本發(fā)明一種大米活性肽在制備保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞抗氧化制劑或食品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大米蛋白具有優(yōu)良的營養(yǎng)價值，人體吸收利用率高，生物效價大，并且大米蛋白富含各類氨基酸，但是，大米蛋白本身溶解性差，嚴(yán)重影響了其利用。因此對大米進(jìn)行深加工，以進(jìn)一步提升其價值具有重要意義。而對大米蛋白進(jìn)行水解，提取其中的具有生物活性的肽段，可以有效實(shí)現(xiàn)對大米蛋白的深加工。大米活性肽是從大米中提取出的一種具有生物活性的肽。大米活性肽包括幾種具有不同功能的多種活性肽，有大米抗氧化活性肽、大米降血壓活性肽、大米免疫活性肽、阿片活性肽、類阿片拮抗肽、大米風(fēng)味肽等等。大米抗氧化活性肽能有效清除體內(nèi)過剩的活性氧，保護(hù)細(xì)胞和線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能，防止脂質(zhì)過氧化，在預(yù)防自由基誘發(fā)的心腦血管疾病方面有很大的開發(fā)潛力。大米活性肽對內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷有一定的保護(hù)作用，可有效清除一些自由基，減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是存在于骨髓、臍血和外周血的一種具有高增殖潛能的前體細(xì)胞，它具有增殖、遷移、分化成成熟內(nèi)皮細(xì)胞和聚集形成新生血管的作用。研究表明，內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量減少可能是心血管疾病的標(biāo)志物。內(nèi)皮祖細(xì)胞因氧化應(yīng)激引起的損傷是多種疾病的早期反應(yīng)，與高血壓、冠心病、糖尿病、脂代謝紊亂的發(fā)生密切相關(guān)，這些疾病的患者存在內(nèi)皮祖細(xì)胞功能受損。內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)的損傷和修復(fù)反應(yīng)是動脈粥樣硬化的始動因素和重要環(huán)節(jié)。已有研究發(fā)現(xiàn)，一些食源物質(zhì)、藥食同源物質(zhì)可用于治療內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷引起的疾病。蜂蜜可能通過促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動員，進(jìn)而參與新生血管的生成，可用于治療糖尿病創(chuàng)面。番茄紅素可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞周期來增加細(xì)胞活力。兒茶素可以增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞對H₂O₂的抵抗力，減少其凋亡。葛根素可顯著增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量，并改善外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的粘附能力、遷移能力、增殖能力和體外血管生成能力。

經(jīng)過調(diào)研，未見我國學(xué)者對大米活性肽具有保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷作用的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此關(guān)于大米活性肽抗氧化損傷的活性等研究領(lǐng)域尚處于空白階段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明建立過氧化氫氧化損傷模型，給藥后發(fā)現(xiàn)，大米活性肽(序列為KHNRGDEF<SEQ ID NO.1>)的在200μmol/L的濃度下對H₂O₂誘導(dǎo)的細(xì)胞活力改善效果最為明顯。因此，所述大米活性肽可以用于防止和/或緩解與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能紊亂相關(guān)的動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等由于內(nèi)源性或外源性活性物質(zhì)的積累而誘發(fā)的一系列疾病。即，本發(fā)明所述大米活性肽具有保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞抗氧化的作用，為保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞的相關(guān)疾病提供了新的食源性應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

大米活性肽(SEQ ID NO.1)對H₂O₂誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用

1.選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞，無EDTA胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，用計(jì)數(shù)板測定懸液中的細(xì)胞濃度，按照每孔5000個細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種200μL，每組設(shè)6個復(fù)孔，在37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后分為正常組、過氧化氫處理組、過氧化氫+大米活性肽保護(hù)組，將原有培養(yǎng)基吸出，所有組先加入160μL的培養(yǎng)基，正常組、過氧化氫處理組加入20μL的無血清培養(yǎng)基，過氧化氫+大米活性肽保護(hù)組分別加入相應(yīng)濃度等體積大米活性肽，使藥物終濃度分別為100、150、200μmol/L，于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱預(yù)保護(hù)4h后，過氧化氫處理組和過氧化氫+大米活性肽保護(hù)組每孔加入20μL H₂O₂，其終濃度為100μml/L，正常對照組加入20μL無血清培養(yǎng)基，于37℃5％CO₂培養(yǎng)箱孵育24h后，MTT法檢測細(xì)胞活力。見表1：

表1大米活性肽對H₂O₂損傷的內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響

與正常組比較，過氧化氫處理損傷組細(xì)胞活力顯著下降；而與過氧化氫處理組比較，大米活性肽的高劑量組(200μmol/L)對H₂O₂誘導(dǎo)的細(xì)胞活力有明顯改善。

2.選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞，無EDTA的胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，按每孔4×10⁴個接種于24孔板，每孔接種800μL，每組設(shè)3個復(fù)孔，4h后分為正常組、模型組和大米活性肽組，正常組和過氧化氫處理組加入100μL無血清培養(yǎng)基，三個給藥組分別加入相應(yīng)濃度等體積大米活性肽，使藥物終濃度分別為100、150、200μmol/L，于37℃孵育預(yù)保護(hù)4h后，除正常組加入100μL無血清培養(yǎng)基外，模型組和大米活性肽組每孔加入100μL H₂O₂，其終濃度為100μmol/L，正常對照組加入100μL無血清培養(yǎng)基，于37℃孵育4h后，按說明書要求取細(xì)胞上清液測定LDH和MDA的釋放量；裂解細(xì)胞，測定胞內(nèi)SOD活力。根據(jù)公式計(jì)算得到各組細(xì)胞的生化指標(biāo)，見表2：

表2大米活性肽對H₂O₂誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷氧化指標(biāo)的影響

與正常組比較，過氧化氫處理組SOD活性明顯下降，LDH和MDA水平明顯升高；而與模型組比較，大米活性肽中、高劑量組LDH釋放量顯著下降；而在MDA水平上，大米活性肽給藥組均能使之降低；SOD活性中，大米活性肽高劑量組均能使之顯著升高，表明大米活性肽在細(xì)胞氧化指標(biāo)上具有保護(hù)細(xì)胞抗氧化損傷的作用。

3.通過流式細(xì)胞儀測定不同處理組內(nèi)皮祖細(xì)胞的細(xì)胞周期情況，發(fā)現(xiàn)大米活性肽可以通過顯著增加細(xì)胞的S期來增加細(xì)胞活力。

本發(fā)明是結(jié)合最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能領(lǐng)會在公開的實(shí)施例中作許多改變也可獲得相同或類似的結(jié)果，而不超出本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍。更具體地說，顯然有些化學(xué)和生理性的相關(guān)試劑可替代本文所公開的試劑而得到相同或類似的結(jié)果。所有類似的取代和修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然都認(rèn)為是本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思及權(quán)利要求范圍內(nèi)的，即所有上述這些等價形式和所有對工藝參數(shù)的改進(jìn)和變動都同樣屬于本發(fā)明的權(quán)利要求書所限定的范圍。