本發(fā)明涉及合成生物學以及飼料領域，更特別地，涉及使用工程化的解酯耶氏酵母分解秸稈來產生高蛋白飼料成分的方法。

背景技術：
纖維素是地球上最豐富的多糖類生物質，它廣泛而大量地存在于谷物、豆類、麥類及其加工副產品等畜禽飼料里，是多個葡萄糖殘基以β-1,4-糖苷鍵連接而成的多聚物，其基本單位為纖維二糖。在天然秸稈中，木質素和半纖維素形成牢固結合層，緊密地包圍纖維素。除了反芻動物借助瘤胃微生物可以利用一部分纖維素外，豬、雞等單胃動物胃腸道內因缺乏纖維素酶而不能利用，大大限制了秸稈在飼料行業(yè)的應用范圍。粗纖維是反芻動物飼料中重要的組分之一，起到提供能量、促進胃腸道對飼料消化吸收、維持瘤胃正常生理等功能作用。秸稈飼料中的纖維素若分解得到單糖或者寡糖，并將部分單糖轉化為單細胞蛋白，能有效提高秸稈飼料的利用效率。解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)是一種具代表性的非常規(guī)酵母，解脂耶氏酵母可用于食品和藥物生產。其底物范圍廣、分泌表達能力較強、沒有致病性，并且能利用有機酸、蛋白質和烷烴類等廉價物質的作為底物，并能大量分泌表達出很多有用的代謝產物，例如有機酸、脂肪酶、磷酸酶等工業(yè)化產品，這些比其它類型酵母更為優(yōu)良的特性使其成為一個理想的表達外源基因的宿主。解脂耶氏酵母從上世紀40年代被發(fā)現以來，越來越受到研究者的關注，并且在上世紀90年代已經被成功開發(fā)為一種新的酵母表達系統。我國作為一個農業(yè)大國,每年都有數千萬噸的農副加工產品的下腳料被作為廢物丟棄，既浪費了資源又污染了環(huán)境。僅以農村秸稈利用為例，每年就有數百萬噸植物秸稈被作為燃料利用，有效利用率很低。因此，需要開發(fā)一種能夠將這些秸稈轉化為優(yōu)質的配合蛋白飼料成分的方法。

技術實現要素：
本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下：一種使用工程化的解酯耶氏酵母生產高蛋白飼料成分的方法，其特征在于，使用分別轉入了密碼子優(yōu)化的β-葡萄糖苷酶編碼基因、密碼子優(yōu)化的外切葡聚糖酶編碼基因和密碼子優(yōu)化的內切葡聚糖酶編碼基因的三種工程化的解酯耶氏酵母的混合物對秸稈與氯化銨的混合物發(fā)酵來生產所述飼料成分，其中，所述密碼子優(yōu)化的β-葡萄糖苷酶編碼基因序列如SEQIDNO:1所示，所述密碼子優(yōu)化的外切葡聚糖酶編碼基因序列如SEQIDNO:2所示，并且所述密碼子優(yōu)化的內切葡聚糖酶編碼基因序列如SEQIDNO:3所示。秸稈是的成熟農作物莖葉(穗)部分的總稱，本發(fā)明所述的秸稈可為小麥、水稻、玉米、薯類、油菜、棉花、甘蔗、高粱等的秸稈或其中兩種或更多種的組合，優(yōu)選為玉米秸稈、水稻秸稈或其組合。所述三種工程化的解酯耶氏酵母以等量混合。所述方法包括以下步驟：1)將秸稈與氮源(例如，氯化銨、硫酸銨、尿素等)以10:1-50:1的重量比配制成培養(yǎng)基，滅菌，例如可在121℃下處理25-30min來滅菌；2)將所述三種工程化的解酯耶氏酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，例如，培養(yǎng)條件可為28℃，200rpm分別搖瓶培養(yǎng)，至OD600＝2.0，將培養(yǎng)得到的三種工程化的解酯耶氏酵母培養(yǎng)物等體積混合，離心收集菌體，將培養(yǎng)得到的三種工程化的解酯耶氏酵母培養(yǎng)物等體積混合，離心收集菌體，重懸于水性液體中，合適的用于重懸的水性液體例如水、磷酸緩沖液等；3)將步驟2)中得到的重懸的工程化的解酯耶氏酵母接種于步驟1)得到的秸稈與氯化銨的混合培養(yǎng)基中，于23-28℃發(fā)酵10-15天后得到發(fā)酵產物。所述發(fā)酵產物可直接作為飼料，或者向其中加入淀粉、氨基酸、維生素、礦物質等添加劑，形成配方飼料。因此，本發(fā)明還提供了一種高蛋白含量的飼料，其包含通過上述方法得到發(fā)酵產物。附圖說明圖1為重組表達載體pINA1297-BG的質粒圖；圖2為重組表達載體pINA1297-EG的質粒圖；圖3為重組表達載體pINA1297-CBH的質粒圖。具體實施方式重組質粒的構建通過NCBI得到纖維素β-葡萄糖苷酶基因(GeneBank：AF163097)、纖維素外切葡聚糖酶基因(GeneBank：AY861348)和纖維素內切葡聚糖酶基因(GeneBank：EU169241)的序列，并以其為基礎分別合成密碼子優(yōu)化的β-葡萄糖苷酶基因序列(SEQIDNO:1)、纖維素外切葡聚糖酶基因序列(SEQIDNO:2)和纖維素內切葡聚糖酶基因序列(SEQIDNO:3)，將所得到的密碼子優(yōu)化的序列分別順著組成型啟動子hp4d的轉錄方向克隆到質粒pINA1297的SfiI和KpnI酶切位點之間，使得組成型啟動子hp4d控制基因的轉錄，從而得到三個重組表達質粒，其分別為帶有β-葡萄糖苷酶基因的pINA1297-BG(圖1)、帶有纖維素外切葡聚糖酶基因的pINA1297-CBH(圖2)和帶有纖維素內切葡聚糖酶基因的pINA1297-EG(圖3)。重組質粒的轉化和篩選用限制性內切酶NotI將三種重組質粒線性化，制作解脂耶氏酵母polh菌株的感受態(tài)，并利用LiAc化學轉化法將三種重組質粒分別轉化至解脂耶氏酵母感受態(tài)細胞中。以不含尿嘧啶的YNB-N5000培養(yǎng)基對轉化株進行初步篩選，再利用菌落PCR的方法篩選出纖維素酶基因成功轉化的重組菌株。將所得重組菌株接種至PPB液體培養(yǎng)基中，在28℃、200rpm條件下進行搖瓶培養(yǎng)，每24小時測定其酶活力大小變化，選擇最佳的轉化株進行后續(xù)的發(fā)酵。本實驗最后選取的解酯耶氏酵母重組菌株分別為Polh-1297-BG、Polh-1297-CBH和Polh-1297-EG。其中Polh-1297-BG搖瓶13天后酶活為14.2U/mL，Polh-1297-EG搖瓶13天后酶活為16.3U/mL，Polh-1297-CBH搖瓶13天后酶活為17.4U/mL。酶活定義為：1mL粗酶液在50℃條件下反應1min產生1微克葡萄糖為一個酶活力單位，即1U。YNB-N5000培養(yǎng)基配方為：0.17％YNB(無氨基酸酵母氮源)，1％葡萄糖，0.5％硫酸銨，1.5％瓊脂粉。所述的PPB液體培養(yǎng)基配方為：2％蔗糖，0.132％酵母粉，0.132％氯化銨，0.032％磷酸二氫鉀，0.0132％硫酸鎂，3.34*10-5％硫胺素，以pH為5.0的0.1M檸檬酸鹽緩沖液定容。秸稈發(fā)酵及蛋白含量測定秸稈底物與氯化銨配制發(fā)酵培養(yǎng)基，于121℃滅菌25-30min。將YPD固體培養(yǎng)基平板上保存的解脂耶氏酵母菌株Polh-1297-BG，Polh-1297-EG,Polh-1297-CBH分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中，在28℃、200rpm的條件下搖瓶擴培。當菌液濃度達到OD600＝2.0時，將三種培養(yǎng)液等體積混合。離心收集菌體，用pH5.0的磷酸緩沖液重懸，接種至待發(fā)酵的秸稈培養(yǎng)基中，于28℃發(fā)酵10-15天。取樣烘干，稱取1.000g(精確到0.002g)發(fā)酵產物至消化管中進行預處理，加2mL0.1M的氫氧化鈉并將消化管置于消化爐上，200℃加熱10min，以消除發(fā)酵培養(yǎng)基中的氯化銨對蛋白含量測定結果的影響。預處理后向消化管中加入催化劑(1.5g硫酸銅，4.5g硫酸鉀)及10ml濃硫酸進行消煮，待消煮完全后利用凱氏定氮儀蒸餾，最后利用0.02M的HCl滴定來測算粗蛋白含量。此發(fā)明中秸稈底物用量、工程化的解酯耶氏酵母用量可根據需要實際需要等比例擴大，秸稈用量可達到百公斤級、噸級規(guī)模。本實驗所用凱氏定氮儀為上海新嘉KDN-C型凱氏定氮儀，消化爐為KDN-08C型數顯溫控消化爐。所述的YPD液體培養(yǎng)基配方為：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖。所述的YPD固體培養(yǎng)基配方為：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1.5％瓊脂粉。以下結合實施例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實施例1發(fā)酵少量玉米秸稈1、在YPD固體平板上挑取工程化的解酯耶氏酵母Polh-1297-BG、Polh-1297-EG和Polh-1297-CBH的單菌落分別接入200mLYPD液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm搖瓶培養(yǎng)。2、在搖瓶培養(yǎng)菌液濃度均達到OD600＝2.0時，將三種菌液按等體積混合，收集500mL菌體，用300mLpH5.0的磷酸緩沖液重懸后加入121℃滅菌處理25min的含50g玉米秸稈及5g氯化銨的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃恒溫發(fā)酵。3、連續(xù)培養(yǎng)10天后,隨機取樣烘干，稱取1.000g(精確到0.002g)發(fā)酵產物樣品，用2mL0.1M氫氧化鈉預處理后，利用凱氏定氮法測定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量為14.54％。4、連續(xù)培養(yǎng)15天后,隨機取樣烘干，稱取1.000g(精確到0.002g)發(fā)酵產物樣品，用2mL0.1M氫氧化鈉預處理后，利用凱氏定氮法測定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量為16.23％。相對于第10天，蛋白含量上升了11.62％。以上實驗數據均由三個平行實驗組求取均值所得。實施例2發(fā)酵大量玉米秸稈1、在YPD固體平板上挑取工程化的解酯耶氏酵母Polh-1297-BG、Polh-1297-EG和Polh-1297-CBH的單菌落分別接入2LYPD液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。2、在發(fā)酵菌液濃度均達到OD600＝2.0時，將三種菌液按等體積混合收集5L菌體，用3LpH5.0的磷酸緩沖液重懸后加入121℃滅菌處理30min的含5kg玉米秸稈及500g氯化銨的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃恒溫發(fā)酵。3、連續(xù)培養(yǎng)10天后，隨機取樣烘干，稱取1.000g(精確到0.002g)發(fā)酵產物樣品，用3mL0.1M氫氧化鈉預處理后，利用凱氏定氮法測定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量為14.84％。4、連續(xù)培養(yǎng)15天后，隨機取樣烘干，稱取1.000g(精確到0.002g)發(fā)酵產物樣品，用3mL0.1M氫氧化鈉預處理后，利用凱氏定氮法測定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量為16.57％。相對于第10天，蛋白含量上升了11.66％。以上實驗數據均由三個平行實驗組求取均值所得。實施例3發(fā)酵少量水稻秸稈1、在YPD固體平板上挑取工程化的解酯耶氏酵母Polh-1297-BG、Polh-1297-EG和Polh-1297-CBH的單菌落分別接種于200mLYPD液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm搖瓶培養(yǎng)。2、在搖瓶培養(yǎng)菌液濃度均達到OD600＝2.0時，將三種菌液按等體積混合，收集500mL菌體，用400mLpH5.0的磷酸緩沖液重懸后加入121℃滅菌處理25min的含50g水稻秸稈及5g氯化銨的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃恒溫發(fā)酵。3、連續(xù)培養(yǎng)10天后，隨機取樣烘干，稱取1.000g(精確到0.002g)發(fā)酵產物樣品，用2mL0.1M氫氧化鈉預處理后，利用凱氏定氮法測定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量為13.28％。4、連續(xù)培養(yǎng)15天后,隨機取樣烘干，稱取1.000g(精確到0.002g)發(fā)酵產物樣品，用2mL0.1M氫氧化鈉預處理后，利用凱氏定氮法測定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量為14.75％。相對于第10天，蛋白含量上升了11.07％。以上實驗數據均由三個平行實驗組求取均值所得。實施例4發(fā)酵大量水稻秸稈1、在YPD固體平板上挑取工程化的解酯耶氏酵母Polh-1297-BG、Polh-1297-EG和Polh-1297-CBH的單菌落分別接入2LYPD液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm搖瓶培養(yǎng)。2、在發(fā)酵菌液濃度均達到OD600＝2.0時，將三種菌液按等體積混合，收集5L菌體，用4LpH5.0的磷酸緩沖液重懸后加入121℃滅菌處理30min的含5kg水稻秸稈及500g氯化銨的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃恒溫發(fā)酵。3、連續(xù)培養(yǎng)10天后，隨機取樣烘干，稱取1.000g(精確到0.002g)發(fā)酵產物樣品，用3mL0.1M氫氧化鈉預處理后，利用凱氏定氮法測定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量為13.72％。4、連續(xù)培養(yǎng)15天后，隨機取樣烘干，稱取1.000g(精確到0.002g)發(fā)酵產物樣品，用3mL0.1M氫氧化鈉預處理后，利用凱氏定氮法測定其中粗蛋白含量，其粗蛋白含量為15.23％。相對于第10天，蛋白含量上升了11.01％。以上實驗數據均由三個平行實驗組求取均值所得。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。