本發(fā)明屬于食品保健領(lǐng)域，涉及一種果蔬酵素的制備方法及應(yīng)用，具體涉及一種姜黃果蔬酵素的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

果蔬是人們?nèi)粘Ｉ攀车闹匾M成部分，無(wú)論是鮮食還是加工品在日常生活中都占有重要的地位。果蔬作為植物性原料，富含多種功能活性成分，包括膳食纖維、酚類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素、植物固醇等。多酚是植物體內(nèi)的一種次生代謝產(chǎn)物，現(xiàn)代研究表明具有抗氧化、抗癌、抗輻射、降血壓、預(yù)防心腦血管疾病等多種功能活性。多酚類(lèi)成分一般存在于細(xì)胞液泡中或與纖維類(lèi)成分緊密結(jié)合構(gòu)成細(xì)胞壁。因此，要高效的把多酚從果蔬細(xì)胞中釋放出來(lái)難度較大，傳統(tǒng)的物理破壁、溶劑提取方法效率低下、成本高昂。此外，大部分多酚類(lèi)物質(zhì)的天然存在形式都是多聚體，分子量大、難以解聚。對(duì)于大分子多酚類(lèi)物質(zhì)，由于人體缺乏相應(yīng)的消化酶系，不能將之降解消化，只能通過(guò)腸道中的微生物來(lái)降解處理(氧化、還原、水解等反應(yīng))，從而產(chǎn)生對(duì)機(jī)體有益的代謝產(chǎn)物。然而，膳食食物在腸道中停留的時(shí)間一般在24-48小時(shí)內(nèi)，意味著腸道中微生物對(duì)多酚類(lèi)成分的降解作用時(shí)間是非常有限，產(chǎn)生的有益代謝產(chǎn)物少，未能充分利用多酚類(lèi)成分的全部益處。因此，將果蔬在體外進(jìn)行微生物發(fā)酵是提高果蔬中多酚類(lèi)成分的生物學(xué)價(jià)值的重要方法之一。

肝臟是人體中重要的器官，能夠防御、分解外來(lái)和代謝產(chǎn)生的毒素，對(duì)維持機(jī)體平衡和健康起著至關(guān)重要的作用?；瘜W(xué)性肝損傷是通過(guò)由多種因素造成的，如受污染的空氣、水、食物以及日常生活中藥物、酒精等。近年來(lái)，脂肪肝、酒精肝炎、非酒精性肝炎已成為一種常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重威脅人們的身體健康。流行病學(xué)調(diào)查表明：肝臟損傷人數(shù)在中國(guó)已高達(dá)1.3億，每年將近50萬(wàn)人死于肝損傷病癥。其中脂肪肝及酒精肝是國(guó)內(nèi)外僅次于病毒性肝炎的第二大常見(jiàn)肝損傷疾病。因此，開(kāi)發(fā)一種能長(zhǎng)期服用、安全性高、對(duì)化學(xué)性肝損傷有預(yù)防和保健作用的產(chǎn)品具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有護(hù)肝作用的姜黃果蔬酵素的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述制備方法制得的姜黃果蔬酵素。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述姜黃果蔬酵素的用途。

本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種具有護(hù)肝作用的姜黃果蔬酵素的制備方法，包括如下步驟：

(1)將果蔬清洗、晾干，然后粉碎成20～40目，得混合果蔬液；

(2)向步驟(1)制得的混合果蔬液中加入混合果蔬液重量百分比1～8％的糖，接種混合果蔬液重量百分比0.01～0.05％的酵母菌，密封發(fā)酵，當(dāng)pH<4.3時(shí)，得一次果蔬發(fā)酵液；

(3)向步驟(2)制得的一次果蔬發(fā)酵液中按一次果蔬發(fā)酵液體積以100～1000CFU/ml接種復(fù)合乳酸菌進(jìn)行二次發(fā)酵，所述復(fù)合乳酸菌包括植物乳桿菌、干酪乳桿菌和醋酸桿菌；密封發(fā)酵，當(dāng)pH<3.8時(shí)，向果蔬發(fā)酵液中加入發(fā)酵液重量百分比1.0～3.0％的姜黃提取物，繼續(xù)發(fā)酵10天，得二次發(fā)酵液；

(4)將步驟(3)制得的二次發(fā)酵液過(guò)濾或離心，對(duì)濾液或離心上清液進(jìn)行均質(zhì)、滅菌后，制得姜黃果蔬酵素制品。

優(yōu)選的，如上所述的姜黃果蔬酵素制備方法中，在步驟(1)中，所述果蔬包括火龍果、木瓜、桑椹、楊桃、葡萄、蘋(píng)果、李子、梅子、山竹、桃、梨、草莓、柑橘、西瓜、洋蔥、花椰菜和甘藍(lán)中的多種。果蔬的選擇可根據(jù)蔬菜豐收季節(jié)。

優(yōu)選的，在步驟(2)中加入的糖是蔗糖、葡萄糖和果葡糖漿中的一種或幾種。

優(yōu)選的，在步驟(2)中所述發(fā)酵溫度為15～45℃，發(fā)酵時(shí)間為10～30天。

優(yōu)選的，在步驟(3)中加入的姜黃提取物是來(lái)自姜黃，規(guī)格從姜黃素質(zhì)量含量10％到20％。

優(yōu)選的，在步驟(3)中所述復(fù)合乳酸菌的制備方法是植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸桿菌等數(shù)量比例混合。

優(yōu)選的，在步驟(3)中，所述發(fā)酵的條件為20～40℃，密閉發(fā)酵30～90天。

本發(fā)明還提供了上述方法制得的姜黃果蔬酵素在制備保護(hù)化學(xué)性肝損傷保健食品、功能食品或特殊醫(yī)學(xué)用途食品中的應(yīng)用。

通過(guò)常規(guī)制劑工藝和輔料、食品添加劑，上述姜黃果蔬酵素可以制成保健食品、功能食品和特殊醫(yī)學(xué)用途食品中的多種劑型/形態(tài)：軟膠囊劑、硬膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑、口服液、飲料、果凍、糖果或軟糖。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

本發(fā)明姜黃果蔬酵素的制備方法簡(jiǎn)單，制得的姜黃果蔬酵素能長(zhǎng)期服用、安全性高、對(duì)化學(xué)性肝損傷有預(yù)防和保健作用。

姜黃素與果蔬發(fā)酵產(chǎn)物如蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸的螯合，可提升姜黃素的水溶性和生物利用率，增強(qiáng)姜黃素的生物活性。

本發(fā)明制得的姜黃果蔬酵素能通過(guò)常規(guī)制劑工藝和輔料、食品添加劑，可以制成保健食品、功能食品和特殊醫(yī)學(xué)用途中食品的多種劑型/形態(tài)(如軟膠囊劑、硬膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑、口服液、飲料、果凍、糖果、軟糖等)，服用方便。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

在未作說(shuō)明的情況下，本發(fā)明涉及的原料與方法均為本領(lǐng)域的常規(guī)原料和方法。實(shí)施例中使用的酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)購(gòu)自安琪酵母，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)購(gòu)自上海交大昂立生物，干酪乳桿菌(lactobacillus casei)購(gòu)自上海交大昂立生物，醋酸桿菌(Acetobacteraceti)購(gòu)自廣東省微生物研究所。

實(shí)施例1

(1)果蔬的清洗、破碎

將火龍果、木瓜、楊桃、梅子、草莓、柑橘、洋蔥、花椰菜、以及甘藍(lán)洗凈、去皮、晾干，用剪切式粉碎機(jī)破碎至20目，得混合果蔬液。

(2)一次發(fā)酵

加入混合果蔬液重量百分比2％的蔗糖和0.02％的酵母菌，混合攪拌均勻后，室溫25～30℃，密封發(fā)酵20天，每天攪拌發(fā)酵液1小時(shí)，取發(fā)酵液測(cè)得pH為4.2，得一次果蔬發(fā)酵液。

(3)二次發(fā)酵

向一次果蔬發(fā)酵液中按發(fā)酵液體積以1000CFU/ml接入復(fù)合乳酸菌進(jìn)行第二發(fā)酵，復(fù)合乳酸菌由植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸桿菌等數(shù)量比例混合配制。室溫25～35℃，密封發(fā)酵60天，每天攪拌發(fā)酵液1小時(shí)，取發(fā)酵液測(cè)得pH為3.7。加入發(fā)酵液重量百分比1.0％的姜黃提取物(姜黃素質(zhì)量含量20％)，繼續(xù)發(fā)酵10天，得二次發(fā)酵液。

(4)姜黃果蔬酵素獲得

將二次發(fā)酵液用離心機(jī)分離，以1000g離心力離心10分鐘，取上清液均質(zhì)、500ml玻璃瓶罐裝滅菌后，制得姜黃果蔬酵素制品。

實(shí)施例2

(1)果蔬的清洗、破碎

將火龍果、木瓜、桑椹、楊桃、葡萄、蘋(píng)果、李子、山竹、桃、梨、草莓、柑橘、西瓜、洋蔥、花椰菜、甘藍(lán)洗凈、去皮和核、晾干，用剪切式粉碎機(jī)破碎至30目，得混合果蔬液。

(2)一次發(fā)酵

加入混合果蔬液重量百分比8％的葡萄糖和0.05％的酵母菌，混合攪拌均勻后，室溫25～35℃，密封發(fā)酵15天，取發(fā)酵液測(cè)得pH為4.2，得一次果蔬發(fā)酵液。

(3)二次發(fā)酵

向一次果蔬發(fā)酵液中按發(fā)酵液體積以100CFU/ml接入復(fù)合乳酸菌進(jìn)行第二發(fā)酵，復(fù)合乳酸菌由植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸桿菌等數(shù)量比例混合配制。保溫在25～37℃，密封發(fā)酵60天，每天攪拌一小時(shí)，取發(fā)酵液測(cè)得pH為3.5。隨后，加入發(fā)酵液重量百分比2.0％的姜黃提取物(姜黃素質(zhì)量含量15％)，繼續(xù)發(fā)酵10天，得二次發(fā)酵液。

(4)姜黃果蔬酵素獲得

將二次發(fā)酵液用離心機(jī)分離，以1000g離心力離心10分鐘，取上清液過(guò)均質(zhì)機(jī)、500ml玻璃瓶罐裝滅菌后，制得姜黃果蔬酵素制品。

實(shí)施例3

(1)果蔬的清洗、破碎

將葡萄、蘋(píng)果、李子、山竹、桃、梨、草莓、柑橘、西瓜、洋蔥、甘藍(lán)洗凈、晾干，用剪切式粉碎機(jī)破碎至20目，得混合果蔬液。

(2)一次發(fā)酵

加入混合果蔬液重量百分比8％的果葡糖漿和0.04％的酵母菌，混合攪拌均勻后，室溫20～35℃，密封發(fā)酵15天，每天攪拌發(fā)酵液1小時(shí)，取發(fā)酵液測(cè)得pH為4.2，得一次果蔬發(fā)酵液。

(3)二次發(fā)酵

向一次果蔬發(fā)酵液中按發(fā)酵液體積以600CFU/ml接入復(fù)合乳酸菌進(jìn)行第二發(fā)酵，復(fù)合乳酸菌由植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸桿菌等數(shù)量比例混合配制。保溫25～35℃，密封發(fā)酵80天，每天攪拌發(fā)酵液1小時(shí)，取發(fā)酵液測(cè)得pH為3.3。隨后加入發(fā)酵液重量百分比3.0％的姜黃提取物(姜黃素質(zhì)量含量20％)，繼續(xù)發(fā)酵10天，得二次發(fā)酵液。

(4)姜黃果蔬酵素制得

將二次發(fā)酵液用離心機(jī)分離，以1000g離心力離心10分鐘，取上清液均質(zhì)、500ml玻璃瓶罐裝滅菌后，制得姜黃果蔬酵素制品。

實(shí)施例4

(1)果蔬的清洗、破碎

將葡萄、蘋(píng)果、李子、山竹、桃、梨、草莓、柑橘、西瓜、洋蔥、甘藍(lán)洗凈、去皮和核后，晾干，用剪切式粉碎機(jī)破碎至40目，得混合果蔬液。

(2)一次發(fā)酵

加入混合果蔬液重量百分比5％的果葡糖漿和0.02％的酵母菌，混合攪拌均勻后，室溫20～35℃，密封發(fā)酵10天，每天攪拌發(fā)酵液1小時(shí)，取發(fā)酵液測(cè)得pH為4.2，得一次果蔬發(fā)酵液。

(3)二次發(fā)酵

向一次果蔬發(fā)酵液中按發(fā)酵液體積以1000CFU/ml接入復(fù)合乳酸菌進(jìn)行第二發(fā)酵，復(fù)合乳酸菌由植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸桿菌等數(shù)量比例混合配制。室溫25～35℃，密封發(fā)酵50天，每天攪拌發(fā)酵液1小時(shí)，取發(fā)酵液測(cè)得pH為3.5。隨后，加入發(fā)酵液重量百分比1.5％的姜黃提取物(姜黃素質(zhì)量含量10％)，繼續(xù)發(fā)酵10天，得二次發(fā)酵液。

(4)姜黃果蔬酵素獲得

將二次發(fā)酵液用100目板框過(guò)濾機(jī)過(guò)濾，取濾液均質(zhì)、500ml玻璃瓶罐裝滅菌后，制得姜黃果蔬酵素制品。

實(shí)施例5

(1)果蔬的清洗、破碎

將梅子、火龍果、木瓜、楊桃、洋蔥、花椰菜、甘藍(lán)洗凈、晾干，用剪切式粉碎機(jī)破碎至20目，得混合果蔬液。

(2)一次發(fā)酵

加入混合果蔬液重量百分比3％的蔗糖和2％的葡萄糖，接種混合果蔬液重量百分比0.04％的酵母菌，混合攪拌均勻后，室溫25～40℃，密封發(fā)酵15天，每天攪拌發(fā)酵液1小時(shí)，取發(fā)酵液測(cè)得pH為4.1，得一次果蔬發(fā)酵液。

(3)二次發(fā)酵

向一次果蔬發(fā)酵液中按發(fā)酵液體積以600CFU/ml接入復(fù)合乳酸菌進(jìn)行第二發(fā)酵，復(fù)合乳酸菌由植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸桿菌等數(shù)量比例混合配制。室溫25～35℃，密封發(fā)酵60天，每天攪拌發(fā)酵液1小時(shí)，60天后取發(fā)酵液測(cè)得pH為3.4。隨后，再加入發(fā)酵液重量百分比2.0％的姜黃提取物(姜黃素質(zhì)量含量20％)，繼續(xù)發(fā)酵10天，得二次發(fā)酵液。

(4)姜黃果蔬酵素獲得

將二次發(fā)酵液用100目板框過(guò)濾機(jī)過(guò)濾，取濾液均質(zhì)、500ml玻璃瓶罐裝滅菌后，制得姜黃果蔬酵素制品。

姜黃果蔬酵素的護(hù)肝效果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)方法：參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中化學(xué)性肝損傷的方法。分組及操作：將80只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，分正常組、模型組、姜黃素組、S1、S2、S3、S4、S5組，其中S1-5分別代表實(shí)施例1-5。除正常組和模型組外，其余組用50％的食用酒精12ml/kg·day灌胃連續(xù)4周，姜黃素組灌胃姜黃素50mg/kg·day。S1-S5組灌胃各實(shí)施例配方姜黃果蔬酵素液6ml/kg·day。每天1次共4周，正常組和模型灌胃同體積蒸餾水。最后1d灌胃給酒精后，禁食不禁水12h，各組動(dòng)物稱重，眼球取血，靜置1h后，分離血清，用于檢測(cè)ALT、AST。動(dòng)物脫頸椎處死后，取肝臟組織約1g制備成10％肝臟勻漿用于檢測(cè)MDA、GSH、SOD。用試劑盒檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

結(jié)果處理：采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料結(jié)果均以x±s表示，多組間均數(shù)比較首先采用方差齊性檢驗(yàn)后用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果：對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶的影響，如表1和表2所示。

由表1中數(shù)據(jù)可知，模型組小鼠血清中ALT、AST水平明顯升高，與正常組比較有顯著性差異(P<0.05)，提示造模成功。與模型組相比，姜黃素組有降低ALT、AST的趨勢(shì)，而S1-S5五個(gè)組別均能顯著降低小鼠血清中ALT、AST的水平，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明S1、S2、S3、S4、S5具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用。

表1對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的影響x±s

^ΔΔp<0.01,*P<0.05,^**p<0.01

由表2可知，與模型組相比，姜黃素組具有降低肝組織中MDA的含量及升高組織SOD和GSH的趨勢(shì)，而S1-S5組能明顯的降低組織中MDA的含量及升高組織SOD和GSH的水平(P<0.05-0.01)，由此提示各實(shí)施例樣品對(duì)肝臟的氧化損傷有保護(hù)作用。

表2對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝組織中SOD、MDA和GSH活性的影響(x±s)

^ΔΔp<0.01,*P<0.05,^**p<0.01

綜上所述，姜黃果蔬酵素對(duì)化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用，且比姜黃素的護(hù)肝作用效果好。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。