本發(fā)明屬于飼料防霉保鮮技術，具體涉及一種枯草芽孢桿菌代謝產物的制備方法及其應用。
背景技術：
飼料產業(yè)發(fā)展應朝“綠色無公害”和“新型高端”飼料發(fā)展，實現(xiàn)“量”與“質”同步提升，加快產業(yè)轉型。飼料在存放過程中容易發(fā)生霉變，輕則影響產品外觀，如表面裂紋、白斑；結塊或容易解崩、產生酸敗或不良氣味影響誘食和捕食；嚴重將導致霉菌毒素的產生。防止飼料霉變通常通過控制水分和添加防霉添加劑。目前使用最廣泛的添加劑是丙酸及其鹽類(包括丙酸鈉、丙酸鈣、丙酸銨和二丙酸銨)。在實際生產中，對高檔的飼料，尤其是高值水產飼料如鰻魚、鮑魚飼料等，控制較低的水分不利于喂養(yǎng)時飼料的復水，影響飼料的柔軟性，從而不利于魚類捕食。另一方面，在高水分卻不改變飼料pH值，不影響飼料水質和飼料品質的前提下，丙酸及其鹽類防霉劑難以在貨架期內保持無霉變發(fā)生。因此需要尋找具有抗菌力、安全性、適口性、適用性和經濟性兼具的防霉添加劑。生物抑菌劑以其安全性高、能耗低的優(yōu)勢成為開發(fā)新熱點。目前常用的微生物源抑菌劑主要有乳酸菌素和納它霉素。納它霉素是針對真菌的防霉保鮮劑，但其不溶于水和有機溶液。本專利采用一株具有顯著抑制飼料霉菌活性的枯草芽孢桿菌（保藏號：BSh0851）；并對其發(fā)酵活性代謝物質進行了結構鑒定，表明其為脂肽類表面活性物質；并經過液體發(fā)酵條件優(yōu)化后，活性物質產量可達450 mg /L，具有很好的發(fā)酵優(yōu)勢。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌代謝產物的制備方法及其在魚飼料防霉中的應用，為飼料，特別是含水量稍高的魚飼料防霉保鮮提供新的途徑。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
一種枯草芽孢桿菌代謝產物的制備方法，包括如下具體步驟：
（1）種子液制備：從營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上挑取一接種環(huán)已活化的枯草芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基中，37℃，200r·min-1，培養(yǎng)24h；種子培養(yǎng)基的配方為牛肉膏3g、氯化鈉5g、蛋白胨10g、蒸餾水1000mL，pH7.0；
（2）發(fā)酵液培養(yǎng)基制備：酵母浸膏15g，無水葡萄糖15g，MgSO4 1g，蒸餾水1000mL，pH7.0；分裝，裝液量為三份之一體積；滅菌備用；
（3）枯草芽孢桿菌無菌體發(fā)酵液的制備：在步驟（2）制得的發(fā)酵液中接入步驟（1）制得的種子液，接種量為5%vol；于37℃、轉速100r·min-1條件下培養(yǎng)24h；
（4）將步驟（3）的發(fā)酵液6000r·min-1 離心10min，去除菌體后，上清液進行冷凍干燥，得到含枯草芽孢桿菌表面活性肽的凍干粉。其活性物質含量為50mg/g。
其中，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtulis）BSh0851，保藏日期為2009年12月13日，保藏單位是中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No.3502。該枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為革蘭氏陽性菌，芽孢橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，常形成皺醭；需氧菌，可利用蛋白質、多種糖及淀粉，V-P陽性。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述枯草芽孢桿菌表面活性肽凍干粉末在魚飼料防霉中的應用，其具體步驟為：
（1）將冷凍干燥所得枯草芽孢桿菌表面活性肽以1g/L的添加量添加入魚油中；
（2）以每50L魚油覆膜1噸魚飼料產品，且飼料含水率在10%左右；
（3）對所生產的飼料定期進行外觀和菌落生長檢測。
此枯草芽孢桿菌活性肽冷凍干燥濃縮物可有效抑制飼料中的真菌生長，包括魚飼料中常見的多種酵母菌、黑曲霉、米曲霉、根霉、青霉和白地霉。采用0.05%的冷凍干燥濃縮粉對酵母菌、黑曲霉、米曲霉、根霉、青霉和白地霉進行平板抑菌實驗，結果表明，7d后，抑菌圈直徑分別為無生長（完全抑制）、0.3cm、0.45cm、0.6cm、0.8cm和1.4cm。
將冷凍干燥粉末以1g/L的添加量添加入魚油中。在飼料加工最后一道淋油工序中，使用該魚油。使用本發(fā)明的保鮮劑對飼料進行防霉處理，正常放置6個月，肉眼未可見霉變。
本發(fā)明的有益效果如下：
首先，應用該枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產表面活性肽其發(fā)酵產量高、提取工藝簡單。其次，該枯草芽孢桿菌代謝的活性肽對多種霉菌具有生長抑制作用，對魚飼料霉變起到很好的預防效果；該工藝不需要調整飼料配方，操作便捷、可操作性強，且活性肽使用量少、節(jié)約成本。
具體實施方式：
本發(fā)明以飼料外觀為評判指標，以飼料含菌量作為輔助指標用于評判本保鮮劑對飼料防霉的效果。
將剛擠壓膨化制成的飼料和反接根霉和曲霉的飼料，采用不同濃度梯度的活性肽魚油覆膜，并采用空白魚油做1組對照。
枯草芽孢桿菌代謝產物的制備，包括如下具體步驟：
（1）種子液制備：從營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上挑取一接種環(huán)已活化的枯草芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基中，37℃，200r·min-1，培養(yǎng)24h；種子培養(yǎng)基的配方為牛肉膏3g、氯化鈉5g、蛋白胨10g、蒸餾水1000mL，pH7.0；
（2）發(fā)酵液培養(yǎng)基制備：酵母浸膏15g，無水葡萄糖15g，MgSO4 1g，蒸餾水1000mL，pH7.0；分裝，裝液量為三份之一體積；滅菌備用；
（3）枯草芽孢桿菌無菌體發(fā)酵液的制備：在步驟（2）制得的發(fā)酵液中接入步驟（1）制得的種子液，接種量為5%vol；于37℃、轉速100r·min-1條件下培養(yǎng)24h；
（4）將步驟（3）的發(fā)酵液6000r·min-1 離心10min，去除菌體后，上清液進行冷凍干燥，得到含枯草芽孢桿菌表面活性肽的凍干粉。其活性物質含量為50mg/g。
實施例 1：對比實施例
將剛擠壓膨化制成的飼料用空白魚油噴淋，制成飼料成品，作為對照組。
實施例2
將冷凍干燥所得枯草芽孢桿菌表面活性肽以0.5g/L的添加量添加入魚油中。在飼料加工最后一道淋油工序中，使用該魚油噴淋。
實施例 3
將冷凍干燥所得枯草芽孢桿菌表面活性肽以1g/L的添加量添加入魚油中。在飼料加工最后一道淋油工序中，使用該魚油噴淋。
實施例4
將冷凍干燥所得枯草芽孢桿菌表面活性肽以2g/L的添加量添加入魚油中。在飼料加工最后一道淋油工序中，使用該魚油。
飼料評判標準為：具有光澤，飼料表面看不到菌絲生長，不見白斑或起絲（無霉變，記為“-”）；無光澤，飼料表面出現(xiàn)輕微斑點或菌絲，但內部沒有斑點或菌絲（輕度霉變，記為“+”）；出現(xiàn)輕微白斑或菌絲，但內部未見菌絲（一般霉變，記為“++”）、出現(xiàn)明顯白斑或裂紋，內部可見菌絲（完全霉變，記為“+++”）。
采用馬鈴薯培養(yǎng)基（添加氯霉素抑制枯草芽孢桿菌生長）進行真菌培養(yǎng)，將直徑0.8cm的飼料顆粒置于培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)，判斷飼料表面菌在培養(yǎng)基中的生長情況，并以菌落在飼料邊緣長度（cm）作為染菌程度。
實施案例外觀結果見表1，菌落生長情況見表2。
表1 飼料外觀評價表
表2 飼料表面霉菌生長情況表
對高水分（含水量10%）飼料而言，由表1飼料外觀評價可以看出，采用枯草桿菌活性肽含量為1g/L的魚油覆膜，可在60d內保持無霉變狀態(tài)，而對照組20d出現(xiàn)輕微霉變。表2表示飼料攜帶菌量的程度和被抑菌活性物質抑制生長的水平，枯草桿菌活性肽含量為1g/L的魚油覆膜后，盡管仍在初期便攜帶菌，但被抑制的程度優(yōu)于對照和低濃度實施案例。
實施例5
枯草芽孢桿菌的分離和鑒定
（1）該菌株分離自蜜蜂體內。從蜂箱中隨機取意大利蜜蜂工蜂成蟲30只，放在無菌的離心管中。在無菌操作下，加入70%的酒精浸泡5 s，取出蟲體置于0.1%升汞液中消毒2 min，移至滅菌水中換洗3次，然后把蟲體置于無菌的離心管中，加入5 mL的無菌水，震蕩，取50μL涂布于培養(yǎng)基上，檢查體表滅菌是否完全。消毒后的蜂體放在消毒的蠟盤中于超凈工作臺上解剖。取出其腸道在無菌的研缽中加入1 mL無菌水研磨，將研磨液用無菌水稀釋成10-1-10-6，各稀釋度取50 μL用平板涂布法進行分離，各稀釋度重復3次，在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，標記表征不同的菌落以便純化培養(yǎng)，并按可數性原則對每個平板上不同的菌落進行計數。挑取表征不同的單菌落細菌劃線純化、獲得純培養(yǎng)、斜面保種。選取菌落生長稀疏、適當稀釋度計算菌落數，求出3個重復的平均值。計算出每克(毫升)腸道中的細菌數。每克（mL）腸道中的細菌數(菌落形成單位)=平板上菌落數×稀釋倍數／平板上加菌液的量（mL）。
（2）蜜蜂腸道細菌的鑒定
參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠；蔡妙英，2001）和《伯杰氏細菌鑒定手冊》（1984）第八版實驗方法，進行革蘭氏染色，鞭毛染色，芽孢染色，葡萄糖氧化發(fā)酵，接觸酶，吲哚，V-P，M.R，明膠液化，產H2S，苯丙氨酸，脫氨酶，檸檬酸鹽、丙二酸鹽、蔗糖、乳糖和甘露糖利用，硝酸鹽還原等實驗進行各科的分屬，并對各屬鑒定特征進行描述。
鑒定得到分離純化的目的菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。革蘭氏陽性菌，芽孢橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，常形成皺醭；需氧菌，可利用蛋白質、多種糖及淀粉，V-P陽性。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。