植物苯丙氨酸解氨酶活性測定用試劑體系及測定方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于酶學(xué)活性分析領(lǐng)域，具體涉及一種植物苯丙氨酸解氨酶活性測定用試劑體系及測定方法，該試劑體系包括以下試劑：緩沖液、試劑1、試劑2、試劑3、試劑4、終止液1、終止液2和校準(zhǔn)溶液，測定方法包括如下步驟：酶液提取、酶促反應(yīng)、酶活性測定、苯丙氨酸解氨酶活性計(jì)算。本發(fā)明提供的植物苯丙氨酸解氨酶活性測定方法，能夠比常規(guī)方法有效地消除干擾，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確地反映植物苯丙氨酸解氨酶的活性。
【專利說明】植物苯丙氨酸解氨酶活性測定用試劑體系及測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶學(xué)活性分析領(lǐng)域，具體設(shè)及一種植物苯丙氨酸解氨酶活性測定用試 劑體系及測定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 苯丙氨酸解氨酶(X-phenylalanine ammonia-lyase, PAL)廣泛存在于各種植物 中，是植物體苯丙燒類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，在植物的生長發(fā)育、色澤形成、抗病抗逆等 方面具有重要作用，在水果、蔬菜等植物組織褐變控制、病害控制、貶藏保鮮等方面也具有 重要影響。苯丙氨酸解氨酶還在食品生物工程和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。
[0003] 目前，植物苯丙氨酸解氨酶活性的檢測方法主要為紫外分光光度計(jì)測定法，即 W k苯丙氨酸作為底物，在苯丙氨酸解氨酶作用下生成產(chǎn)物反式肉桂酸，該產(chǎn)物在波長 290nm處具有吸收峰，測定苯丙氨酸解氨酶酶促反應(yīng)前后產(chǎn)物的吸光度值，根據(jù)的吸光度值 的變化來計(jì)算苯丙氨酸解氨酶活性。該種檢測方法雖然簡便，但是很多物質(zhì)能對紫外分光 光度法產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。比如，植物材料中的抗壞血酸（即維生素 C)、蛋白質(zhì)、氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）、多酪物質(zhì)W及部分核酸化合物在波長290nm處 都可產(chǎn)生光吸收。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于根據(jù)苯丙氨酸解氨酶反應(yīng)底物k苯丙氨酸具有產(chǎn)生巧光該一 特性，提供一種植物苯丙氨酸解氨酶活性測定用試劑體系及測定方法。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種植物苯丙氨酸解氨酶活性測定用試劑體系，該試劑體系包括W下試劑：緩沖 液、試劑1、試劑2、試劑3、試劑4、終止液1、終止液2和校準(zhǔn)溶液，
[0007] 所述試劑體系組成按摩爾濃度如下：
[0008] 緩沖液；10?200mmol/L、抑8. 0?9. 0S哲甲基氨基甲燒-鹽酸溶液或棚酸-棚 砂溶液；
[0009] 試劑1 苯丙氨酸10?200mmol/l，用上述緩沖液作為溶劑配制；
[0010] 試劑2 ;班巧酸0?200mmol/L，用上述緩沖液作為溶劑配制；
[0011] 試劑3 ;甘氨酷亮氨酸0?50mmol/l，用上述緩沖液作為溶劑配制；
[001引試劑4 ;邱S酬10?lOOmmol/L，用上述緩沖液作為溶劑配制；
[0013] 終止液1 ;鹽酸6. Omol/l，用上述緩沖液作為溶劑配制；
[0014] 終止液2 (堿性銅溶液）；酒石酸鐘鋼0. 1?lOOmmol/L、碳酸鋼10?500mmol/L、 硫酸銅0. 01?lOOmmol/l，用上述緩沖液作為溶劑配制；
[00巧]校準(zhǔn)溶液；20mmol/L的k苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用上述緩沖液作為溶劑配制。
[0016] 一種采用所述的試劑體系的植物苯丙氨酸解氨酶活性測定方法，包括如下步驟：
[0017] a)酶液提取
[001引稱取植物樣品，加入經(jīng)預(yù)冷的緩沖液，其中，樣品（質(zhì)量）與緩沖液（體積）的質(zhì) 量體積比為1?2 ;1?5,冰浴研磨勻漿后，離屯、，收集上清液作為苯丙氨酸解氨酶液備用；
[0019] b)酶促反應(yīng)
[0020] 將試管分為初始管、終止管、標(biāo)準(zhǔn)管，在初始管和終止管中分別加入緩沖液、試劑1 和步驟a中提取的苯丙氨酸解氨酶液，混合，其中，緩沖液、試劑1和苯丙氨酸解氨酶液的體 積比為10?40 ;1?10 ;1?10 ;
[0021] 在標(biāo)準(zhǔn)管中加入與在初始管和終止管中所加入的緩沖液相等體積的緩沖液、與在 初始管和終止管中所加入的試劑1相等體積的校準(zhǔn)溶液、與在初始管和終止管中所加入的 苯丙氨酸解氨酶液相等體積的緩沖液，混合；
[0022] 將初始管置于30?50°C水浴后，立即加入終止液1，混合得到初始管反應(yīng)液，流水 冷卻至室溫，加入的終止液1與初始管反應(yīng)液的體積比為1?5 ;12?48 ;
[0023] 將終止管置于30?50°C水浴保溫30?90min后，加入與初始管中相等體積的終 止液1，混合得到終止管反應(yīng)液，流水冷卻至室溫；
[0024] 在標(biāo)準(zhǔn)管中加入與初始管中相等體積的終止液1，混合得到標(biāo)準(zhǔn)管反應(yīng)液；
[002引 C)酶活性測定
[0026] 依次將試劑2、試劑3、試劑4分別加入到初始管反應(yīng)液、終止管反應(yīng)液和標(biāo)準(zhǔn)管反 應(yīng)液中，混合得到初始管混合液、終止管混合液和標(biāo)準(zhǔn)管混合液，其中試劑2、試劑3、試劑4 與初始管反應(yīng)液的體積比為0?30 ;0?6 ;2?50 ;700?6500,試劑2、試劑3、試劑4與 終止管反應(yīng)液的體積比為0?30 ;0?6 ;2?50 ;700?6500,試劑2、試劑3、試劑4與標(biāo) 準(zhǔn)管反應(yīng)液的體積比為0?30 ;0?6 ;2?50 ;700?6500 ;
[0027] 將初始管混合液、終止管混合液和標(biāo)準(zhǔn)管混合液置于50?70°C水浴保溫20? 80min，取出，流水冷卻4?6min ;
[002引在冷卻后的初始管混合液、終止管混合液和標(biāo)準(zhǔn)管混合液中分別加入等體積的終 止液2,混合得到初始管終止液、終止管終止液和標(biāo)準(zhǔn)管終止液，終止液2與初始管混合液 的體積比為10?300:245?6545,終止液2與終止管混合液的體積比為10?300:245? 6545,終止液2與標(biāo)準(zhǔn)管混合液的體積比為10?300:245?6545 ;
[0029] 將初始管終止液、終止管終止液和標(biāo)準(zhǔn)管終止液置于室溫下避光溫育，分別測定、 記錄初始管終止液、終止管終止液和標(biāo)準(zhǔn)管終止液巧光強(qiáng)度數(shù)值；
[0030] d)苯丙氨酸解氨酶活性計(jì)算
[0031] W單位時(shí)間單位質(zhì)量樣品苯丙氨酸解氨酶在反應(yīng)體系中消耗1 ymol心苯丙氨酸 為1個(gè)苯丙氨酸解氨酶活性單位，計(jì)算公式為：
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種植物苯丙氨酸解氨酶活性測定用試劑體系，其特征在于： 該試劑體系包括以下試劑：緩沖液、試劑1、試劑2、試劑3、試劑4、終止液1、終止液2和 校準(zhǔn)溶液， 所述試劑體系組成按摩爾濃度如下： 緩沖液：10?200mmol/L、pH 8. O?9. O三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液或硼酸-硼砂 溶液； 試劑I :L-苯丙氨酸10?200mmol/L，用上述緩沖液作為溶劑配制； 試劑2 :琥珀酸0?200mmol/L，用上述緩沖液作為溶劑配制； 試劑3 :甘氨酰-L-亮氨酸0?50mmol/L，用上述緩沖液作為溶劑配制； 試劑4 :茚三酮10?100mmol/L，用上述緩沖液作為溶劑配制； 終止液1 :鹽酸6. Omol/L，用上述緩沖液作為溶劑配制； 終止液2 (堿性銅溶液）：酒石酸鉀鈉0. 1?100mmol/L、碳酸鈉10?500mmol/L、硫酸 銅0. 01?100mmol/L，用上述緩沖液作為溶劑配制； 校準(zhǔn)溶液：20mmol/L的L-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用上述緩沖液作為溶劑配制。
2. -種采用如權(quán)利要求1所述的試劑體系的植物苯丙氨酸解氨酶活性測定方法，其特 征在于： 包括如下步驟： a) 酶液提取 稱取植物樣品，加入經(jīng)預(yù)冷的緩沖液，其中，樣品（質(zhì)量）與緩沖液（體積）的質(zhì)量體 積比為1?2 :1?5,冰浴研磨勻漿后，離心，收集上清液作為苯丙氨酸解氨酶液備用； b) 酶促反應(yīng) 將試管分為初始管、終止管、標(biāo)準(zhǔn)管，在初始管和終止管中分別加入緩沖液、試劑1和 步驟a中提取的苯丙氨酸解氨酶液，混合，其中，緩沖液、試劑1和苯丙氨酸解氨酶液的體積 比為10?40 :1?10 :1?10 ; 在標(biāo)準(zhǔn)管中加入與在初始管和終止管中所加入的緩沖液相等體積的緩沖液、與在初始 管和終止管中所加入的試劑1相等體積的校準(zhǔn)溶液、與在初始管和終止管中所加入的苯丙 氨酸解氨酶液相等體積的緩沖液，混合； 將初始管置于30?50°C水浴后，立即加入終止液1，混合得到初始管反應(yīng)液，流水冷卻 至室溫，加入的終止液1與初始管反應(yīng)液的體積比為1?5 :12?48 ; 將終止管置于30?50°C水浴保溫30?90min后，加入與初始管中相等體積的終止液 1，混合得到終止管反應(yīng)液，流水冷卻至室溫； 在標(biāo)準(zhǔn)管中加入與初始管中相等體積的終止液1，混合得到標(biāo)準(zhǔn)管反應(yīng)液； c) 酶活性測定 依次將試劑2、試劑3、試劑4分別加入到初始管反應(yīng)液、終止管反應(yīng)液和標(biāo)準(zhǔn)管反應(yīng)液 中，混合得到初始管混合液、終止管混合液和標(biāo)準(zhǔn)管混合液，其中試劑2、試劑3、試劑4與初 始管反應(yīng)液的體積比為0?30 :0?6 :2?50 :700?6500,試劑2、試劑3、試劑4與終止 管反應(yīng)液的體積比為0?30 :0?6 :2?50 :700?6500,試劑2、試劑3、試劑4與標(biāo)準(zhǔn)管 反應(yīng)液的體積比為0?30 :0?6 :2?50 :700?6500 ; 將初始管混合液、終止管混合液和標(biāo)準(zhǔn)管混合液置于50?70°C水浴保溫20?80min， 取出，流水冷卻4?6min ; 在冷卻后的初始管混合液、終止管混合液和標(biāo)準(zhǔn)管混合液中分別加入等體積的終止液 2,混合得到初始管終止液、終止管終止液和標(biāo)準(zhǔn)管終止液，終止液2與初始管混合液的體 積比為10?300:245?6545,終止液2與終止管混合液的體積比為10?300:245?6545， 終止液2與標(biāo)準(zhǔn)管混合液的體積比為10?300:245?6545 ; 將初始管終止液、終止管終止液和標(biāo)準(zhǔn)管終止液置于室溫下避光溫育，分別測定、記錄 初始管終止液、終止管終止液和標(biāo)準(zhǔn)管終止液熒光強(qiáng)度數(shù)值； d)苯丙氨酸解氨酶活性計(jì)算 以單位時(shí)間單位質(zhì)量樣品苯丙氨酸解氨酶在反應(yīng)體系中消耗1 μ mol L-苯丙氨酸為1 個(gè)苯丙氨酸解氨酶活件單位，計(jì)筧公式為：
3.如權(quán)利要求2所述的植物苯丙氨酸解氨酶活性測定方法，其特征在于： 步驟c中，溫育時(shí)間為20?30min，測定條件為激發(fā)波長350?380nm，發(fā)射波長450? 520nm〇
【文檔編號】C12Q1/527GK104513848SQ201510015426
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2015年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月13日
【發(fā)明者】曹建康, 丁薪源, 王睿, 袁樹枝, 王姣, 謝芳, 潘寒姁, 姜微波 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)