本發(fā)明屬于乳酸菌和果蔬加工的技術領域，具體涉及一種具有抗氧化活性的發(fā)酵混合果蔬汁飲料及制備方法。

背景技術：

近年來，消費者日益追求天然健康無添加的食品，益生菌制品顯然很符合消費者需求。然而，毫無疑問的是發(fā)酵乳制品在仍占益生菌產(chǎn)品的主要部分，78％的益生菌制品是通過酸奶的形式被銷售。由于部分人群對乳糖不耐受，一些地區(qū)經(jīng)濟落后，發(fā)酵乳制品雖然營養(yǎng)價值高但是成本也較高，因此發(fā)展一種低成本而又綠色健康的產(chǎn)品具有極大的潛在價值。進行新鮮果蔬的乳酸發(fā)酵是一種低成本和可持續(xù)的過程，目的是保留原材料感官和營養(yǎng)特性以及在安全的條件下延長保質(zhì)期。植物乳桿菌是最常發(fā)現(xiàn)和用于發(fā)酵蔬菜和水果的乳酸菌物種之一，常存在于植物、乳制品、肉和小麥發(fā)酵產(chǎn)品以及人類和動物的胃腸道中。

選用植物乳桿菌進行果蔬汁發(fā)酵可以讓乳糖不耐癥患者同樣享用益生菌發(fā)酵制品的益處同時還可以增加軟飲料競爭力，促進飲料工業(yè)的發(fā)展。鑒于乳酸菌發(fā)酵是一種低成本可持續(xù)的過程，因此益生菌發(fā)酵果蔬汁飲料具有廣闊的發(fā)展前景以及巨大的經(jīng)濟效益。飲料行業(yè)中的傳統(tǒng)碳酸飲料已經(jīng)逐漸被大眾拋棄，發(fā)酵混合果蔬汁飲料制品開始得到人們青睞。據(jù)美國全球行業(yè)分析公司(Global Industry Analysts,Inc)的數(shù)據(jù)分析，歐美國家的果蔬汁消費占據(jù)全球消費總量最多，但是亞太地區(qū)在近幾年開始大幅增長，最為明顯的是日本?？梢怨罍y，益生菌發(fā)酵果蔬汁將在飲料行業(yè)日益興盛起來。最近，一些蔬菜和水果成功地被乳酸菌發(fā)酵。歐洲一些科研人員研究了雙歧桿菌及乳酸菌發(fā)酵胡蘿卜、芹菜、大蒜等果蔬的情況，但并沒有對產(chǎn)品作相關評價。

木瓜，屬于熱帶水果，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值。木瓜中維生素A和維生素C含量比西瓜和香蕉高，同時具有豐富的礦物質(zhì)以及有機酸，它所含有的齊墩果酸具有抗菌作用并有利于治療心腦血管疾病，而有機酸則可以促進人體消化吸收。除此之外，木瓜黃酮也有助于穩(wěn)定血管彈性。果膠類物質(zhì)則可以抗輻射。另外木瓜中的酶可促進產(chǎn)婦有產(chǎn)乳。而胡蘿卜是最常見的一種營養(yǎng)蔬菜，主要營養(yǎng)成分就是胡蘿卜素，含量高達9～13mg/100g，其中β胡蘿卜素的含量較高，另外還含有豐富的微量元素。除此之外，類胡蘿卜素、雙岐因子和核酸物質(zhì)等物質(zhì)具有抗氧化功效并可以抑制癌變，同時有助于腸道益生菌生長。目前國內(nèi)利用益生菌發(fā)酵木瓜的產(chǎn)品目前限于木瓜發(fā)酵乳制品，益生菌發(fā)酵木瓜飲料并沒有太多研究；同時，目前國內(nèi)益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁的研究也暫時不多。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有乳酸菌發(fā)酵木瓜和胡蘿卜飲料的研究不足，目的是提供一種發(fā)酵混合果蔬汁飲料及其制備方法。本發(fā)明一種發(fā)酵混合果蔬汁飲料具有良好的抗氧化活性的特點，制作過程簡單，制品的口感和風味符合“國家標準GB16321-2003乳酸菌飲料衛(wèi)生標準”中規(guī)定的要求。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：

一種發(fā)酵混合果蔬汁飲料的制備方法，以木瓜胡蘿卜混合果蔬汁為發(fā)酵原料，將乳桿菌DMDL9010接入上述原料中，進行發(fā)酵生產(chǎn)，制得具有抗氧化活性的滅菌型和活菌型兩款發(fā)酵果蔬汁飲料。具體發(fā)酵生產(chǎn)步驟如下：

(1)混合果蔬汁飲料的制備：將切塊后的木瓜和胡蘿卜按2～4:1的比例混合并破碎后，再加蔗糖后和水后得到混合果蔬汁飲料；

(2)混合果蔬汁飲料的加熱殺菌：90℃～96℃加熱7min～15min；

(3)將滅菌后的混合果蔬汁飲料冷卻后，再按體積百分比為6％～8％接入植物乳桿菌DMDL 9010活化液，在28℃～40℃發(fā)酵12h～22h后，即制得發(fā)酵混合果蔬汁飲料。

所述混合果蔬汁中木瓜和胡蘿卜的總含量為50％～70％，蔗糖的含量5％～15％，余量為水。

所述發(fā)酵混合果蔬汁飲料再經(jīng)過無菌灌裝、冷藏，制得活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料。

所述發(fā)酵混合果蔬汁飲料，經(jīng)過濾和滅菌后，再經(jīng)過無菌灌裝，制得滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料。

所述植物乳桿菌DMDL9010活化液：將植物乳桿菌DMDL 9010接種于MRS肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)1～2次傳代培養(yǎng)，pH值達到6.0±0.5，菌種達到正?；盍r貯藏于0～4℃。

所述活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的發(fā)酵最佳條件：發(fā)酵溫度34℃，接種量6％，發(fā)酵時間18h。

所述滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的發(fā)酵最佳條件：發(fā)酵溫度34℃，接種量7％，發(fā)酵時間16h。

所述活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料中活菌數(shù)達到10⁹cfu/mL以上。

本發(fā)明與現(xiàn)有的技術相比，具有如下的優(yōu)點：

(1)本發(fā)明首次利用植物乳桿菌對木瓜和胡蘿卜兩種果蔬汁復合進行發(fā)酵，發(fā)酵混合果蔬汁飲料屬于直接加工，成本低，工藝要求不高,市場潛力大，再者發(fā)酵混合果蔬汁飲料具有一定的調(diào)節(jié)人體腸道健康的功能打破了傳統(tǒng)的乳酸菌飲料加工模式，而將乳酸菌發(fā)酵與果蔬加工結(jié)合起來，屬于新型天然無添加飲料，口感適宜。

(2)DMDL 9010菌株具有很好的耐酸性，為益生菌提供了一個基礎條件。

(3)活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料在4℃條件下儲存28天后pH基本不變，乳酸含量先上升后趨于穩(wěn)定，最終保持在3.32g/L，活菌數(shù)則從初始3.5×10⁹cfu/mL減少到1.14×10⁹cfu/mL，但是仍大于10⁶cfu/m L；滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料于常溫儲存3個月后，pH基本不變，乳酸含量基本不變，保持在2.25g/L，各項指標均正常，其保質(zhì)期可達到3個月以上。兩款產(chǎn)品均符合GB16321-2003對乳酸菌飲料的規(guī)定。

所述乳桿菌(Lactobacillus sp.)DMDL 9010，已于2011年8月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC NO.5172，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。所述乳桿菌DMDL 9010已經(jīng)在公開號為104430851A的中國專利中公開，屬于現(xiàn)有技術。

附圖說明

圖1是發(fā)酵果蔬汁飲料的加工工藝流程圖。

圖2是發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量分別對發(fā)酵混合果蔬汁飲料中乳酸含量的影響。

圖3是實施例1活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料中D-、L-乳酸色譜圖。

圖4是實施例1冷藏條件下活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的pH值變化。

圖5是實施例1冷藏條件下活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的乳酸含量變化。

圖6是實施例1冷藏條件下活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的活菌數(shù)變化。

圖7是實施例4滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料中D-、L-乳酸色譜圖。

圖8是實施例4滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料在常溫條件下pH值變化。

圖9是實施例4滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料在常溫條件下乳酸含量變化。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但是本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于此。

實施例1

第一步混合果蔬汁飲料的制備：將切塊后的木瓜和胡蘿卜按3:1的比例混合并破碎后，再加入蔗糖和水后，得到混合果蔬汁飲料。所述混合果蔬汁飲料中木瓜和胡蘿卜的總含量為60％，蔗糖的含量為10％，余量為水。

第二步混合果蔬汁飲料的加熱殺菌：90℃加熱7min。

第三步將滅菌后的混合果蔬汁飲料冷卻后，再按體積百分比為6％接入植物乳桿菌DMDL 9010活化液，在34℃發(fā)酵18h后，經(jīng)過無菌灌裝、冷藏，即得活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料，其中乳酸含量為2.60g/L，pH為3.37，活菌數(shù)達到3.5×10⁹cfu/mL，遠遠大于GB 16321-2003《乳酸菌飲料衛(wèi)生標準》對活菌檢出≥10⁶cfu/mL的要求。

實施例1中的發(fā)酵工藝條件是通過單因素試驗優(yōu)化，當木瓜和胡蘿卜質(zhì)量比1:1的混合果蔬汁味道太重，而木瓜和胡蘿卜質(zhì)量比在2～4:1的混合果蔬汁飲料的口感適宜，而且有利于降低成本。木瓜和胡蘿卜的總含量在50％～70％的混合果蔬汁飲料色澤均一，為橙黃色，有較為濃郁的木瓜和胡蘿卜的香味，口感細膩，柔和爽口，組織狀態(tài)均一細膩，而蔗糖的含量在5％～15％的發(fā)酵混合果蔬汁飲料酸甜可口。因此，最佳發(fā)酵時間范圍為14h～22h，最佳發(fā)酵溫度范圍為32℃～36℃，最佳接種量范圍為6％～8％，采用三因素三水平的正交試驗(表1)，以產(chǎn)乳酸量和活菌數(shù)為指標，確定活菌型發(fā)酵木瓜和胡蘿卜混合果蔬汁飲料最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。發(fā)酵工藝結(jié)果見表2。

表1本例中三因素三水平正交試驗表

從表2的極差R可知，從乳酸含量看，C＞B＞A，發(fā)酵時間C對乳酸產(chǎn)生量影響最大，而接種溫度B影響最小。其中試驗3號產(chǎn)酸量最高可達3.0g/L乳酸量。根據(jù)pH的結(jié)果，C＞B＞A，發(fā)酵時間C對pH影響最大。就活菌數(shù)結(jié)果而言，B＞A＞C，即接種量B影響最大。其中試驗4號活菌量最高可達3.5×10⁹cfu/mL，由于此為活菌型飲料，因此結(jié)合活菌數(shù)最高和產(chǎn)酸量適中的原則可以確定活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的最佳發(fā)酵工藝為4號，即發(fā)酵溫度34℃、接種量6％、發(fā)酵時間18h。

表2本例中正交試驗結(jié)果

所述植物乳桿菌DMDL9010活化液：采用MRS肉湯培養(yǎng)基分裝于試管內(nèi)121℃，15min滅菌制成培養(yǎng)基，將植物乳桿菌DMDL 9010按1∶9接入培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)2次傳代培養(yǎng)，pH值達到6.0，菌種達到正?；盍r將制好的發(fā)酵劑貯藏于3℃。

(1)感官指標檢測：木瓜和胡蘿卜發(fā)酵混合果蔬汁飲料制成后，為使果蔬汁飲料口感最佳，先于4℃條件下冷藏24h～48h，再進行感官評價(參考GB/T31121-2004《果蔬汁類及其飲料》第5.2款“感官要求”)。采用評分檢驗法，檢驗由10名感官性能良好的評價員進行評價，檢驗分數(shù)由10名評價員各項分數(shù)取平均值求和得出。如下表3為該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的感官檢驗結(jié)果。由于活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料未經(jīng)滅菌處理，乳酸含量相比較高，其風味較滅菌型要濃郁，口感更清爽，由于是活菌型飲料，所以分層較滅菌型明顯，最終得分為96分，屬于較優(yōu)產(chǎn)品。

表3本例中感官指標檢測結(jié)果

(2)理化指標檢測

①滴定酸度的測定：根據(jù)酸堿中和原理，用已標定的0.1mol/mL NaOH標準溶液標定，按堿液的消耗量計算總酸度，參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》。該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的酸度為150°T。

②可溶性固形物含量：阿貝折光計測定，參照GB/T 12413-2003《飲料通用分析方法》。該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的可溶性固形物含量為10％。

(3)衛(wèi)生指標檢測：參照GB/T 16321-2003，乳酸菌計數(shù)(平板稀釋法)、大腸桿菌的測定(平板稀釋法)；菌落總數(shù)的測定(平板稀釋法)。該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料符合GB16321-2003，其中活菌數(shù)達到3.5×10⁹cfu/mL，遠遠大于GB 16321-2003《乳酸菌飲料衛(wèi)生標準》對活菌檢出≥10⁶cfu/mL的要求。

(4)產(chǎn)品分析

①有機酸含量分析：檸檬酸、蘋果酸和乳酸的含量，利用高效液相色譜法，參照GB/T16631-2008，有機酸柱是Phenomenex公司的ROA-Organic Acid，7.8mm ID×300mm L，流速為0.6mL/min，檢測波長為254.0nm，進樣量為5μL，流動相為0.002mmol/L稀硫酸溶液，柱溫為40℃。

乳酸中兩種手性異構體含量，參照文獻(劉冬梅，吳暉，余以剛，等.高效液相色譜法對泡菜中L-乳酸和D-乳酸的手性分離和測定[J].現(xiàn)代食品科技.2007(08):74-76.)的方法進行，使用美國Waters高效液相色譜儀，使用的手性分離柱子是Phenomenex公司的Chire×3126(D)-penicillamir，4.60mm ID×250mm L，流速為1mL/min，檢測波長為254.0nm，進樣量為5μL，流動相為0.2mmol/L硫酸銅溶液(溶劑為5％的異丙醇溶液)，柱溫為40℃。

流動相的配備：稱取CuSO₄·5H₂O 0.50g，加50mL雙蒸水溶解，轉(zhuǎn)移置1000mL的容量瓶中，加入50mL的色譜純異丙醇，再用雙蒸水定容至1000mL，用0.45μm孔徑的合成纖維素酯膜進行真空超濾，超聲波脫氣。

樣品預處理方法：培養(yǎng)完成后在121℃下滅菌20min，取1mL滅菌冷卻后的發(fā)酵液于1.5mL的離心管當中，經(jīng)8000r/min離心10min，除去菌體和其他雜質(zhì)。取離心后的上清液0.1mL于1.5mL的離心管中，之后再加入1.1mL的硫酸銅流動相稀釋12倍，震蕩混勻后再次以8000r/min離心10min。之后用帶有0.45μm濾頭的注射器吸取0.6mL的上清液于樣品管中，等待上樣。

采用高效液相色譜法測定兩款發(fā)酵混合果蔬汁飲料的有機酸含量，測定結(jié)果經(jīng)線性回歸，線性方程、線性范圍、相關系數(shù)和方法檢出限(以S/N＝3計)見表4。

表4 3種有機酸的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)及檢出限

該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料中含有2.83g/L檸檬酸、4.8g/L蘋果酸、2.60g/L乳酸。根據(jù)乳酸旋光性的不同可將其分為D-乳酸和L-乳酸，但是人體只含有分解L-乳酸的L-乳酸脫氫酶，而研究表明攝入較多D-乳酸可引起代謝紊亂甚至致病。因為世界衛(wèi)生組織限定成人了D-乳酸的日攝入量(≤100mg/kg體重)，嬰幼兒食品不得添加D-乳酸或DL-乳酸(金其榮.L-乳酸研究新進展[J].化工時刊.1997(07):31.)。因此，采取手性柱高效液相色譜法確定D-、L-乳酸的含量。該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料中D-乳酸含量為1.303g/L，L-乳酸含量為1.298g/L，比例大約1:1(如圖3)，而D-乳酸含量稍高于L-乳酸，因此根據(jù)WHO的規(guī)定，該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料正常成人一天不得飲用超過20瓶(100mL/瓶)，嬰幼兒不得飲用。

②抗氧化功能測定：參照徐貴華(徐貴華，張鳳梅，張磊.果蔬食品體外抗氧化方法研究進展[J].食品研究與開發(fā).2010(11):215-219.)具體抗氧化能力還進行如下修正：

清除DPPH自由基能力的測定：用2mL無水乙醇加入2mL蒸餾水調(diào)零，2mL的DPPH溶液加入2mL無水乙醇進行對照。樣品原液2mL加入2mL DPPH無水乙醇溶液(0.2mmol/L)，振蕩搖勻，在黑暗室溫下放置30min后，于517nm處測定吸光值(OD值)。以抑制率表達自由基清除能力，抑制率＝[(空白OD-樣品OD)/空白OD]×100％。

清除ABTS能力的測定：將5mL的7mmol/L ABTS和89μL 140mmol/L過硫酸鉀溶液混合，在室溫、避光條件下靜置過夜放置12h～16h，形成ABTS⁺儲備液。取30μL樣品，加入3mL稀釋后的ABTS⁺溶液，在室溫下反應6min，于734nm處測定吸光度值。以水溶性維生素E建立標準曲線，樣品抗氧化能力以TEAC表示，即每升果汁清除自由基能力相當于水溶性維生素E清除同等自由基能力的毫摩爾數(shù)。

螯合二價鐵離子能力的測定：樣品原液3mL加入50μL的FeCl₂溶液(2mmol/L)混勻，室溫條件下靜置30s加入100μL的菲咯嗪溶液(5mmol/L)混合均勻，在室溫下反應20min，于562nm波長測定吸光度值。

螯合Fe²⁺能力的計算公式：螯合Fe²⁺能力(％)＝[1-(A₂-A₁)/A₀]×100％式中：A₀為用水做空白對照的吸光度值，A₁為無菲咯嗪時樣品的吸光度值，A₂為樣品的吸光度。該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的DPPH自由基清除率為41.2％，清除ABTS能力表明每升果汁清除自由基的能力相當于1.027mmol/L水溶性維生素E清除同等自由基的能力，而螯合二價鐵離子的螯合率為18.2％。

③常溫條件下貨架期研究：對于活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料，從pH值、酸度以及活菌數(shù)變化研究植物乳桿菌DMDL9010發(fā)酵木瓜和胡蘿卜混合果蔬汁飲料在冷藏期間的貨架期。冷藏條件下活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的pH值變化如圖4所示。在經(jīng)過28天活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的pH值由3.38下降至3.20。在冷藏第1周，pH值下降較為明顯，而后3周的數(shù)值變化不大。主要是由于第1周內(nèi)植物乳桿菌活力更強，植物乳桿菌可利用的殘留蔗糖量較多因而可繼續(xù)產(chǎn)酸，造成pH有所下降，最終維持在3.20左右。圖5所示為該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的乳酸含量變化情況，經(jīng)過28天乳酸含量從2.60g/L上升到3.32g/L。在冷藏期間植物乳桿菌持續(xù)利用殘余糖進行發(fā)酵產(chǎn)酸。隨冷藏天數(shù)增加，乳酸含量先增加而后趨于平穩(wěn)，第1周內(nèi)增長明顯，而后3周趨于穩(wěn)定。主要是由于第1周內(nèi)植物乳桿菌活力更強，可利用的殘留蔗糖量較多，而后期殘留蔗糖量降低且菌體由于乳酸量增高而發(fā)酵停止，因此后續(xù)乳酸含量趨于穩(wěn)定直至最后達到3.32g/L。冷藏期間內(nèi)pH值和酸度的變化不大。如圖6為冷藏條件下活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的活菌數(shù)變化。經(jīng)過28d的冷藏，植物乳桿菌的活菌數(shù)有所下降從初始3.5×10⁹cfu/mL減少到1.14×10⁹cfu/mL，減少了3倍。冷藏期間前2周內(nèi)，活菌數(shù)下降明顯，從第3周開始基本不變。其最終活菌數(shù)仍能保持在1.14×10⁹cfu/mL。終產(chǎn)品的活菌數(shù)仍大于10⁶cfu/m L，符合GB16321-2003關于乳酸菌飲料的規(guī)定。

實施例2

第一步混合果蔬汁飲料的制備：將切塊后的木瓜和胡蘿卜按2:1的比例混合并破碎后，再加入蔗糖和水后，得到混合果蔬汁飲料。所述混合果蔬汁飲料中木瓜和胡蘿卜的總含量為50％，蔗糖的含量為5％，余量為水。

第二步混合果蔬汁飲料的加熱殺菌：93℃加熱11min。

第三步將滅菌后的混合果蔬汁飲料冷卻后，再按體積百分比為7％接入植物乳桿菌DMDL 9010活化液，在40℃發(fā)酵12h后，再經(jīng)過無菌灌裝、冷藏，即得活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料，其中乳酸含量為2.51g/L，pH為3.42，活菌數(shù)達到2.8×10⁹cfu/mL，遠遠大于GB 16321-2003《乳酸菌飲料衛(wèi)生標準》對活菌檢出≥10⁶cfu/mL的要求。

所述植物乳桿菌DMDL 9010活化液為：將植物乳桿菌DMDL 9010接入MRS肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)2次傳代培養(yǎng)，pH值達到5.8，菌種達到正常活力時貯藏于1℃。

(1)感官指標檢測

表5本例中感官指標檢測結(jié)果

(2)理化指標檢測

①滴定酸度的測定：143°T。

②可溶性固形物含量：9％。

(3)衛(wèi)生指標檢測：該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料符合GB16321-2003，其中活菌數(shù)達到2.8×10⁹cfu/mL，遠遠大于GB 16321-2003《乳酸菌飲料衛(wèi)生標準》對活菌檢出≥10⁶cfu/mL的要求。

(4)產(chǎn)品分析

①有機酸含量分析：該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料中含有2.74g/L檸檬酸、4.36g/L蘋果酸、2.51g/L乳酸。其中D-乳酸含量為1.255g/L，L-乳酸含量為1.246g/L，比例約為1:1。

②抗氧化功能測定：該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料DPPH自由基清除率為37.6％，清除ABTS能力表明每升果汁清除自由基的能力相當于1.034mmol/L的水溶性維生素E清除同等自由基的能力，而螯合二價鐵離子的螯合率為16.9％。

③常溫條件下貨架期研究：該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的貨架期達到28d以上。

實施例3

第一步混合果蔬汁飲料的制備：將切塊后的木瓜和胡蘿卜按4:1的比例混合并破碎后，再加入蔗糖和水后，得到混合果蔬汁飲料。所述混合果蔬汁飲料中木瓜和胡蘿卜的總含量為70％，蔗糖的含量為15％，余量為水。

第二步混合果蔬汁飲料的加熱殺菌：96℃加熱15min。

第三步將滅菌后的混合果蔬汁飲料冷卻后，再按體積百分比為8％接入植物乳桿菌DMDL 9010活化液，在28℃發(fā)酵22h后，經(jīng)過無菌灌裝、冷藏，即得活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料，其中乳酸含量為2.63g/L，pH為3.35，活菌數(shù)達到3.3×10⁹cfu/mL，遠遠大于GB 16321-2003《乳酸菌飲料衛(wèi)生標準》對活菌檢出≥10⁶cfu/mL的要求。

所述植物乳桿菌DMDL 9010活化液：將植物乳桿菌DMDL 9010接入MRS肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)2次傳代培養(yǎng)培養(yǎng)，pH值達到6.2，菌種達到正?；盍r貯藏于4℃。

(1)感官指標檢測

表6本例中感官指標檢測結(jié)果

(2)理化指標檢測

①滴定酸度的測定：152°T。

②可溶性固形物含量：12％。

(3)衛(wèi)生指標檢測：該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料符合GB16321-2003，其中活菌數(shù)達到3.3×10⁹cfu/mL，遠遠大于GB 16321-2003《乳酸菌飲料衛(wèi)生標準》對活菌檢出≥10⁶cfu/mL的要求。

(4)產(chǎn)品分析

①有機酸含量分析：該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料中含有2.87g/L檸檬酸、4.69g/L蘋果酸、2.63g/L乳酸。其中D-乳酸含量為1.317g/L，L-乳酸含量為1.314g/L，比例約為1:1。

②抗氧化功能測定：該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的DPPH自由基清除率為40.5％，清除ABTS能力表明每升果汁清除自由基的能力相當于1.018mmol/L的水溶性維生素E清除同等自由基的能力，而螯合二價鐵離子的螯合率為17.6％。

③常溫條件下貨架期研究：該活菌型發(fā)酵混合果蔬汁的貨架期達到28d以上。

實施例4

第一步混合果蔬汁飲料的制備：將切塊后的木瓜和胡蘿卜按3:1的比例混合并破碎后，再加入蔗糖和水后，得到混合果蔬汁飲料。所述混合果蔬汁飲料中木瓜和胡蘿卜的總含量為60％，蔗糖的含量為10％，余量為水。

第二步混合果蔬汁飲料的加熱殺菌：93℃加熱11min。

第三步將滅菌后的混合果蔬汁飲料冷卻后，再按體積百分比為7％接入植物乳桿菌DMDL 9010活化液，在34℃發(fā)酵16h后，將發(fā)酵后的混合果蔬汁飲料過濾和滅菌后，再經(jīng)過無菌灌裝，即得滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料，其中乳酸含量為2.25g/L，pH為3.41。

本例中滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的最佳發(fā)酵工藝是通過正交實驗優(yōu)化而得。采用三因素三水平的正交試驗(表7)以產(chǎn)酸量和pH為指標，確定滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。

表7本例中三因素三水平正交試驗表

從表8的極差R可知，從乳酸含量看，C＞A＞B，發(fā)酵時間C對乳酸產(chǎn)生量影響最大，而接種量B影響最小。根據(jù)pH的結(jié)果可知，C＞B＞A，與乳酸產(chǎn)相同，發(fā)酵時間C對pH影響最大，但是發(fā)酵時間C、接種量B、發(fā)酵溫度A三者對pH的影響差異并不顯著。此處滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料中影響乳酸含量及pH最大的因素與活菌型相同。根據(jù)各組產(chǎn)酸情況可知，選取的溫度范圍對于植物乳桿菌發(fā)酵混合果蔬汁飲料是較為合適的，其中產(chǎn)酸最高的是5號試驗，其在34℃條件下接種7％的植物乳桿菌DMDL 9010發(fā)酵16h后，產(chǎn)酸量達到2.25g/L，pH下降至3.41，口感舒適。因此可以確定滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的最佳發(fā)酵參數(shù)為34℃，接種量7％，發(fā)酵時間16h。

表8本實施例中正交試驗結(jié)果

所述植物乳桿菌DMDL9010的活化：采用MRS肉湯培養(yǎng)基分裝于試管內(nèi)121℃，15min滅菌制成培養(yǎng)基，將植物乳桿菌DMDL 9010按1∶9接入培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)1次傳代培養(yǎng)，pH值達到6.0，菌種達到正?；盍r將制好的發(fā)酵劑保存在0℃條件下備用。

(1)感官指標檢測：同實施例1。如下表9為該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的感官檢測結(jié)果。由于滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料經(jīng)受93℃，11min的滅菌過程，該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的最終得分為95分，屬于較優(yōu)產(chǎn)品。

表9本實施例中感官指標檢測結(jié)果

(2)理化指標檢測

①滴定酸度的測定：同實施例1。該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的酸度為130°T。

②可溶性固形物含量：同實施例1。該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的可溶性固形物含量為8％。

(3)衛(wèi)生指標檢測：同實施例1。

表10本實施例中衛(wèi)生指標

該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料符合GB16321-2003關于乳酸菌飲料的規(guī)定。

(4)產(chǎn)品分析

①有機酸含量分析：同實施例1。該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料中含有3.24g/L檸檬酸、4.4g/L蘋果酸、2.25g/L乳酸。其中D-乳酸含量為1.151g/L，L-乳酸含量為1.101g/L，比例約為1:1(如圖7所示)，而D-乳酸含量稍高于L-乳酸，因此根據(jù)WHO的規(guī)定，正常成人一天不得飲用超過20瓶(100mL/瓶)，嬰幼兒不得飲用。

②抗氧化功能測定：同實施例1。該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的DPPH自由基清除率為27.2％，清除ABTS能力表明每升果汁清除自由基的能力相當于1.035mmol/L的水溶性維生素E清除同等自由基的能力，而螯合二價鐵離子的螯合率為14.9％

③常溫條件下貨架期研究：該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料常溫條件下pH和乳酸含量變化分別如圖8和9所示。在觀察3個月內(nèi)，pH基本不變并保持在初始值3.40左右，乳酸值有略微下降，保持在2.25g/L左右。故其保質(zhì)期可達到3個月以上，符合GB16321-2003關于乳酸菌飲料的規(guī)定。

實施例5

第一步混合果蔬汁飲料的制備：將切塊后的木瓜和胡蘿卜按2:1的比例混合并破碎后，再加入蔗糖和水后，得到混合果蔬汁飲料。所述混合果蔬汁飲料中木瓜和胡蘿卜的總含量為50％，蔗糖的含量為5％，余量為水。

第二步混合果蔬汁飲料的加熱殺菌：90℃加熱7min。

第三步將滅菌后的混合果蔬汁飲料冷卻后，再按體積百分比為6％接入植物乳桿菌DMDL 9010活化液，在28℃發(fā)酵22h后，經(jīng)過濾和滅菌后，再經(jīng)過無菌灌裝，即得滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料，其中乳酸含量為2.19g/L，pH為3.47。

所述植物乳桿菌DMDL9010活化液：將植物乳桿菌DMDL 9010接種于MRS肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)2次傳代培養(yǎng)，pH值達到5.8，菌種達到正常活力時貯藏于2℃。

(1)感官指標檢測

表11本實施例中感官指標檢測結(jié)果

(2)理化指標檢測

①滴定酸度的測定：128°T。

②可溶性固形物含量：9％。

(3)衛(wèi)生指標檢測：該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料符合GB16321-2003關于乳酸菌飲料的規(guī)定。

(4)產(chǎn)品分析

①有機酸含量分析：該滅菌型發(fā)酵果蔬汁飲料中含有3.06g/L檸檬酸、3.9g/L蘋果酸、2.18g/L乳酸。其中D-乳酸含量為1.102g/L，L-乳酸含量為1.090g/L，比例約為1:1。

②抗氧化功能測定：該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的DPPH自由基清除率為26.4％，清除ABTS能力表明每升果汁清除自由基的能力相當于1.017mmol/L水溶性維生素E清除同等自由基的能力，而螯合二價鐵離子的螯合率為13.8％

③常溫條件下貨架期研究：:該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料保質(zhì)期可達到3個月以上，符合GB16321-2003關于乳酸菌飲料的規(guī)定。

實施例6

第一步混合果蔬汁飲料的制備：將切塊后的木瓜和胡蘿卜按4:1的比例混合并破碎后，再加入蔗糖和水后，得到混合果蔬汁飲料。所述混合果蔬汁飲料中木瓜和胡蘿卜的總含量為70％，蔗糖的含量為15％，余量為水。

第二步混合果蔬汁飲料的加熱殺菌：96℃加熱15min。

第三步將滅菌后的混合果蔬汁飲料冷卻后，再按體積百分比為8％接入植物乳桿菌DMDL 9010活化液，在40℃發(fā)酵12h后，將發(fā)酵后的混合果蔬汁飲料經(jīng)過濾和滅菌后，再經(jīng)過無菌灌裝，即得滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料，其中乳酸含量為2.15g/L，pH為3.56。

所述植物乳桿菌DMDL9010活化液為：采用MRS肉湯培養(yǎng)基分裝于試管內(nèi)121℃，15min滅菌制成培養(yǎng)基，將植物乳桿菌DMDL 9010按1∶9接入培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)1次傳代培養(yǎng)，pH值達到6.2，菌種達到正?；盍r將制好的發(fā)酵劑保存在4℃條件下。

(1)感官指標檢測

表12本實施例的感官指標檢測結(jié)果

(2)理化指標檢測

①滴定酸度的測定：117°T。

②可溶性固形物含量：11％。

(3)衛(wèi)生指標檢測：該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料符合GB16321-2003關于乳酸菌飲料的規(guī)定。

(4)產(chǎn)品分析

①有機酸含量分析：該滅菌型發(fā)酵果蔬汁飲料中含有3.48g/L檸檬酸、4.16g/L蘋果酸、2.15g/L乳酸。其中D-乳酸含量為1.124g/L，L-乳酸含量為1.025g/L，比例約為1:1，而D-乳酸含量稍高于L-乳酸。

②抗氧化功能測定：該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的DPPH自由基清除率為26.9％，清除ABTS能力表明每升果汁清除自由基的能力相當于1.033mmol/L水溶性維生素E清除同等自由基的能力，而螯合二價鐵離子的螯合率為14.7％。

③常溫條件下貨架期研究：:該滅菌型發(fā)酵混合果蔬汁飲料的保質(zhì)期可達到3個月以上，符合GB16321-2003關于乳酸菌飲料的規(guī)定。