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在所述第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)被解開(kāi)的狀態(tài)下，所述第二熒光體不會(huì)被所述第二猝滅體猝滅。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在所述步驟(d)之后，還包括降低溫度致使所述第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)恢復(fù)的步驟， 在所述步驟中，所述第三探針中沒(méi)有與所述第二探針雜化的第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)，從而所述第二熒光體被所述第二猝滅體猝滅。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠得到恢復(fù)的溫度為50°C以下。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在所述步驟(d)之后，所述第三探針通過(guò)在50°C以下的溫度內(nèi)5秒以上的穩(wěn)定化而恢復(fù)二級(jí)結(jié)構(gòu)。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在同一個(gè)生物物質(zhì)檢測(cè)用元件內(nèi)以多次反復(fù)循環(huán)的方式依次進(jìn)行所述步驟(c)至步驟(e)。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在同一個(gè)生物物質(zhì)檢測(cè)用元件內(nèi)以多次反復(fù)循環(huán)的方式獨(dú)立地進(jìn)行所述步驟(C)至步驟(e)。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，通過(guò)第一次循環(huán)中的步驟(C)而從所述復(fù)合體中分解并釋放的第二探針在第二次循環(huán)中的步驟(C)的雜化反應(yīng)溫度下雜化到固定于所述生物芯片的所述第三探針。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，通過(guò)熒光測(cè)量?jī)x實(shí)時(shí)地進(jìn)行所述步驟(e)。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在所述元件部結(jié)合于所述反應(yīng)容器的狀態(tài)下通過(guò)所述熒光測(cè)量?jī)x來(lái)實(shí)時(shí)地進(jìn)行所述步驟(e)。
33.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在所述樣本內(nèi)存在具有與所述第一探針互補(bǔ)的序列的靶基因的情況下，第一熒光信號(hào)及第二熒光信號(hào)的強(qiáng)度隨著所述反復(fù)循環(huán)的次數(shù)的增加而增加。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述第一焚光信號(hào)及第二焚光信號(hào)被同時(shí)檢測(cè)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，在所述步驟(d)之后，在所述第三探針中沒(méi)有與所述第二探針雜化的第三探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)恢復(fù)之后，同時(shí)檢測(cè)所述第一熒光信號(hào)及第二熒光信號(hào)。
36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述第一熒光體及第二熒光體產(chǎn)生在互不相同的波長(zhǎng)帶下檢測(cè)到的熒光信號(hào)。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述第一熒光體及所述第二熒光體中的至少一個(gè)包含用于產(chǎn)生在互不相同的波長(zhǎng)帶下檢測(cè)到的焚光信號(hào)的多個(gè)焚光物質(zhì)。
38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，通過(guò)沿所述蓋的上部方向進(jìn)行的直線型熒光信號(hào)檢測(cè)方法而檢測(cè)所述第一熒光信號(hào)及第二熒光信號(hào)。
39.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，通過(guò)沿針對(duì)所述生物芯片的表面具有一定的傾斜的方向進(jìn)行的傾斜性熒光信號(hào)檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)所述第一焚光信號(hào)及第二焚光信號(hào)。
40.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，通過(guò)在所述生物芯片的側(cè)面方向上利用二向色性物質(zhì)來(lái)進(jìn)行的側(cè)面型熒光信號(hào)檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)所述第一焚光信號(hào)及第二焚光信號(hào)。
41.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述蓋由透光率為50%以上的物質(zhì)形成。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述蓋由選自玻璃、石英、煅制氧化硅、丙烯酸、聚碳酸酯、環(huán)烯烴共聚物和環(huán)烯烴聚合物中的至少一個(gè)物質(zhì)來(lái)形成。
43.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述桿由具有9.0xlO-Vm.K以下的熱膨脹系數(shù)的物質(zhì)形成。
44.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述方法是在能夠自動(dòng)控制反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及反復(fù)循環(huán)次數(shù)的溫度循環(huán)裝置內(nèi)進(jìn)行。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及反復(fù)循環(huán)次數(shù)可在所述元件部結(jié)合于所述反應(yīng)容器的狀態(tài)下能夠被所述溫度循環(huán)裝置自動(dòng)地控制。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的生物物質(zhì)的實(shí)時(shí)定量及定性分析方法，其特征在于，所述溫度循環(huán)裝置還包括熒光測(cè)量?jī)x。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104520711SQ201480001948
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月30日
【發(fā)明者】金利京, 白文哲, 具秀珍, 樸善暎, 李都富, 樸宰亨, 李起昌, 金南中 申請(qǐng)人:科美宜科儀器