本發(fā)明涉及毛皮動物微生態(tài)制劑技術領域，具體涉及一種毛皮動物復合微生態(tài)制劑的制備方法。
背景技術：
養(yǎng)殖場(戶)在養(yǎng)殖毛皮動物過程中長期在飼料中添加抗生素，再加上不注重養(yǎng)殖環(huán)境的控制，造成污染嚴重，不能使毛皮動物完全抵御病菌、病毒的侵染，使毛皮動物長期處于亞健康狀態(tài)。大量實驗研究表明，復合微生態(tài)制劑具有動態(tài)調節(jié)動物胃腸道菌群生態(tài)系統(tǒng)的作用。具有促進動物生長發(fā)育、提高飼料轉化率、提高畜禽產品質量、增強動物免疫力、提高抗病菌和抗病毒的能力。
目前現有技術中對毛皮動物復合微生態(tài)制劑的研究比較鮮見，如能研究一種復合微生態(tài)制劑，并將它用于養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖場長期使用復合微生態(tài)制劑將進一步提高毛皮動物的免疫力，提高產品品質，取代抗生素防病、治病，減少獸藥殘留，無疑將增強我國毛皮動物的國際市場競爭力，增加農民收入水平。
技術實現要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種毛皮動物復合微生態(tài)制劑的制備方法，在原料的選取上，選用多種菌和纖維素酶復配而成，該復合微生態(tài)制劑在治療細菌性、病毒性疾病的同時還能提高毛皮動物機體免疫力。
其技術解決方案包括：
一種毛皮動物復合微生態(tài)制劑的制備方法，依次包括以下步驟：
a活化保存斜面菌種，用LB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶，在pH為7-7.5、100-130℃高壓滅菌一段時間、在一定的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)一段時間；
b對步驟a培養(yǎng)得到的酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶分別進行一級液體擴大培養(yǎng)；
c對步驟b一級液體擴大培養(yǎng)后的酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶接著分別進行二級液體擴大培養(yǎng)；
d將二級液體擴大培養(yǎng)后得到的酵母菌液、乳酸菌液、白腐菌液、枯草芽孢桿菌液、雙歧桿菌液、霉菌液和纖維素酶液按照重量比2:2:2:1:1:1:2混合，即得復合微生態(tài)制劑。
作為本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，步驟a中，高壓滅菌時間為20-40分鐘，培養(yǎng)溫度為30-38℃，培養(yǎng)時間為12-20小時。
作為本發(fā)明的另一個優(yōu)選方案，步驟b和步驟c中的接種量均為10％-20％。
本發(fā)明所帶來的有益技術效果：
在原料的選取上，本發(fā)明選取酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶為原料，并將這幾種原料二級擴大培養(yǎng)后得到的菌液按照一定配比2:2:2:1:1:1:2混合制備得到復合微生態(tài)制劑，所得復合微生態(tài)制劑可以起到治養(yǎng)同步的目的，在治療細菌性、病毒性疾病的同時提高毛皮動物機體免疫力；可在一定范圍內代替抗生素和化學抗病藥物，達到真正的綠色生態(tài)養(yǎng)殖。
下面結合試驗數據說明本發(fā)明復合微生態(tài)制劑的安全性與治病防病效果。
本發(fā)明復合微生態(tài)制劑在青島農業(yè)大學實驗室經大鼠急性毒性試驗，實驗組為50只大鼠，按0.6ml/10g體重飼喂21天；空白對照組為50只大鼠，按照常規(guī)飼養(yǎng)。
結果表明實驗組大鼠全部存活,活動自如,毛發(fā)光滑,飲食正常,呼吸道、眼及口腔等處無分泌物外，未發(fā)現任何中毒癥狀，體重均有增加。與空白對照組比較，實驗組的大鼠體重明顯增加(P＜0.001)。21天觀察期結束，將大鼠脫臼處死解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦、腸、小腸等臟器均未見明顯異常表現。另外，大鼠胸腺系數和脾臟系數結果表明，實驗組與空白對照組比較，實驗組大鼠脾臟系數明顯增加(P＜0.01)，提示本發(fā)明的復合微生態(tài)制劑具有免疫增強作用，屬實際無毒類物質，安全度大。
具體實施方式
本發(fā)明提出了一種毛皮動物復合微生態(tài)制劑的制備方法，為了使本發(fā)明的優(yōu)點、技術方案更加清楚、明確，下面結合具體實施例對本發(fā)明做詳細說明。
首先，本發(fā)明中LB培養(yǎng)基的配方如下:
胰蛋白胨(Tryptone)10g/L
酵母提取物(Yeast extract)5g/L
氯化鈉(NaCl)10g/L。
實施例1：
復合微生態(tài)制劑的制備方法包括如下步驟：
(1)活化保存的各斜面菌種，分別搖瓶培養(yǎng)，酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶用LB培養(yǎng)基，pH7-7.5，100-130℃高壓滅菌20分鐘，在38℃培養(yǎng)12小時；
(2)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶的一級液體擴大培養(yǎng)(50L罐)，接種量10％-20％；
(3)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶的二級液體擴大培養(yǎng)(500L罐),接種量10％-20％；
(4)將酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶發(fā)酵液按以下配比混合：酵母菌20份、乳酸菌20份、白腐菌20份、枯草芽孢桿菌10份、雙歧桿菌10份、霉菌10份和纖維素酶20份。無菌裝罐，包裝得到復合微生態(tài)制劑。
實施例2：
復合微生態(tài)制劑的制備方法包括如下步驟：
(1)活化保存的各斜面菌種，分別搖瓶培養(yǎng)，酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶用LB培養(yǎng)基，pH7-7.5，100-130℃高壓滅菌40分鐘，在30℃培養(yǎng)15小時；
(2)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶的一級液體擴大培養(yǎng)(50L罐)，接種量10％-20％；
(3)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶的二級液體擴大培養(yǎng)(500L罐),接種量10％-20％；
(4)將酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶發(fā)酵液按以下配比混合：酵母菌30份、乳酸菌30份、白腐菌30份、枯草芽孢桿菌15份、雙歧桿菌15份、霉菌15份和纖維素酶30份。無菌裝罐，包裝得到復合微生態(tài)制劑。
實施例3：
復合微生態(tài)制劑的制備方法包括以下步驟：
(1)活化保存的各斜面菌種，分別搖瓶培養(yǎng)，酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶用LB培養(yǎng)基，pH7-7.5，100-130℃高壓滅菌30分鐘，在35℃培養(yǎng)16小時；
(2)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶的一級液體擴大培養(yǎng)(50L罐)，接種量10％-20％；
(3)酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶的二級液體擴大培養(yǎng)(500L罐),接種量10％-20％；
(4)將酵母菌、乳酸菌、白腐菌、枯草芽孢桿菌、雙歧桿菌、霉菌和纖維素酶發(fā)酵液按以下配比混合：酵母菌40份、乳酸菌40份、白腐菌40份、枯草芽孢桿菌20份、雙歧桿菌20份、霉菌20份和纖維素酶40份。無菌裝罐，包裝得到復合微生態(tài)制劑。
對比例1：
與實施例1不同之處在于：原料的選取上不同，以下分為五組，
A組：生理鹽水；
B組：酵母菌液、乳酸菌液、芽孢桿菌液；
C組：酵母菌液、乳酸菌液、芽孢桿菌液、白腐菌液；
D組：酵母菌液、乳酸菌液、芽孢桿菌液、白腐菌液、霉菌液；
E組：酵母菌液、乳酸菌液、芽孢桿菌液、白腐菌液、雙歧桿菌液、霉菌液
為了進一步驗證上述實施例1-3和對比例1制備得到的復合微生態(tài)制劑對毛皮動物的作用效果，下面結合具體實驗及實驗結果來說明。
毛皮動物以水貂為例，復合微生態(tài)制劑對水貂體重、免疫力和腸道健康的影響，以下對水貂進行分組對照。
試驗水貂，為大連黑，由青島某農業(yè)科技有限公司毛皮動物養(yǎng)殖基地提供。選取150日齡仔貂60只，按性別和體重隨機分成6組，每組5個重復，每重復2只，公母各半，試驗從2016年4月20日起，5月24日結束，共計35天。每組小水貂分籠喂養(yǎng)，自由采食和飲水。由青島某大學動物微生物與免疫實驗室分離保存的乳酸菌和芽孢桿菌的活菌株。
菌落計數(平板計數法)
在超凈臺內用經過高壓的量筒取25mL菌液置于盛有250mL生理鹽水的廣口瓶內，充分搖勻成比例為1:10的稀釋液。用容積為1.0mL的經過高壓的吸管吸取1.0mL置于盛有9mL的生理鹽水內，進行十倍稀釋，重復上述操作直至菌液稀釋倍數為109。用吸管吸取1.0mL的菌液置于經過高壓、烘烤后的平皿內，同時將冷卻至46℃左右的營養(yǎng)瓊脂倒入平皿內，同時移動平皿使溶液充分混合。將平板置于恒溫箱內培養(yǎng)24h計數，重復做三次。
免疫注射
將試驗動物隨機分成A、B、C、D、E、F六組，每組5個重復。對水貂進行免疫，第一次每只水貂注射等體積混合的抗原與弗氏完全佐劑0.1mL。一個星期后每只水貂注射等體積混合的抗原與弗氏不完全佐劑佐劑0.1mL，間隔一周后每只水貂重復注射等體積混合的抗原與弗氏不完全佐劑佐劑0.1mL。
對水貂灌胃處理，見表1。
表1為對試驗水貂的不同處理方式
不同試驗組對水貂體重的影響，見表2。
表2試驗期水貂的體重增長情況(單位：g)
備注：同一行中出現小寫字母相同上標的表示差異不顯著(P＞0.05)，具有不同小寫字母的表示差異性顯著(P＜0.05)。
結果分析：從表2中可以看出試驗前水貂的體重大題一致。試驗期間，對照組和試驗組的水貂體重都有大幅增長，試驗組水貂的體重普遍比對照組增長的快。對試驗前后水貂的體重增長情況進行分析，得出試驗組水貂在試驗前后的平均日增重比對照組增長的快，尤其是公貂，平均日增重達到了22.44g。
不同試驗組對水貂內臟指數的影響，見表3。
表3不同處理組小水貂的內臟指數(n＝5)
數據分析：用spss軟件對水貂的內臟器官進行統(tǒng)計分析，采用多重比較的方法。由表3得出，F組(實施例1)的水貂各內臟指數與對照組相比極顯著(P＜0.01)且顯著高于其他實驗組(P＜0.05)，芽孢桿菌、乳酸菌、中藥組單獨作用組各內臟器官的重量也顯著高于對照組(P＜0.05)，F組顯著高于對照組及益生菌和中藥組(P＜0.05)。
血清免疫瓊擴結果，表4為血清法氏囊病毒抗體效價。
表4血清法氏囊病毒抗體效價
由表4計算得出：每個試驗組血清效價較對照組分別升高了29％，24％，11％，17％，14％；30％，26％，15％，8％，12％。可以得出復合微生態(tài)制劑組水貂血清法氏囊抗體含量與其它試驗組相比有比較明顯的促進作用。
ELISA試驗結果分析見表5。
表5為不同處理組小水貂的OD值
由表5可以得出第一次測得的OD值除了E組之外其它試驗組均比較接近，即在第一次免疫后水貂體內的抗體含量差異不明顯；第二次由試驗測得的OD值仍然比較接近，即水貂體內的抗體含量相差不大；第三次免疫后復合微生態(tài)制劑組OD數值明顯高于其它試驗組，說明其體內抗體含量與其它試驗組相比數值升高的更大。
不同試驗組對水貂空腸的粘膜厚度、絨毛長度的影響
在光鏡下觀察得出，芽孢桿菌組、中藥組、復合微生態(tài)制劑組和對照組水貂空腸粘膜結構均比較完整，并且層次分明，腸絨毛完整整齊。可見有明顯的支部，小腸粘膜上皮表面的紋狀緣結構整齊均勻。與對照組相比，復合微生態(tài)制劑組小水貂空腸粘膜絨毛排列更加緊密，絨毛比較長。
本次試驗結果表明，無論給水貂灌胃芽孢桿菌組、乳酸菌組、中藥組，還是復合微生態(tài)制劑組均能促進水貂的增長，但是復合微生態(tài)制劑組的水貂體重在兩周后與其它試驗組相比遠大于其它試驗組。
不同試驗組對水貂內臟指數的影響：
由試驗可以得出復合微生態(tài)制劑組在促進小水貂內臟器官的生長方面與對照組相比差異極顯著(p<0.01)。灌胃乳酸菌組、芽孢桿菌組和中藥組對臟器指數的影響與對照組相比差異顯著(p<0.05)。表明復合微生態(tài)制劑組對水貂的內臟指數方面效果更顯著。
不同試驗組對法氏囊抗體效價的影響：
本試驗結果顯示不同試驗組的水貂抗體效價與對照組相比差異顯著，但是復合微生態(tài)制劑組水貂的血清效價較對照組在第一次和第二次分別升高了29％和30％，與其它試驗組相比數值變化較大。表明復合微生態(tài)制劑組在增強抗體的效價方面效果更顯著。
綜上所述，本發(fā)明制備得到的復合微生態(tài)制劑對水貂的生長增重，內臟器官的生長，雞法氏囊抗體效價的升高以及腸道微絨毛的長度及腸壁厚度均有比較明顯的促進作用，大幅度提高了水貂的性能。
需要說明的是，在本說明書的教導下本領域技術人員所做出的任何等同方式，或明顯變型方式均應在本發(fā)明的保護范圍內。