一種唐古特白刺N(yùn)tCIPK9基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種唐古特白刺 NtCIPK9 基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用，所述 NtCIPK9 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明根據(jù)唐古特白刺的抗逆特性，利用唐古特白刺的葉片組織，在已有的部分轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，同源克隆了唐古特白刺抗逆相關(guān)的 CIPK 基因全長(zhǎng)，依據(jù)擬南芥中的同源基因而命名為 NtCIPK9 。通過(guò) NtCIPK9 基因純合擬南芥植株的耐鹽性分析，證明了唐古特白刺 NtCIPK9 基因在植物耐鹽方面的功能，為植物抗逆基因庫(kù)增加資源。
【專利說(shuō)明】—種唐古特白刺及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種唐古特白刺#(677--因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]唐古特白刺(Nitrariatangutorum)屬于蔡藜科(ZygophyIIaceae)白刺屬(Iiiraria)，強(qiáng)旱生落葉灌木，為中國(guó)特有白刺種類，主要分布于我國(guó)西北部地區(qū)。唐古特白刺抗旱、耐鹽堿、防風(fēng)沙、耐貧瘠，可改善鹽堿質(zhì)土壤，提高土壤肥力，防風(fēng)固沙，維持綠洲，保護(hù)生態(tài)平衡。其漿果狀核果富含維生素C、黃酮、蛋白質(zhì)、以及19種氨基酸和21種微量元素，具有食用價(jià)值。此外，其果實(shí)還具有健脾胃，降血脂，降血糖以及抗氧化等藥用價(jià)值。唐古特白刺作為一種生態(tài)和經(jīng)濟(jì)植物逐漸受到關(guān)注。目前，對(duì)唐古特白刺的研究主要集中在抗旱耐鹽生理生化性質(zhì)，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分分析以及育種等方面，為唐古特白刺的分子機(jī)理研究提供大量的數(shù)據(jù)支持，為抗性基因及其它功能基因的運(yùn)用奠定基礎(chǔ)。
[0003]CIPKs1.CZ?Z-1nteracting protein kinase), Ca2+信號(hào)途徑中與上游⑶對(duì)寺異性相互作用的蛋白激酶，這類蛋白在N端含有保守的SNF激酶結(jié)構(gòu)域和C端的NAF結(jié)構(gòu)域。在模式植物擬南芥中有26個(gè)￠77?類同源異型盒基因，水稻中有30個(gè)￠77?類同源異型盒基因，楊樹中有27個(gè)￠77?類同源異型基因。另外，到目前為止，還沒(méi)有在植物以外的物種中發(fā)現(xiàn)類似基因，因此￠7/?基因是植物所特有的Ca2+信號(hào)通路中的Ser/Thr類磷酸蛋白激酶基因。眾多研究表明，植物所特有的￠7/?類基因在植物耐鹽，耐低鉀，抗寒和抗旱等抗逆過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
[0004]在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)因是植物響應(yīng)低鉀環(huán)境的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控基因。在擬南芥突變體apk9-m直株與野生型相比，其生長(zhǎng)明顯受到低鉀環(huán)境的抑制?！?7--因啟動(dòng)子的GUS染色和熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析表明，￠77--因在擬南芥的根莖葉中均有表達(dá)。根部的表達(dá)主要是在根部的成熟區(qū)，包括根毛，在根尖和伸長(zhǎng)區(qū)并無(wú)CIP纖因的表達(dá)。此外，在擬南芥的花瓣，萼片和莢果中也能檢測(cè)到￠7/--因的表達(dá)。分子生物學(xué)研究證明了 CIPK9與CSL5共同作用，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)鉀離子平衡。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種唐古特白刺
因。本發(fā)明的另一目的是提供唐古特白刺因的表達(dá)蛋白。本發(fā)明還有一目的是提供唐古特白刺#(￠7/--因在植物耐鹽育種中的應(yīng)用。
[0006]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種唐古特白刺因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]上述的唐古特白刺因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]上述的唐古特白刺因在植物耐鹽育種中的應(yīng)用。
[0009]含有唐古特白刺N(yùn)tCIP纖因的載體。
[0010]含有唐古特白刺因的宿主細(xì)胞。
[0011]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明根據(jù)唐古特白刺的抗逆特性，利用唐古特白刺的葉片組織，在已有的部分轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，同源克隆了唐古特白刺抗逆相關(guān)的CIPK基因全長(zhǎng)，依據(jù)擬南芥中的同源基因而命名為在正常培養(yǎng)環(huán)境中，唐古特白刺
因過(guò)表達(dá)的擬南芥T3代純合植株的生長(zhǎng)發(fā)育與野生型無(wú)明顯差異。在鹽脅迫處理過(guò)程中，轉(zhuǎn)財(cái)￠7/--因純合株的耐鹽性大于野生型擬南芥。通過(guò)#(67/--因純合擬南芥植株的耐鹽性分析，證明了唐古特白刺#(￠7/--因在植物耐鹽方面的功能，為植物抗逆基因庫(kù)增加資源，這對(duì)于提高植物的耐鹽性研究具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1是唐古特白刺總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2是因片段克隆，5’ RACE，3’ RACE以及因全長(zhǎng)克隆的PCR結(jié)果;
圖3是因的表達(dá)載體圖；
圖4是Tl代擬南芥植株篩選結(jié)果；
圖5是轉(zhuǎn)基因擬南芥種子子葉萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)圖；
圖6是擬南芥種子在含鹽培養(yǎng)基上萌發(fā)后兩周的生長(zhǎng)狀態(tài)圖；
圖7是轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽處理10天后生長(zhǎng)表型圖；
圖8是轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽處理10天后葉片及側(cè)根數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；
圖9是轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽處理10天后主根長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；
圖10是轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽處理10天后植株整體干重統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；
圖11是鹽溶液處理轉(zhuǎn)基因擬南芥表型圖；
圖12是200mM鹽水處理轉(zhuǎn)基因擬南芥4天后的擬南芥表型圖。

【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0014]實(shí)施例1
以唐古特白刺的葉片為材料，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)成cDNA，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物進(jìn)行PCR，瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的條帶，與PMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，測(cè)序并分析。確定為目的序列后，依據(jù)該序列設(shè)計(jì)RACE引物，PCR獲取5’和3’序列，測(cè)序分析后，拼接得到全長(zhǎng)序列。依據(jù)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，PCR獲得全長(zhǎng)片段，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，再次測(cè)序和分析，確定為全長(zhǎng)片段后，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提，加入酶切位點(diǎn)后與載體PBI121同時(shí)雙酶切，在T4連接酶的作用下連接后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105和GV3101中，待擬南芥適齡后，通過(guò)花器官浸泡轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲取Tl代和T2代種子，篩選到純合T3代后，進(jìn)行鹽處理，表型觀察和耐鹽性分析。具體如下:
(I)總RNA的提取
以唐古特白刺的葉片為材料，按照NORGEN試劑盒B1tek)的操作步驟進(jìn)行RNA的提取，所使用的試劑和耗材均處理使其無(wú)RNA酶。唐古特白刺葉片總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，條帶清晰；測(cè)定總RNA的吸光度，OD26tZOD28tl值為2.01，OD 260/OD23tl為1.98，可見(jiàn)RNA質(zhì)量較好。
[0015]RNA提取的具體過(guò)程為:加入800 μ LLysis Solut1n磨樣。勻漿后將裂解液轉(zhuǎn)移至新管中?；靹?min使其徹底裂解，12000rpm離心2min,上清移至新管中。加入等體積的70%乙醇，渦旋混勻。將混合液移至柱子中(下接2ml收集管)，離心lmin，倒掉濾液，放回收集管。i)PA 400 μ L Wash Solut1n，離心lmin，棄濾液，放回收集管。加入DNAI工作液，12000rpm離心 lmin,將濾液吸回柱子上，25-3CTC靜置 15min。加入 400 μ L Wash Solut1n,12000rpm 離心 lmin,棄濾液。第三次加入 400 μ L Wash Solut1n, 12000rpm 離心 lmin,棄濾液。將柱子放回收集管，12000rpm離心2min，棄收集管。將柱子放入1.7ml管子中加入50 μ LElut1n Solut1n。200~2000rpm 離心 2min, 12000rpm 離心 lmin,體積不足 50 μ L,再用 14000rpm 離心 lmin。
[0016](2)cDNA 的獲得
以所提RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,所使用的是Invitrogen公司的SuperScript?III First-Strand Synthesis Kit。實(shí)驗(yàn)中的RNA使用量為I μ g,具體過(guò)程為:配置反應(yīng)液(I μ L RNA ? 5 μ g), I μ LPrimer (OligodT), I μ L 1mM dNTPmix,DEPC-Treatedffater,up to 10 μ L),短暫低速離心后,65°C 5min,立即置于冰上l~2min。向上一步的管中加入試劑(2yL I OXRT Buffer,4y L 25mM MgCl2,2y L 0.1M DTT, I μ LRNaseOUT (40U/ μ L),I μ LSuperScript III RT)，置于 PCR 儀上，反應(yīng)程序?yàn)?50°C 50min,85°C 5min。將上一步的反應(yīng)液離心，每管中加入I μ L的RNase H ,37°C 20min。
[0017](3)目的基因的同源克隆
根據(jù)唐古特白刺的部分轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)NCBI Blast進(jìn)行保守的特異性序列分析，利用01igo7設(shè)計(jì)引物，克隆#(677--因片段，然后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化測(cè)序和序列分析，確定為目的基因?？寺∫铮琍CR體系和PCR程序如下所示。克隆結(jié)果如圖2-A所示。
[0018]NtCIPK9片段克隆引物為:
CIPK9 forward primer: 5’-GTGATCAAGTCCTGCGTCACAA-3’ ，
CIPK9 reverse primer: 5’-CTACCTCAAACACCTCAGTGGCTAC-3’ 。
[0019]PCR 反應(yīng)體系(20μ L)為:2μ L 1xPCR BufferU.2μ L Mg2+ (25mM/L)、0.4 μ L10xdNTP、0.1 μ L Tag (5.0U/ul)、lμ L Forward primer (10uM/L)>I μ L Reverse primer(10uM/L)U μ L Template cDNA (lOOng/ul )、13.3 μ L ddH20。
[0020]PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C變性5min，55°C退火30s，72°C延長(zhǎng)lmin，35個(gè)循環(huán)。
[0021](4)目的基因5’端和3’端序列克隆
利用01igo7設(shè)計(jì)RACE引物，進(jìn)行￠77--因3’末端和5’末端的克隆，切膠回收獲得目的片段，然后與載體PMD19-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆，測(cè)序和序列分析，確定獲得因的兩個(gè)末端序列后，拼接得到因全長(zhǎng)序列。RACE引物，PCR反應(yīng)體系和程序如下所示?？寺〗Y(jié)果如圖2-B~G所示。
[0022]RACE 引物為:
CIPK9-.V race primer A:5’ -GTGGATGCCGTTTTCAATGACTCGAAGG-3’，
CIPK9-.V race primer B:5’-CCTCGAGAACTTATTTGAGAAGCAGACGGG-3’，
CIPK9-.V race primer C 5’-GAGAAGCAGACGGGTCTTGTGAAGCGAG-3’，
CIPK9\^ race primer A 5’ -CCGCACTTGCTGCGACAGCGCAC-3’， CIPK9-.W race primer B 5’ -TCTGTTCGACCATCTTGTGACGCAGGACTTG-3 ’，
CIPK9\^ race primer C 5’ -CTCCGGTCTCAATCTTGGCGAATTTCACC-3’，
RACE A item 的 PCR 反應(yīng)體系(20 μ L)為:2 μ L 1^ PCR BufferU.2μ L Mg2+ (25mM/L),0.4μ L 1(Τ dNTP、0.1 μ L Tag (5.0U/ul) U μ LCIPK9:3V 5，race primer A(10uM/L)、I μ LlCT Universal Primer A Mix> IuL Template cDNA (lOOng/ul )、13.3 μ L ddH20。
[0023]RACE A item 的 PCR 反應(yīng)程序:95°C變性 5min，67°C/69°C退火(3，end/5’ end)30s，72°C延長(zhǎng)(3，end/5，end) 40s/35s，35 循環(huán)。
[0024]RACE B 和 C item 的 PCR 反應(yīng)體系(20 μ L)為:2 μ L 1^ PCR BufferU.2 μ L Mg2+(25mM/L),2y L dNTP、0.4 μ LKode、0.6 μ L Universal Primer A Mix、0.6 μ LCIPK9:3，/5’race primer B/C、I μ LDiluent of race A product、12.2 μ L ddH20o
[0025]RACE B 和 C item 的 PCR 反應(yīng)程序:94 °C 預(yù)變性 2min，98 °C 變性 10s，67 °C /66 °C /68 °C /68°C 退火(3，race B /3，raceC/5，raceB/5，raceC) 30s，68 °C 延長(zhǎng)(3，end/5，end) 40s/35s, 35 循環(huán)。
[0026](5)基因全長(zhǎng)獲取
根據(jù)￠77--因全長(zhǎng)序列，利用01igo7設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，克隆得到全長(zhǎng)基因，切膠回收目的條帶，與PMD19-T連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，確定￠77--因的ORF是完整的。唐古特白刺的￠7/--因全長(zhǎng)為1735bp，命名為#(677--具體序列如SEQ IDN0.1所示,所表達(dá)的蛋白序列如SEQ ID N0.2所示,包括443個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框(0RF)。全長(zhǎng)基因克隆的引物，PCR反應(yīng)體系、程序以及克隆結(jié)果具體如下:
全長(zhǎng)基因克隆引物為:
CIPK9:wl forward primer:5' - GGATCCATGAATAAGGTACCGGGGAC-3’，
CIPK9:wl reverse primer:5' - CCCGGGCGTGATTTCTTTACAGC-3’，
Forward restricted site of BamHI:5' -G Λ GATCC-3',
Reverse restricted site of SmaI:5' -CCC Λ GGG-3',
PCR 反應(yīng)體系(20 μ L)為:2 μ L 1(TPCR BufferU.2μ L Mg2+ (25mM/L)、0.4 μ LICT dNTP、0.1 μ L Tag (5.0U/ul)、I μ LForward primer (10uM/L)、I μ LReverse primer(10uM/L)U μ L Template cDNA (lOOng/ul )、13.3 μ L ddH20。
[0027]PCR 反應(yīng)程序:95°C變性 5min，63°C退火 30s，72°C延長(zhǎng) lmin30s，35 循環(huán)。
[0028]因片段克隆，5’RACE，3’RACE以及因全長(zhǎng)克隆的PCR結(jié)果如圖2所示，其中，圖2-A為從白刺葉片中克隆到的￠77--因片段；B為￠77--因3’ RACEA引物克隆產(chǎn)物；C為￠77--因3’ RACE B引物克隆產(chǎn)物；D為￠77--因3’ RACE C引物克隆產(chǎn)物；E為￠77--因5’RACE A引物克隆產(chǎn)物；F為￠77--因5’RACE B引物克隆產(chǎn)物；G為￠77--因5’ RACE C引物克隆產(chǎn)物；H為￠77--因全長(zhǎng)引物克隆產(chǎn)物。
[0029]實(shí)施例2基因功能驗(yàn)證
構(gòu)建35S:67/--表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入野生型哥倫比亞擬南芥中，觀察唐古特白刺N(yùn)tCIP纖因是否能增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性，比較轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的表型差異，推測(cè)唐古特白刺￠7/--因的功能。
[0030]I)載體的構(gòu)建
本發(fā)明所用大腸桿菌菌株為E.coli JM109 (寶生物工程(大連)有限公司購(gòu)入);表達(dá)載體為 pBI 121 (B1vector C0.，LTD 公司購(gòu)入)。
[0031]具體過(guò)程如下:
1.通過(guò)PCR向￠77--因片段上下游分別添加BamHI和SmaI酶切位點(diǎn)，PCR體系及反應(yīng)條件同全長(zhǎng)擴(kuò)增，引物分別是:
NtCIPK9F+BamH:5’ -CGCGGATCCATGAATAAGGTACCGGGGAC-3’，
NtCIPK9R+Sma1:5’ -TCCCCCGGGACGTGATTTCTTTACAGCTTTTTC-3’，
2.PCR產(chǎn)物測(cè)序正確后，在T4連接酶的作用下，可進(jìn)行載體的構(gòu)建。使用BamHI和SmaI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)處理空的PBI 121表達(dá)載體。
[0032]雙酶切反應(yīng)體系(20μ L)為:2 μ L 1XK buffer,0.5 μ LBamH I,0.5 μ LSmaI,I μ g回收產(chǎn)物、ddH20補(bǔ)足20 μ L。
[0033]37°C水浴，酶切4h。加入1X終止液停止酶切反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。用AxyPr印DNA Gel Extract1n Kit (AXYGEN)進(jìn)行回收并純化酶切產(chǎn)物，溶于20 μ L的TE緩沖液中。
[0034]3.檢測(cè)所回收的酶切產(chǎn)物濃度，按連接體系加入各試劑(目的片段分子數(shù):載體分子數(shù)=3:1~5:1)，161:過(guò)夜連接。254 1^連接反應(yīng)體系為:2.54 1^ Τ4 DNA ligase buffer(10X )、5 μ L酶切的表達(dá)載體、15.5 μ L酶切的PCR產(chǎn)物、2 μ L Τ4 DNA ligase、ddH20補(bǔ)足25 μ Lo
[0035]4.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109超感細(xì)胞，挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；使用全長(zhǎng)引物進(jìn)行菌液PCR，以篩選陽(yáng)性克隆，之后用AxyPr印PlasmidMiniprepKit (AXYGEN)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。同時(shí)測(cè)序檢測(cè)載體構(gòu)建過(guò)程中是否發(fā)生突變或者缺失現(xiàn)象。構(gòu)建表達(dá)載體如圖3所示。
[0036]2)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
1.本發(fā)明使用的農(nóng)桿菌菌株為GV3101 ( B1vector C0.，LTD公司購(gòu)入)。采用的是液氮凍融法將構(gòu)建好的pBI 121^^677--表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。具體過(guò)程為:1)冰浴融化GV3101感受態(tài)細(xì)胞，加入至少10ng回收純化的表達(dá)載體質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴20~30 min ；2)液氮速凍I min，37°C熱擊3 min，迅速置于冰上l~2min ;3)加入800 μ L無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，28°C，200 rpm復(fù)蘇3.5h;4) 4000 rpm離心3 min，吸掉培養(yǎng)基；5)混勻剩余菌液，涂抹于添加50 mg.L—1卡納霉素的固體LB培基上；6) 28°C倒置培養(yǎng)30~48h ；7)PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0037]2.待種植的健康狀態(tài)的擬南芥生長(zhǎng)至開(kāi)花。將PCR檢測(cè)的陽(yáng)性克隆，搖菌至0D_0.8時(shí),進(jìn)行擬南芥花器官浸泡轉(zhuǎn)化。具體過(guò)程如下:1)將菌液5000 rpm, 5 min離心，收集菌體，用5%蔗糖溶液懸浮；2)在浸泡前，加入SilwetL-77，濃度為0.05%(500 μ L/L)，晃出泡沫；3)將擬南芥的地上部分在農(nóng)桿菌懸浮溶液中浸泡15~30 sec,期間輕輕晃動(dòng),4)將浸過(guò)的擬南芥平躺在托盤里，用保鮮膜覆蓋保濕，錫箔紙密封避光24h ；5)揭開(kāi)錫箔紙，正常條件下培養(yǎng)，當(dāng)種子成熟時(shí)停止?jié)菜?br> [0038]3.收獲干燥的種子，將Tl代種子進(jìn)行篩選，篩選培養(yǎng)基:1/2MS+卡那霉素10mg/L+頭孢200mg/L。篩選結(jié)果如圖4所示。
[0039]4.再移至土里繼續(xù)培養(yǎng)，收取Tl代擬南芥種子后，將種子繼續(xù)進(jìn)行篩選獲得T2代植株。然后，收取T2代擬南芥植株后，將種子繼續(xù)進(jìn)行篩選，獲得純合篩選出T3代純合株系O
[0040]3 )轉(zhuǎn)NtCIPKd基i因擬南芥抗鹽性試驗(yàn)
1.選擇3個(gè)株系的純合轉(zhuǎn)基因擬南芥種子各50粒分別放在含有OmM，10mM和150mMNaCl的1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，種子春化后放于光照下，5天后統(tǒng)計(jì)子葉萌發(fā)率，三個(gè)過(guò)表達(dá)純合轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥株系分別命名為0Χ-1，0Χ-2，0Χ-3和WT。三次重復(fù)試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖5所示。
[0041]統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在正常條件下相同時(shí)間內(nèi)(OmM NaCl處理)，轉(zhuǎn)因的三個(gè)過(guò)表達(dá)株系種子的子葉萌發(fā)率與野生型擬南芥種子的子葉萌發(fā)率無(wú)明顯差異。在10mM鹽處理?xiàng)l件下，過(guò)表達(dá)株系0Χ-1，0Χ-2和0X-3分別比野生型的子葉萌發(fā)率高15.3%，11.3%和14.6%，呈極顯著性差異(P〈0.01)。在150mM鹽處理?xiàng)l件下，三個(gè)過(guò)表達(dá)株系分別比野生型高139.2%, 60.7%和296.4%，其中0X-3與野生型之間差異極顯著(P〈0.01)。從萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，可以增強(qiáng)擬南芥種子萌發(fā)對(duì)鹽的耐受性。
[0042]種子在含鹽培養(yǎng)上萌發(fā)生長(zhǎng)兩周后，觀察轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的表型。三次重復(fù)試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。生長(zhǎng)表型如圖6所示。觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的生長(zhǎng)狀態(tài)，可知#(677--正常條件下不會(huì)影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育，在10mM和150mM鹽處理?xiàng)l件下，可以增強(qiáng)植物對(duì)鹽的耐受性，表現(xiàn)出比野生型更好的生長(zhǎng)狀態(tài)。
[0043]2.將三個(gè)純合株系擬南芥種子和野生型擬南芥種子正常萌發(fā)生長(zhǎng)10天后，轉(zhuǎn)移到分別含有OmM (未處理組)和150mM NaCl (處理組)的培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)10天后，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，并統(tǒng)計(jì)生物量。三次重復(fù)試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。試驗(yàn)植株生長(zhǎng)表型如圖7所示；試驗(yàn)植株生物量統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖8、9和10所示，其中每個(gè)數(shù)據(jù)均來(lái)自于6個(gè)以上平行試驗(yàn)的平均值。
[0044]鹽處理擬南芥幼苗的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不會(huì)影響植株的正常生長(zhǎng)，在鹽處理?xiàng)l件下可以增強(qiáng)幼苗的抗鹽能力。由統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可知，在正常生長(zhǎng)條件下(OmM NaCl處理)，轉(zhuǎn)基因株系OX-1，0X-2和0X-3的葉片數(shù)量分別比野生型多27.9%，16.3%和27.9%，呈差異顯著性(P〈0.05);在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因株系OX-1，0X-2和0X-3的側(cè)根數(shù)量分別野生型多-22.9%, 4.9%和-18.0% ;轉(zhuǎn)基因株系0X_1，0X-2和0X-3的主根長(zhǎng)度分別比野生型長(zhǎng)-12.8%, 21.5%和20.5%，其中0X-2與野生型之間差異顯著(P〈0.05);轉(zhuǎn)基因株系OX-1,0X-2和0X-3的植株整體干重比野生型重23.5%，13.0%和78.3%，其中OX-1與野生型之間差異顯著(P〈0.05)。在150mM NaCl處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系0X_1，0X-2和0X-3的葉片數(shù)量分別比野生型多-4.1%, 4.1%和8.2% ;轉(zhuǎn)基因株系0Χ-1，0Χ-2和0X-3的側(cè)根數(shù)量分別野生型多20.5%, 44.1%和38.2%，其中0X-2與野生型之間呈差異顯著性(P〈0.05);轉(zhuǎn)基因株系OX-1，0X-2和0X-3的主根長(zhǎng)度分別比野生型長(zhǎng)61.1%，148%和70.3%，其中0X-2和0X-3與野生型之間呈差異極顯著性(P〈0.01);轉(zhuǎn)基因株系OX-1，0X-2和0X-3的植株整體干重比野生型重157.7%，76.3%和48.4%，OX-1和0X-2與野生型之間呈差異極顯著性。綜上分析可知，在鹽環(huán)境中，轉(zhuǎn)#(￠7/--因的擬南芥植株與野生型相比，葉片數(shù)多，側(cè)根數(shù)量多，主根長(zhǎng)度長(zhǎng)以及植株整體干重高，進(jìn)一步證明了 #(￠7/--因可以增強(qiáng)擬南芥耐鹽性的功倉(cāng)泛。
[0045]3.擬南芥種子萌發(fā)一周后，將轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥各20株轉(zhuǎn)移到泥炭土中生長(zhǎng),每盆種一株,兩周后,配制200mM的鹽水進(jìn)行澆灌處理，處理周期為4天。三次重復(fù)試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。
[0046]鹽水澆灌I天后，野生型擬南芥葉片輕微萎焉，轉(zhuǎn)基因擬南芥為發(fā)生明顯變化；第2天后，野生型葉片明顯萎焉，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片開(kāi)始卷曲；第3天后，野生型擬南芥葉片出現(xiàn)枯死斑點(diǎn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥開(kāi)始明顯萎焉；第4天后，野生型擬南芥枯死，轉(zhuǎn)基因擬南芥明顯萎焉；其表型如圖11所示。鹽水澆灌處理4天后，用清水恢復(fù)，并觀察后期生長(zhǎng)。
[0047]200mM鹽水處理4天后的擬南芥表型如圖12所示，其中，A為清水恢復(fù)鹽處理擬南芥I天后的表型圖；B、C為清水恢復(fù)10后的表型圖,可知,轉(zhuǎn)基因擬南芥在清水恢復(fù)后,仍正常生長(zhǎng)，并開(kāi)花結(jié)果；野生型擬南芥在鹽水澆灌處理4天后無(wú)法恢復(fù)，最終死亡。鹽水澆灌試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了財(cái)^/7%功曾強(qiáng)植株耐鹽性的功能。
【權(quán)利要求】
1.一種唐古特白刺因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的唐古特白刺因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
3.權(quán)利要求1所述的唐古特白刺#(￠7/--因在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用。
4.含有權(quán)利要求1所述的唐古特白刺因的載體。
5.含有權(quán)利要求1所述的唐古特白刺#(￠7/--因的宿主細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N9/12GK104498514SQ201510026143
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2015年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月20日
【發(fā)明者】成鐵龍, 魯路, 陳金慧, 施季森, 周艷威, 鄭晨, 盛宇, 史勝青, 楊秀艷, 李霞 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)