一種用于檢測(cè)人冠狀病毒感染的通用引物序列及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明通過對(duì)GenBank上登錄的六種人冠狀病毒全基因組核酸序列的比對(duì)分析，在基因組多聚酶基因編碼區(qū)(1b區(qū))設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物hCoV-For和hCoV-Rev用于對(duì)人冠狀病毒的通用定性檢測(cè)。上游引物序列hCoV-For：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物序列hCoV-Rev：TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，擴(kuò)增目的片段大小為605bp。分別提取HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1陽性樣本的RNA，通過One-step RT-PCR對(duì)該通用引物對(duì)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，分別以上述四種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為通用引物進(jìn)行One-step RT-PCR反應(yīng)后都能擴(kuò)增出大小約600bp的單一目的條帶。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明擴(kuò)增序列正確且不存在交叉反應(yīng)。本發(fā)明可用于對(duì)人冠狀病毒感染的核酸快速定性檢測(cè)。
【專利說明】一種用于檢測(cè)人冠狀病毒感染的通用引物序列及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及一種新的利用一對(duì)簡(jiǎn)并引物， 通過One-step RT-PCR反應(yīng)即可達(dá)到對(duì)人冠狀病毒感染定性檢測(cè)的目的。

【背景技術(shù)】
[0002] 冠狀病毒（Coronavirus)在病毒學(xué)分類上屬于巢式病毒目（orderNidovirals)、 冠狀病毒科（family Coronavirade)、冠狀病毒屬（genus Coronavirus)的成員，基因組為 單鏈、正鏈的RNA，全長在26?32kb之間，是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒。冠狀 病毒在自然界的感染普非常廣泛，常見的哺乳類動(dòng)物如犬、貓、鼠、豬、牛以及家禽類等都易 感。近幾年來，又從白鯨、駱駝，尤其是蝙蝠體內(nèi)分離到多種類型的冠狀病毒。冠狀病毒依 據(jù)核酸序列的系統(tǒng)發(fā)生分析，國際病毒學(xué)分類委員會(huì)（ICTV，2012)在第九次報(bào)告中將冠狀 病毒屬又分成了 α、β、γ及δ共四個(gè)亞組。人及其他哺乳類冠狀病毒主要位于α和β 亞組，禽類及其它鳥類冠狀病毒主要位于γ和S亞組。冠狀病毒感染后，能夠侵害機(jī)體的 呼吸道、消化道、肝臟、腎臟以及神經(jīng)系統(tǒng)等多種器官，造成不同程度的病理性損，從而引起 不同程度的病理性疾病，嚴(yán)重者甚至能造成死亡。
[0003] 人冠狀病毒目前已知共有六種，分別是二十世紀(jì)60年代最早發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒 229E(Human coronavirus 229E，HCoV-229E)和HC〇V-〇C43 ;2002?2003年在我國廣東地區(qū) 出現(xiàn)并迅速爆發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸道綜合征（Severe acute respiratory syndrome, SARS) 冠狀病毒SARS-CoV ;2004年在荷蘭分離的新型人冠狀病毒HCoV-NL63 ;2005年在香港鑒定 的新型人冠狀病毒HCoV-HKUI以及2012年在中東地區(qū)出現(xiàn)的新型中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome, MERS)冠狀病毒 MERS-CoV。其中，HCoV-229E 和 HCoV-NL63 位于α亞組，HC〇V-〇C43和HCoV-HKUI位于β亞組中的2a亞組，SARS-CoV屬于β亞組 中的2b亞組，MERS-CoV屬于β亞組中的2c亞組。分子流行病學(xué)研宄表明，人冠狀病毒主 要感染嬰幼兒及免疫功能低下或缺陷者，既能感染上呼吸道引起發(fā)熱、咳嗽、喉炎等普通感 冒癥狀，又能感染下呼吸道引起支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎及肺炎等急性呼吸道癥狀。其中， SARS-CoV和MERS-CoV感染后能夠引發(fā)呼吸系統(tǒng)和腎功能衰竭，嚴(yán)重者甚至造成死亡。除 了 SARS-CoV和MERS-CoV外，冠狀病毒在常見人呼吸道病毒感染中的平均檢出率為15% (Perlman S, et al. 2009) 〇
[0004] 冠狀病毒基因組不連續(xù)的復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)制、RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNApolymerase, RdRp)復(fù)制的低忠實(shí)性、廣泛的宿主嗜性使其在進(jìn)化過程中極易發(fā)生堿基 的插入、缺失以及基因重組或重配，在此過程中新型別或新的冠狀病毒不斷出現(xiàn)。因此，深 入開展冠狀病毒及新出現(xiàn)的冠狀病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查，及時(shí)研發(fā)新的快速、靈敏的分 子檢測(cè)技術(shù)對(duì)于闡釋冠狀病毒跨種屬傳播的分子機(jī)制以及滿足快速診斷的要求等具有重 要意義。目前，人冠狀病毒分子檢測(cè)方法主要有常規(guī)RT-PCR、real-time RT-PCR及血清學(xué) 診斷法。這些方法通常利用特異性引物針及探針對(duì)某一特定種類的人冠狀病毒進(jìn)行單一檢 測(cè)，屬于盲篩檢測(cè)，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且檢測(cè)試劑昂貴且容易造成污染。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是以GenBank上登陸的目前已知的六種人冠狀病毒全基因組序列 為基礎(chǔ)，通過對(duì)人冠狀病毒全基因組核酸序列的比對(duì)分析，在基因組多聚酶基因編碼區(qū)設(shè) 計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物用于對(duì)人冠狀病毒的通用定性檢測(cè)。
[0006] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：
[0007] 一種用于檢測(cè)人冠狀病毒感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示，即：hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG ;其下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO :2 所示，gp :hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG〇
[0008] 一種用所述通用引物序列檢測(cè)人冠狀病毒感染的檢測(cè)方法，包括：
[0009] (1)人冠狀病毒檢測(cè)通用引物設(shè)計(jì)
[0010] 通過對(duì)GenBank上登錄的六種人冠狀病毒全基因組核酸序列的比對(duì)分析，在基因 組多聚酶基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物hC 〇V-F〇r和hCoV-Rev用于對(duì)人冠狀病毒感染的 初步確診，引物對(duì)序列分別為上游引物hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物 hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，擴(kuò)增目的片段大小為 605bp ;
[0011] (2)人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證
[0012] 利用 QIAamp Viral RNA Mini kit 分別從四種人冠狀病毒：HCoV-NL63、 HCoV-0C43、HCoV-229E和HCoV-HKUI的陽性樣本中提取病毒RNA，然后以hCoV-For和 hCoV-Rev為引物對(duì)，通過One-step RT-PCR Quick Master Mix對(duì)四種人冠狀病毒分別進(jìn)行 檢測(cè)驗(yàn)證。
[0013] 所述步驟（2)中，對(duì)四種人冠狀病毒分別進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證的反應(yīng)體系為25 yL :2x RT-PCR Quick Master Mix 12.5 yL，50mM Mn(0AC)21. 25 yL，10 μΜ hCoV-For 和 hCoV-Rev 各 I μ L，病毒 RNA 5 μ L，去離子水 7. 25 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)椋?0°C 30s，60°C 30min，94°C，Imin ; 94°C 30s，56°C 30s，72°C lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C 7min ;反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳后 在紫外燈下觀察結(jié)果，結(jié)果表明，分別以上述四種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和 hCoV-Rev為通用引物進(jìn)行One-st印RT-PCR反應(yīng)后都能擴(kuò)增出大小600bp的單一目的條 帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后序列正確且不存在交叉反應(yīng)。
[0014] 所述步驟（2)中人冠狀病毒通用引物One-st印RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證包括人冠狀病毒 通用引物One-st印RT-PCR檢測(cè)靈敏性驗(yàn)證和人冠狀病毒通用引物One-st印RT-PCR檢測(cè) 特異性驗(yàn)證。
[0015] 所述人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測(cè)靈敏性驗(yàn)證，利用QIAamp Viral RNA Mini kit提取人冠狀病毒RNA，并用分光光度計(jì)進(jìn)行定量，并通過公式計(jì)算出每微升的 拷貝數(shù)，將病毒RNA進(jìn)行稀釋，然后分別取各個(gè)稀釋倍數(shù)的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果表 明，每反應(yīng)病毒RNA拷貝數(shù)從1. 6x109到1. 6x103是均能擴(kuò)增出目的條帶，而每反應(yīng)病毒 RNA拷貝數(shù)從1. 6x102到1. 6x100均不能擴(kuò)增出目的條帶，上述結(jié)果表明，該人冠狀病毒通 用引物One-step RT-PCR最低檢測(cè)下限為1600拷貝/每反應(yīng)，與常規(guī)單一冠狀病毒檢測(cè)所 用 RT-PCR 及 real-time RT-PCR 靈敏性相當(dāng)；
[0016] 所述人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測(cè)特異性驗(yàn)證，病毒RNA分別以 HC〇V-NL63、HC〇V-〇C43、HC〇V-229E、HC〇V-HKU1 以及 Influenza virus A、Influenza virus B、諾如病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒、人鼻病毒為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為 引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，分別以上述四種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和 hCoV-Rev為通用引物進(jìn)行One-st印RT-PCR反應(yīng)后都能擴(kuò)增出大小為600bp的單一目的條 帶，而加入其它病毒RNA模板均不能擴(kuò)增出條帶，表明該人冠狀病毒通用檢測(cè)引物對(duì)特異 性較好。
[0017] 本發(fā)明改變了以往對(duì)人冠狀病毒檢測(cè)的思路，以GenBank上登陸的目前已知的六 種人冠狀病毒（HCoV-229E、HC〇V-〇C43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKUI 和 MERS-CoV)全 基因組序列為基礎(chǔ)，通過多序列比對(duì)在其基因組Ib區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物hCoV-For和 hCoV-Rev，通過One-step RT-PCR實(shí)現(xiàn)對(duì)人冠狀病毒感染快速定性檢測(cè)，通過PCR產(chǎn)物測(cè)序 即可準(zhǔn)確判定人冠狀病毒感染的種類。本發(fā)明可用于開發(fā)人冠狀病毒感染快速確診的核酸 定性檢測(cè)試劑盒。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1是人冠狀病毒檢測(cè)通用引物設(shè)計(jì)圖。
[0019] 圖2是人冠狀病毒通用引物對(duì)信息圖。
[0020] 圖3是人冠狀病毒通用引物One-St印RT-PCR檢測(cè)特異性圖。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 一種用于檢測(cè)人冠狀病毒感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示，即：hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG ;其下游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO :2 所示，gp :hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG〇
[0022] 一種用通用引物序列檢測(cè)人冠狀病毒感染的檢測(cè)方法，包括：
[0023] (1)人冠狀病毒檢測(cè)通用（簡(jiǎn)并）引物設(shè)計(jì)
[0024] 通過對(duì)GenBank上登錄的六種人冠狀病毒包括人冠狀病毒229E (Human coronavirus 229E, HCoV-229E)> HC〇V-〇C43> SARS-CoV(Severe acute respiratory syndrome coronavirus)、HCoV-NL63、HCoV-HKUl 和 MERS-CoV (Middle East respiratory syndrome coronavirus)全基因組核酸序列的比對(duì)分析，在基因組多聚酶基因編碼區(qū)（lb 區(qū)）設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物hCoV-For和hCoV-Rev用于對(duì)人冠狀病毒感染的初步確診（如 圖1)，引物對(duì)序列分別為上游引物hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物 hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，擴(kuò)增目的片段大小為 605bp(其中，HCoV-HKUI 為 608bp)(如圖 2)。
[0025] (2)人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證
[0026] 利用病毒RNA提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini kit (QIAGEN)分別從四 種人冠狀病毒（HCoV-NL63、HC〇V-〇C43、HCoV-229E和HCoV-HKUl)陽性樣本中提取病 毒 RNA，然后以 hCoV-For 和 hCoV-Rev 為引物對(duì)，通過 One-step RT-PCR Quick Master Mix (T0Y0B0公司）對(duì)四種人冠狀病毒分別進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證；反應(yīng)體系為25 μ L :2x RT-PCR Quick Master Mix 12.5 μL，50mM Mn (OAC)21. 25 μL，10 μ M hCoV-For 和 hCoV-Rev 各 14 1，病毒1?隱5以1^，去離子水7.25以匕反應(yīng)程序?yàn)椋?0°0 3〇8,60°0 3〇1^11，94°0，11^11; 94°C 30s，56°C 30s，72°C lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C 7min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳后 在紫外燈下觀察結(jié)果。結(jié)果表明，分別以上述四種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和 hCoV-Rev為通用引物進(jìn)行One-st印RT-PCR反應(yīng)后都能擴(kuò)增出大小約600bp的單一目的條 帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后序列正確且不存在交叉反應(yīng)。
[0027] 人冠狀病毒通用引物One-st印RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證包括靈敏性驗(yàn)證和特異性驗(yàn)證其 中人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測(cè)靈敏性驗(yàn)證如下：
[0028] 以人冠狀病毒HC〇V-NL63為例來說明該通用引物One-st印RT-PCR檢測(cè)的靈敏 性。利用 QIAamp Viral RNA Mini kit (QIAGEN)提取 HCoV-NL63 病毒 RNA 并用分光光度 計(jì)（敵腸01?0? 2000(：，11161'1]1〇)進(jìn)行定量，并通過（拷貝/以1^=(6.0211023)1濃度（叩/) Χ10-9Λ目的片段堿基數(shù)x340))公式計(jì)算出每微升的拷貝數(shù)。將病毒RNA進(jìn)行10倍倍比 稀釋（從3. 2x108倍比稀釋到3. 2x100)，然后分別取5 μ L各個(gè)稀釋倍數(shù)的RNA為模板進(jìn) 行RT-PCR，結(jié)果表明，每反應(yīng)病毒RNA拷貝數(shù)從1. 6x109到1. 6x103是均能擴(kuò)增出目的條 帶，而每反應(yīng)病毒RNA拷貝數(shù)從1. 6x102到1. 6x100均不能擴(kuò)增出目的條帶。上述結(jié)果表 明，該人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR最低檢測(cè)下限為1600拷貝/每反應(yīng)，與常規(guī) 單一冠狀病毒檢測(cè)所用RT-PCR及real-time RT-PCR靈敏性相當(dāng)。
[0029] 其中人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測(cè)特異性驗(yàn)證如下：
[0030] 按照⑵中所述25 μ L反應(yīng)體系配制反應(yīng)液。其中，病毒RNA分別以HCOV-NL63、 HCoV-0C43、HCoV-229E、HCoV-HKUI 以及 Influenza virus A (Η3Ν2)、Influenza virus Β、 諾如病毒（Norovirus)、呼吸道合胞體病毒（RSV)、副流感病毒（PIV2&PIV3)、人鼻病毒 (Rhinovirus)為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?90°C 30s，6(TC 30min，94°C，Imin ;94°C 30s, 56°C 30s, 72°C Imin, 35 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。反 應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察結(jié)果。結(jié)果表明，分別以上述四種人冠狀 病毒RNA為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為通用引物進(jìn)行One-st印RT-PCR反應(yīng)后都能 擴(kuò)增出大小約600bp的單一目的條帶，而加入其它病毒RNA模板均不能擴(kuò)增出條帶（如圖 3)，表明該人冠狀病毒通用檢測(cè)引物對(duì)特異性較好。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)人冠狀病毒感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。
2. -種用權(quán)利要求1所述通用引物序列檢測(cè)人冠狀病毒感染的檢測(cè)方法，其特征在 于，包括： (1) 人冠狀病毒檢測(cè)通用引物設(shè)計(jì) 通過對(duì)GenBank上登錄的六種人冠狀病毒全基因組核酸序列的比對(duì)分析，在基因組 多聚酶基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)了 一對(duì)簡(jiǎn)并引物hC〇V-F〇r和hCoV-Rev用于對(duì)人冠狀病毒感染的 初步確診，引物對(duì)序列分別為上游引物hCoV-For :ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物 hCoV-Rev :TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，擴(kuò)增目的片段大小為 605bp ; (2) 人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證 利用 QIAamp Viral RNA Mini kit 分別從四種人冠狀病毒：HC〇V-NL63、HC〇V_OC43、 HCoV-229E和HCoV-HKUl的陽性樣本中提取病毒RNA，然后以hCoV-For和hCoV-Rev為引物 對(duì)，通過One-step RT-PCR Quick Master Mix對(duì)四種人冠狀病毒分別進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟（2)中，對(duì)四種人冠狀 病毒分別進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證的反應(yīng)體系為25 yL:2x RT-PCR Quick Master Mix 12. 5 yL， 50mM Mn(OAC) 21. 25yL，10yM hCoV-For 和 hCoV-Rev 各 lyL，病毒 RNA 5yL，去離子水 7. 25 y L ;反應(yīng)程序?yàn)椋?0°C 30s，60°C 30min，94°C，lmin ;94°C 30s, 56°C 30s, 72°C lmin, 35 個(gè)循環(huán)；72°C 7min;反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察結(jié)果，結(jié)果表 明，分別以上述四種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為通用引物進(jìn)行 One-st印RT-PCR反應(yīng)后都能擴(kuò)增出大小600bp的單一目的條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后序 列正確且不存在交叉反應(yīng)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟⑵中人冠狀病毒通用引物 One-st印RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證包括人冠狀病毒通用引物One-st印RT-PCR檢測(cè)靈敏性驗(yàn)證和 人冠狀病毒通用引物〇ne-st印RT-PCR檢測(cè)特異性驗(yàn)證。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR檢測(cè)靈敏性驗(yàn)證，利用QIAamp Viral RNAMini kit提取人冠狀病毒RNA，并用分光 光度計(jì)進(jìn)行定量，并通過公式計(jì)算出每微升的拷貝數(shù)，將病毒RNA進(jìn)行稀釋，然后分別取 各個(gè)稀釋倍數(shù)的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果表明，每反應(yīng)病毒RNA拷貝數(shù)從1. 6x109到 1. 6x103是均能擴(kuò)增出目的條帶，而每反應(yīng)病毒RNA拷貝數(shù)從1. 6x102到1. 6x100均不能 擴(kuò)增出目的條帶，上述結(jié)果表明，該人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR最低檢測(cè)下限為 1600拷貝/每反應(yīng)，與常規(guī)單一冠狀病毒檢測(cè)所用RT-PCR及real-time RT-PCR靈敏性相 當(dāng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述人冠狀病毒通用引物One-step RT-PCR 檢測(cè)特異性驗(yàn)證，病毒 RNA 分別以 HC〇V-NL63、HC〇V-〇C43、HC〇V-229E、HC〇V-HKU1 以 及Influenza virusA、Influenza virus B、諾如病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒、人 鼻病毒為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，分別以上述四 種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為通用引物進(jìn)行One-st印RT-PCR反 應(yīng)后都能擴(kuò)增出大小為600bp的單一目的條帶，而加入其它病毒RNA模板均不能擴(kuò)增出條 帶，表明該人冠狀病毒通用檢測(cè)引物對(duì)特異性較好。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104498636SQ201510012641
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2015年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月9日
【發(fā)明者】耿合員, 汪圣強(qiáng), 謝曉謙, 肖雨, 張汀, 李宗 , 譚文杰, 蘇川 申請(qǐng)人:江蘇國際旅行衛(wèi)生保健中心無錫分中心