本發(fā)明涉及一種可有效促進鈣吸收的益生菌發(fā)酵補鈣制劑及其制備方法，屬于功能食品技術領域。

背景技術：

鈣是人體含量最豐富、不可或缺的無機元素。 人體中的鈣99％沉積在骨骼和牙齒中，促進其生長發(fā)育，維持其形態(tài)與硬度。 l％存在于血液和軟組織細胞中，如鈣離子對血液凝固有重要作用，缺鈣時血凝發(fā)生障礙，人體會出現(xiàn)各種出血癥狀；鈣離子對神經、肌肉的興奮和神經沖動的傳導有重要作用，缺鈣時人體會出現(xiàn)神經傳導阻滯和肌張力異常等癥狀；鈣離子對細胞的粘著、細胞膜功能的維持有重要作用，缺鈣時則不能保證細胞膜順利地把營養(yǎng)物質“泵”到細胞內；鈣離子對人體內的酶反應有激活作用，鈣缺乏即會影響正常的生理代謝過程。

目前我國城市居民平均每日鈣攝入量只有４００毫克左右，距中國營養(yǎng)學會制定的推薦攝入量８００毫克至１０００毫克相差甚遠，９０％左右人群鈣攝入量嚴重不足，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的因素很多，如膳食結構不合理，蔬菜中的草酸、膳食纖維也會阻止鈣質的吸收；不良的飲食習慣，吸煙、喝酒、常喝碳酸飲料（這些都能造成人體酸性化，使人體中的鈣流失；而碳酸飲料中還含有磷酸，能造成體內鈣磷比例失調，直接阻止鈣的吸收。），常喝濃茶（茶水中的茶堿能阻止人體對鈣的吸收），常喝咖啡（咖啡因能促使體內鈣的流失和尿鈣排出增多），高鹽攝食（使尿鈣排出增多而大量流失）；特殊的生理病理需求，更年期的婦女（雌激素水平突然減少，骨鈣被溶解，脫離骨骼的速度就會加快），糖尿病會引起骨質疏松（糖尿病患者血液中的胰島素水平很低，而胰島素可刺激骨膠原蛋白的形成，幫助骨骼留住鈣質和重建）。

因此，增加人們的鈣的攝入和吸收，刻不容緩?，F(xiàn)有鈣產品主要分為無機鈣和有機鈣，無機鈣包括碳酸鈣、氯化鈣、磷酸鈣等，其優(yōu)點是含鈣量高，缺點是其吸收要靠胃酸的參與，對胃有刺激作用；有機鈣包括檸檬酸鈣、乳酸鈣、葡萄酸鈣、醋酸鈣、膠原蛋白絡合鈣等，其含鈣低，但吸收好。另外，含鈣產品中往往添加一些促吸收因子，如維生素D、大豆異黃酮、酪蛋白磷酸肽、水蘇糖、益生元、雙歧因子等。

現(xiàn)有與補鈣相關的專利雖多，但存在的問題亦很多。有的專利產品中所用原料含不同動物的骨骼，因為重金屬等有毒物質易沉積于動物骨骼中，人若長期服用，易造成二次中毒，如：公布號 CN104397359（一種氨基酸螯合鈣組合物及其制備方法）、CN1181244（一種保健口服液）、CN100534329（一種鈣營養(yǎng)強化劑及其生產工藝）、CN103330128（一種促進女性補鈣及吸收的生食谷疏營養(yǎng)米粉及其生產工藝）、CN103340413（一種骨外壁乳酸菌發(fā)酵骨鈣粉的制備方法）等。

有的專利產品則盲目的加入鈣、鐵、鋅等礦物元素，以求同補或相互促進吸收，但研究發(fā)現(xiàn)鈣、鐵、鋅等元素在吸收過程中相互競爭抑制，彼此干擾，不宜同時補充，如：公布號CN104522657（一種補充多種礦物質的保健食品）、CN1568798（易吸收自動調節(jié)強化骨鈣藥食兼用鈣營養(yǎng)素產品及制造方法）、CN101513259（一種補鈣產品）等。

有的專利產品是將無機鈣或有機鈣與能促進鈣吸收的物質進行調配，促進吸收的物質主要為維生素D、酪蛋白磷酸肽、大豆異黃酮、益生元、益生菌等，但其產品是將各種原料進行簡單的配比、混合，口感、功效往往不盡人意，亦有許多適用人群的限制，如：公布號CN1209047（大豆異黃酮飲料的加工方法）是將乳酸鈣與大豆異黃酮調配；CN101322835（一種復合型補鈣制劑）由碳酸鈣、鹽酸氨基葡萄糖、酪蛋白磷酸肽、大豆異黃酮調配；CN102302116（一種補鈣、鎖鈣保健食品及其制備方法）由鈣、初乳堿性蛋白、硫酸軟骨素、D-氨基葡萄糖、維生素D、酪蛋白磷酸肽組成；CN102630946（一種適用于女性的珍珠大豆鈣軟膠囊及其制備方法）由大豆提取物、碳酸鈣、珍珠粉組成；CN103750310（一種補鈣、促進鈣吸收的植物鈣及其制備方法）由無水葡萄糖、乳粉、白砂糖、麥芽糊精、檸檬酸鈣、聚葡萄糖、低聚半乳糖、氧化鎂、酪蛋白磷酸肽、山藥、黃瓜籽混合制成；CN105166938（一種酪蛋白骨元鈣復合益生菌制劑）由低聚半乳糖、酪蛋白磷酸肽、骨元鈣、益生菌混合制成；CN105055458（防治骨質疏松的益生菌制劑及其制備方法）由納豆芽孢桿菌菌粉、釀酒酵母菌菌粉、碳酸鈣組成。

另外專利CN104211826（一種低聚果糖鈣及含有低聚果糖鈣的口服液）、CN104223067（一種菊粉鈣及含有菊粉鈣的口服液）是將低聚果糖或菊粉依次進行堿化、醚化后，與鈣離子螯合制得，為化工合成的產品，不宜被人們所接受。

現(xiàn)有專利中也有通過添加益生菌菌粉來促進鈣吸收，而益生菌要想發(fā)揮作用，必須能定殖于人體腸道內，大多數(shù)菌體很難有效定殖，勢必影響鈣的吸收效果。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有鈣產品有副作用、安全隱患、功效價值有限等缺點，本發(fā)明提供了一種益生菌發(fā)酵補鈣制劑，所述制劑由精選黃豆生芽處理，經膠體磨磨碎，添加一定量的水，高壓提取后經酶解處理，添加葡萄糖、蛋白胨、碳酸鈣，滅菌后經多株益生菌發(fā)酵，離心取離心液，添加甜味劑、益生元，滅菌即得到益生菌發(fā)酵補鈣制劑。

所述制劑中精選黃豆在益生菌發(fā)酵補鈣制劑中的重量g/體積ml百分比為2~6%。

所述葡萄糖的加入量為重量g/體積ml百分比4~10%，蛋白胨的加入量為重量g/體積ml百分比0.1~0.5%，碳酸鈣的加入量為重量g/體積ml百分比1~5%。

所述益生菌為雙歧桿菌和乳桿菌。

所述雙歧桿菌選自兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌或嬰兒雙歧桿菌；所述乳桿菌選自干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌或植物乳桿菌。

所述甜味劑為塔格糖，益生元為低聚果糖漿。

所述塔格糖的加入量為重量g/體積ml百分比3%；所述低聚果糖漿含量規(guī)格為G 55L，加入量為重量g/體積ml比0.1~0.7%。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種益生菌發(fā)酵補鈣制劑的制備方法，包括以下步驟：

（1）提?。壕x干黃豆，生芽處理，向豆芽中加入適量水，經膠體磨磨碎，115℃高壓提取60分鐘；

（2）酶解：待溫度降至45±2℃時，維持恒溫，用氫氧化鈉調節(jié)pH至8.0，加入胰酶，當pH降至7.5時，加入中性蛋白酶，當pH降至7.0時，結束酶解，按比例加入葡萄糖、蛋白胨、碳酸鈣，115℃高壓滅菌60分鐘，得無菌酶解液；

（3）接種、發(fā)酵：當無菌酶解液溫度降至39±2℃時，于無菌條件下接種預培養(yǎng)的體積百分比為1%的一種雙歧桿菌菌液和體積百分比各為0.5%的兩種乳桿菌菌液，37℃培養(yǎng)48~72小時，當pH值降至4.2時，降低發(fā)酵溫度至28℃，繼續(xù)發(fā)酵至pH值降至4.0，結束發(fā)酵，即得益生菌發(fā)酵液；

（4）離心、滅活：將步驟（3）得到的益生菌發(fā)酵液過管式離心機過濾、離心，得益生菌發(fā)酵液離心液；向益生菌發(fā)酵液離心液中加入甜味劑、益生元，攪勻溶解，定容，121℃滅菌30分鐘，無菌灌裝，即得益生菌發(fā)酵補鈣制劑。

上述制備方法中，在步驟（1）中所述生芽處理是指將精選黃豆在水中室溫浸泡5~10小時，于28℃培育，當芽長2~4厘米時，結束發(fā)芽。

上述制備方法中，在步驟（2）中所述的胰酶、中性蛋白酶均為市售；其中胰酶用量為干黃豆重量的1%，中性蛋白酶用量為干黃豆重量的0.1%。

通過上述制備方法制備的補鈣制劑，以元素鈣計算含量約為6~10mg/ml，總異黃酮苷原的含量為0.09~0.15mg/ml。（見實驗例1）

可將本發(fā)明的益生菌發(fā)酵補鈣制劑，按照已知的常規(guī)方法，添加一種或多種具有相同、相似或不同生物學活性，并對基本活性成分表現(xiàn)有輔助或協(xié)同作用，但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他功能成份或其混合物，如維生素D、大豆異黃酮、酪蛋白磷酸肽、水蘇糖、益生元、雙歧因子等促鈣吸收劑，配制成適于口服的合劑、乳劑等。

也可將本發(fā)明的益生菌發(fā)酵補鈣制劑通過適當?shù)母稍锓椒?，制得固體粉末，添加一種或多種具有相同、相似或不同生物學活性，并對基本活性成分表現(xiàn)有輔助或協(xié)同作用，但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他功能成份或混合物，如維生素D、大豆異黃酮、酪蛋白磷酸肽、水蘇糖、益生元、雙歧因子等促鈣吸收劑，配制成適于口服的膠囊、片劑、顆粒劑等劑型。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明將黃豆進行發(fā)芽處理，發(fā)芽黃豆的異黃酮含量比未發(fā)芽黃豆增加約4倍；以黃豆芽磨碎后作為益生菌發(fā)酵培養(yǎng)基，帶原料渣進行發(fā)酵，將異黃酮轉化為異黃酮苷原，直接被人體吸收，將更加有效的促進鈣的吸收。

2、本發(fā)明利用現(xiàn)代酶解技術，將黃豆經發(fā)芽磨碎高壓提取后，進行酶解，使豆芽中的高分子物質分解為小分子物質，一方面易于人體吸收，另一方面可使制劑的狀態(tài)穩(wěn)定。

3、本發(fā)明利用益生菌乳桿菌發(fā)酵將無機碳酸鈣轉化為有機乳酸鈣，更易于人體對鈣的吸收，安全、無副作用。

4、本發(fā)明模擬人體腸道環(huán)境，利用多株益生菌共生發(fā)酵技術，體外發(fā)酵代謝，次級代謝產物直接作用于人體腸道，有效解決了益生菌難于定殖腸道發(fā)揮作用的弊端，起到調節(jié)腸道環(huán)境，促進鈣吸收。

5、本發(fā)明所選甜味劑為塔格糖，其甜度為蔗糖的92%，熱量為蔗糖的1/3，還具有降血糖的功效，既滿足了甜度的要求，又可被對血糖有嚴格控制的特殊人群飲用，使得本補鈣制劑適用人群更加廣泛。

6、本發(fā)明未添加任何添加劑和防腐劑，經高溫滅菌、無菌灌裝，保質期長，是安全、綠色、環(huán)保的有機健康補鈣制劑。

具體實施方式

以下通過具體實施方式的描述對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領域技術人員根據本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內，實施例中所述物料，均符合相應國家標準。

實施例1：益生菌發(fā)酵補鈣制劑A的制備

具體制備方法如下：

（1）提?。壕x干黃豆2kg，生芽處理，向豆芽中加入100L水，經膠體磨磨碎，115℃高壓提取60分鐘；

（2）酶解：待溫度降至45±2℃時，維持恒溫，用氫氧化鈉調節(jié)pH至8.0，加入胰酶20g，當pH降至7.5時，加入中性蛋白酶2g，當pH降至7.0時，結束酶解，加入葡萄糖10%（重量g/體積ml），蛋白胨0.2%（重量g/體積ml），碳酸鈣2%（重量g/體積ml），115℃高壓滅菌60分鐘，得無菌酶解液；

（3）接種、發(fā)酵：當無菌酶解液溫度降至39±2℃時，于無菌條件下接種預培養(yǎng)的短雙歧桿菌（AS 1.2213）菌液1%（體積百分比）、鼠李糖乳桿菌（AS 1.22）菌液0.5%（體積百分比）、植物乳桿菌（AS 1.19）菌液0.5%（體積百分比），37℃培養(yǎng)60小時，pH值降至4.2，降低發(fā)酵溫度至28℃，繼續(xù)發(fā)酵至pH值降至4.0，結束發(fā)酵，即得益生菌發(fā)酵液；

（4）離心、滅活：將步驟（3）得到的益生菌發(fā)酵液過管式離心機過濾、離心，得益生菌發(fā)酵液離心液；向益生菌發(fā)酵液離心液中加入塔格糖3%（重量g/體積ml）、低聚果糖0.2%（重量g/體積ml），攪勻溶解，定容，121℃滅菌30分鐘，無菌灌裝，即得益生菌發(fā)酵補鈣制劑A。

實施例2：益生菌發(fā)酵補鈣制劑B的制備

具體制備方法如下：

（1）提?。壕x干黃豆4kg，生芽處理，向豆芽中加入100L水，經膠體磨磨碎，115℃高壓提取60分鐘；

（2）酶解：待溫度降至45±2℃時，維持恒溫，用氫氧化鈉調節(jié)pH至8.0，加入胰酶40g，當pH降至7.5時，加入中性蛋白酶4g，當pH降至7.0時，結束酶解，加入葡萄糖8%（重量g/體積ml），蛋白胨0.4%（重量g/體積ml），碳酸鈣3%（重量g/體積ml），115℃高壓滅菌60分鐘，得無菌酶解液；

（3）接種、發(fā)酵：當無菌酶解液溫度降至39±2℃時，于無菌條件下接種預培養(yǎng)的青春雙歧桿菌（AS 1.2190）菌液1%（體積百分比）、植物乳桿菌（AS 1.19）菌液0.5%（體積百分比）、干酪乳桿菌（CGMCC1.2884）菌液0.5%（體積百分比），37℃培養(yǎng)48小時，pH值降至4.2，降低發(fā)酵溫度至28℃，繼續(xù)發(fā)酵至pH值降至4.0，結束發(fā)酵，即得益生菌發(fā)酵液；

（4）離心、滅活：將步驟（3）得到的益生菌發(fā)酵液過管式離心機過濾、離心，得益生菌發(fā)酵液離心液；向益生菌發(fā)酵液離心液中加入塔格糖3%（重量g/體積ml）、低聚果糖0.4%（重量g/體積ml），攪勻溶解，定容，121℃滅菌30分鐘，無菌灌裝，即得益生菌發(fā)酵補鈣制劑B。

實施例3：益生菌發(fā)酵補鈣制劑C的制備

具體制備方法如下：

（1）提取：精選干黃豆6kg，生芽處理，向豆芽中加入100L水，經膠體磨磨碎，115℃高壓提取60分鐘；

（2）酶解：待溫度降至45±2℃時，維持恒溫，用氫氧化鈉調節(jié)pH至8.0，加入胰酶60g，當pH降至7.5時，加入中性蛋白酶6g，當pH降至7.0時，結束酶解，加入葡萄糖6%（重量g/體積ml），蛋白胨0.5%（重量g/體積ml），碳酸鈣4%（重量g/體積ml），115℃高壓滅菌60分鐘，得無菌酶解液；

（3）接種、發(fā)酵：當無菌酶解液溫度降至39±2℃時，于無菌條件下接種預培養(yǎng)的短雙歧桿菌（AS 1.2213）菌液1%（體積百分比）、干酪乳桿菌（CGMCC1.2884）菌液0.5%（體積百分比）、鼠李糖乳桿菌（AS 1.22）菌液0.5%（體積百分比），37℃培養(yǎng)72小時，pH值降至4.2，降低發(fā)酵溫度至28℃，繼續(xù)發(fā)酵至pH值降至4.0，結束發(fā)酵，即得益生菌發(fā)酵液；

（4）離心、滅活：將步驟（3）得到的益生菌發(fā)酵液過管式離心機過濾、離心，得益生菌發(fā)酵液離心液；向益生菌發(fā)酵液離心液中加入塔格糖3%（重量g/體積ml）、低聚果糖0.6%（重量g/體積ml），攪勻溶解，定容，121℃滅菌30分鐘，無菌灌裝，即得益生菌發(fā)酵補鈣制劑C。

實驗例1：

本實驗例旨在通過對本發(fā)明的益生菌發(fā)酵補鈣制劑進行功效成分含量測定，以確定本發(fā)明補鈣制劑的人體使用量。

1. 元素鈣含量測定

本實驗參照GB 25555-2010 L-乳酸鈣標準進行，略有改進，原理為在堿性條件下，樣品消耗絡合劑乙二胺四乙酸二鈉標準滴定液的體積計算元素鈣含量，用鈣試劑羧酸鈉指示劑的顏色變化判斷滴定的終點。具體操作如下：

1.1 試劑和材料

氫氧化鈉溶液：100g/L；

鹽酸溶液：1+4；

乙二胺四乙酸二鈉標準滴定液：c=0.05mol/L；

鈣試劑羧酸鈉指示劑：稱取0.1g鈣試劑羧酸鈉鹽，加10g在約110℃干燥過的氯化鈉研磨，混勻。

1.2 實驗步驟

量取樣品7ml，加入已加有2ml鹽酸溶液的50ml水中，邊攪拌邊滴加15ml乙二胺四乙酸二鈉標準滴定液，再加5ml氫氧化鈉溶液和0.1g鈣試劑羧酸鈉指示劑，用乙二胺四乙酸二鈉標準滴定液滴定至溶液呈藍色為終點。

1.3結果計算

元素鈣的重量mg/體積ml百分比為w%：

w%=(V₁*cM/1000*V₂)*100%

注：V₁：樣品消耗乙二胺四乙酸二鈉標準滴定液的體積（單位ml）；

V₂：樣品體積（單位ml）；

c：乙二胺四乙酸二鈉標準滴定液摩爾濃度（單位mol/L）；

M：元素鈣的摩爾質量（單位g/mol）。

1.4結果

由表1可知：三個實施例制劑A、B、C中元素鈣的含量（mg/ml）分別為9.81、8.56、6.38，其含量范圍約為6~10mg/ml，根據中國營養(yǎng)學會制定的推薦攝入量８００毫克至１０００毫克，可確定本品的飲用量為100ml/天，便可滿足人體鈣的需求量。

表1 益生菌發(fā)酵補鈣制劑A、B、C元素鈣的含量

2 總異黃酮苷原含量測定

本實驗參照GB/T 23788-2009（保健食品中大豆異黃酮的測定方法-高效液相色譜法）標準進行，以大豆素、大豆黃素、染料木素為標準品進行總異黃酮苷原含量測定，以未發(fā)酵與實施例1-3相同濃度的黃豆提取液分別作為對照組A、對照組B和對照組C。

2.1方法

采用HPLC法進行測定，色譜條件為C18柱（250mm×4.6mm，5um）；柱溫：30℃；流動相A：乙腈；流動相B：磷酸水溶液（pH3.0）；流速：1.0ml/min；測定波長：260nm；進樣量：10ul。

2.2 結果

由表2可知：三個實施例制劑A、B、C中總異黃酮苷原的含量（mg/ml）分別為0.09、0.12、0.15，其含量范圍約為0.09~0.15mg/ml，而對照組異黃酮苷原的含量均為0，表明益生菌可將大豆異黃酮轉化為異黃酮苷原，直接被人體吸收，提高了促進鈣吸收的效率。

表2 益生菌發(fā)酵補鈣制劑A、B、C總異黃酮苷原的含量

實驗例2：

本實驗例旨在通過測定本發(fā)明的黃豆經發(fā)芽、酶解處理前后的總可溶性小分子物質的變化，來說明本發(fā)明可將高分子物質轉化為易于人體吸收的小分子物質。

本實驗參照GB 22494-2008 大豆肽粉標準進行，略有改進，其原理為高分子蛋白質在酸性條件下易被沉淀，相對分子質量較小的蛋白質水解物可溶于酸性溶液（包括肽和游離氨基酸），經酸化后，去除沉淀，比較樣品處理前后總可溶性含氮物質的多少，以確定變化情況。

1 方法

取相同重量的干黃豆，一組進行發(fā)芽，膠體磨破碎，高溫提取，酶解處理；一組膠體磨破碎，高溫提??；取相同體積的處理液，加入適量15%三氯乙酸，混勻并靜置5min，離心去除沉淀，濾液備用，按GB 22494-2008中B.4.1.2~B.4.1.4操作步驟進行，測定計算總可溶性含氮物質。

2 結果

由表3可知，處理前小分子的可溶性肽和游離氨基酸的總量為2.1mg/g(干黃豆)，處理后含量為20.2mg/g(干黃豆)，是未處理組的約10倍，說明本發(fā)明可將高分子物質轉化為易于人體吸收的小分子物質。

表 3 黃豆經發(fā)芽、酶解處理前后總可溶性含氮物質含量