本發(fā)明涉及復(fù)合芽孢桿菌-海洋活性寡糖合生元研制方法及其在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
刺參是中國(guó)20多種可食用海參中品質(zhì)最好的一種，位列海產(chǎn)八珍之首，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近十多年來(lái)，刺參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，2013年全國(guó)刺參產(chǎn)量超過(guò)13×104噸，產(chǎn)值突破300億元，在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)單種產(chǎn)值和利潤(rùn)中最高，其發(fā)展速度和綜合經(jīng)濟(jì)效益都是其他經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)品種所無(wú)法比擬的。隨著刺參產(chǎn)業(yè)向高密度集約化方式轉(zhuǎn)變，刺參養(yǎng)殖的健康和病害問(wèn)題日益凸顯，腐皮綜合征等疾病頻發(fā)，導(dǎo)致生產(chǎn)性能降低，嚴(yán)重制約了刺參產(chǎn)業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展。雖然使用抗生素和化學(xué)藥物防治水生動(dòng)物疾病具有一定的效果，但是會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)抗藥性、藥物殘留及破壞動(dòng)物與環(huán)境中正常菌群平衡等諸多弊端。隨著現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)逐步向綠色、環(huán)保和無(wú)公害方向發(fā)展，益生菌和益生元等天然綠色飼料添加劑因具有利于腸道及水體微生態(tài)群系平衡、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)及增強(qiáng)免疫應(yīng)答，可為宿主帶來(lái)諸多益處，且綠色安全、無(wú)污染，逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于高效科學(xué)配伍益生菌及益生元，從而顯著提高刺參的生長(zhǎng)性能及非特異性免疫應(yīng)答，以保證刺參產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)性發(fā)展。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種海洋合生元添加劑，該添加劑包含源自海洋、具有生物活性的海洋寡糖類益生元——?dú)す烟?，以及能利用殼寡糖作為能源物質(zhì)生長(zhǎng)的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacillus lincheniformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。所述三種芽孢桿菌與上述寡糖類益生元科學(xué)配伍，制備出的海洋合生元添加劑為可用于刺參養(yǎng)殖促進(jìn)其生長(zhǎng)及增強(qiáng)免疫力的復(fù)合型合生元添加劑；
上述海洋合生元添加劑的組成包括：
解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、海洋寡糖類益生元、菌體保護(hù)劑、礦物質(zhì)載體；
所述海洋益生元?dú)す烟堑木酆隙葹?～10；
所述殼寡糖分子量<2000；
所述菌體保護(hù)劑為脫脂奶粉、甘油、蔗糖或明膠；優(yōu)選脫脂奶粉；
所述礦物質(zhì)載體為沸石粉。
優(yōu)選方式下，所述海洋合生元添加劑各組分的配比為：
濃度分別大于等于1×1010CFU/mL的解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌液中加入占所述菌液質(zhì)量5～8％的海洋寡糖類益生元?dú)す烟?、占所述菌液質(zhì)量5～10％的菌體保護(hù)劑后得到的溶液與所述礦物質(zhì)載體按體積質(zhì)量比1:0.25ml/g混合，凍干。
進(jìn)一步優(yōu)化，解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌液濃度等于1×1010CFU/mL，加入的海洋寡糖類益生元占所述菌液質(zhì)量5％、菌體保護(hù)劑占所述菌液質(zhì)量的10％。
本發(fā)明所述三種芽孢桿菌均對(duì)刺參沒(méi)有安全性風(fēng)險(xiǎn)，無(wú)致病性，可作為刺參的益生菌使用。
本發(fā)明還提供了上述海洋合生元添加劑的制備方法，具體步驟如下：
S1、取解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌菌液，加入海洋寡糖類益生元、菌體保護(hù)劑，得到混合液；
所述海洋寡糖類益生元為聚合度為2～10的殼寡糖；
所述殼寡糖分子量<2000；
所述菌體保護(hù)劑為脫脂奶粉、甘油、蔗糖或明膠；優(yōu)選脫脂奶粉。
優(yōu)選方式下，所述三種芽孢桿菌菌液濃度分別大于等于1×1010CFU/mL；優(yōu)選等于1×1010CFU/mL；
加入的所述海洋寡糖類益生元的量占所述三種芽孢桿菌菌菌液質(zhì)量的5～8％；優(yōu)選5％；
加入的所述菌體保護(hù)劑的量占所述三種芽孢桿菌菌液質(zhì)量的5～10％；優(yōu)選10％。
所述三種芽孢桿菌菌液的制備方法優(yōu)選為：
將上述三種芽孢桿菌分別進(jìn)行發(fā)酵富集，培養(yǎng)溫度為25～30℃，pH 6.8～7.8，培養(yǎng)48～72h，得到芽孢桿菌發(fā)酵液；分別調(diào)整芽孢桿菌發(fā)酵液濃度之后將三種芽孢桿菌發(fā)酵液混合制成混合菌液；
所述三種芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基為改進(jìn)后的2216E海洋培養(yǎng)基，具體成分質(zhì)量體積比為：
蛋白胨:殼寡糖:酵母膏:沙濾海水＝0.3:0.1:0.1:100(g:g:g:g:ml)。
此步驟可采用平板計(jì)數(shù)法調(diào)整發(fā)酵后的三種芽孢桿菌發(fā)酵液濃度。
S2、將步驟S1制得的混合液與礦物質(zhì)載體混合；
所述礦物質(zhì)載體為沸石粉；
所述混合液與礦物質(zhì)載體混合的體積質(zhì)量比優(yōu)選為1:0.25mL/g。
S3、將步驟S2制得的混合物真空冷凍干燥24h～48h，制成凍干粉，即為海洋合生元添加劑。
經(jīng)實(shí)際測(cè)算，本發(fā)明制得的海洋合生元添加劑產(chǎn)品中三種芽孢桿菌的總含量>1010CFU/g。
本發(fā)明還提供了上述海洋合生元添加劑在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用，具體步驟為：將所述海洋合生元添加劑與海參基礎(chǔ)飼料按比例混合；
所述海洋合生元添加劑為所述基礎(chǔ)飼料質(zhì)量的2～5％。
本發(fā)明的有益效果是：
1、本發(fā)明高效科學(xué)配伍益生菌及益生元，使二者協(xié)同作用，發(fā)揮“1+1>2”的效果，利用本發(fā)明所述合生元添加劑可同時(shí)發(fā)揮芽孢桿菌和海洋寡糖類益生元的雙重益生作用，選擇性促進(jìn)外源性益生菌與內(nèi)源性腸道有益微生物在動(dòng)物腸道內(nèi)定植及增殖，集益生菌的速效性和慢效應(yīng)物質(zhì)益生元的生長(zhǎng)保護(hù)作用于一體，發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，激活宿主免疫系統(tǒng)，并直接或間接抑制有害微生物的繁殖，從而顯著提高刺參的生長(zhǎng)性能及非特異性免疫應(yīng)答，更好地促進(jìn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)。
2、本發(fā)明能改善刺參腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)刺參生長(zhǎng)性能，提高刺參養(yǎng)殖品質(zhì)與效益，可用作水產(chǎn)養(yǎng)殖功能性綠色飼料添加劑。
綜上所述，本發(fā)明依據(jù)腸道微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)學(xué)原理，在研究與把握現(xiàn)有水產(chǎn)添加劑基礎(chǔ)上，結(jié)合最新一代高通量測(cè)序與微生態(tài)菌群分析技術(shù)，科學(xué)篩選配伍特定益生菌和新型海洋寡糖類益生元，提供一種具有促進(jìn)刺參生長(zhǎng)及激活免疫系統(tǒng)的高效合生元制劑，使其充分發(fā)揮合生元各組分的益生作用，達(dá)到增強(qiáng)高密度集約化養(yǎng)殖模式下刺參的生長(zhǎng)性能及抵御疾病的能力的目的，促進(jìn)刺參養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。
具體實(shí)施方式
下面將說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式：
實(shí)施例1
一、制備海洋合生元添加劑
步驟1：在改進(jìn)后的2216E海洋培養(yǎng)基中分別發(fā)酵培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，培養(yǎng)溫度為30℃，pH 7.0，培養(yǎng)時(shí)間為48h，得到解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，分別調(diào)節(jié)三種芽孢桿菌發(fā)酵液至1×1010CFU/mL，將三種芽孢桿菌菌液混合得到混合菌液；
所述三種芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基為改進(jìn)后的2216E海洋培養(yǎng)基，具體成分質(zhì)量體積比為：
蛋白胨:殼寡糖:酵母膏:沙濾海水＝0.3:0.1:0.1:100(g:g:g:ml)；
步驟2：將上述三種芽孢桿菌混合菌液與海洋寡糖類益生元及脫脂奶粉混合，使海洋寡糖類益生元質(zhì)量濃度為5％，脫脂奶粉保護(hù)劑質(zhì)量濃度為10％；
上述海洋寡糖類益生元為聚合度為2～10的殼寡糖；
所述殼寡糖分子量<2000。
步驟3：將步驟2溶液與礦物質(zhì)載體沸石粉混合，體積質(zhì)量比為1:0.25ml/g；
步驟4：將步驟3制得的混合物真空冷凍干燥24h，制成凍干粉，即為海洋合生元添加劑。
二，試驗(yàn)用刺參飼料的制備
步驟1：刺參基礎(chǔ)飼料的選擇，此處提供一種飼料配方(具體配方應(yīng)視情況選擇)：稱量海帶粉2kg，鼠尾藻粉2kg，豆粕粉1kg，魚(yú)粉1kg，海泥3kg，貝殼粉0.75kg，復(fù)合維生素和礦物質(zhì)0.25kg；
其中，所述復(fù)合維生素和礦物質(zhì)與現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)飼料所需添加成份和數(shù)量的要求相同。在此提供一種優(yōu)選方式，所述復(fù)合維生素和礦物質(zhì)成分為(mg/g)：維生素B10.5,維生素B21.0,煙酸0.75,維生素B61.5,維生素B120.05,泛酸鈣10,維生素C 50,氯化膽堿200,維生素K2,維生素A0.6，維生素E10，α纖維素723.6；MgSO4-7H2O 100,ZnSO4-7H2O 3,CoCl2-6H2O 1,MnSO4-H2O1,Al Cl3-6H2O 0.2,FeSO4-7H2O 30,CuCl2-2H2O 63，碳酸鈣801.8。
步驟2：飼料原料預(yù)處理，干燥至含水量不高于15％，粗粉碎至100～200目；
步驟3：每天投喂飼料之前，將本發(fā)明合生元制劑按照基礎(chǔ)飼料重量5％的添加量進(jìn)行充分拌料混合，其中海洋合生元添加劑中益生菌的含量>109CFU/g，在基礎(chǔ)飼料中有效含量>108CFU/g，然后對(duì)刺參進(jìn)行飼喂。
三，刺參的飼養(yǎng)與管理
選擇大小相似的健康刺參作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，平均體重10g左右?？疾焐鲜霭l(fā)明合生元制劑對(duì)對(duì)刺參生長(zhǎng)及免疫的促進(jìn)效果。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前進(jìn)行適應(yīng)性暫養(yǎng)，所有養(yǎng)殖箱24h曝氣，采用流水系統(tǒng)，避光，每天更換30％的養(yǎng)殖水體，每周吸低排污一次，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，溶氧≥6mg/l，水溫保持于16-18℃，pH 7.9-8.1，鹽度為30-32ppt。每天固定時(shí)間分別投喂基礎(chǔ)飼料及加入本發(fā)明合生元制劑的飼料，投喂量為刺參體質(zhì)量的5％，試驗(yàn)進(jìn)行60天。
四，刺參樣品采集與數(shù)據(jù)分析
1.生長(zhǎng)性能測(cè)定
存活率：N2/N1×100
日增重：(W2-W1)T-1
其中N2和N1分別為每個(gè)平行刺參終末頭數(shù)和初始頭數(shù)，W2和W1分別為每個(gè)平行刺參終末體重和初始體重，T為試驗(yàn)天數(shù)。
2.免疫指標(biāo)的測(cè)定
刺參體腔細(xì)胞吞噬率測(cè)定
經(jīng)結(jié)晶紫染色及甲醛滅活后濃度為109cfu mL-1的金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus Rosenbach)與一定體積的刺參體腔細(xì)胞懸液一起加入到一塊48孔板中，反復(fù)吸打，使細(xì)胞及菌液充分混合。調(diào)整細(xì)胞懸液體積及菌液體積使細(xì)胞密度：細(xì)菌密度＝1:50。18℃下避光反應(yīng)1h，每隔20min吸打一次。然后取40μL混合液輕輕滴于載玻片上，涂片，待干。加5％甲醛(溶于生理鹽水)，固定吸附在玻片上的吞噬細(xì)胞3min，用蒸餾水沖洗，置倒置顯微鏡下觀察。計(jì)數(shù)100個(gè)吞噬細(xì)胞，吞噬率的計(jì)算公式為：
細(xì)胞吞噬率(％)＝總共發(fā)生吞噬作用的吞噬細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)×100
免疫相關(guān)酶活的測(cè)定
超氧化物歧化酶、溶菌酶及一氧化氮合酶活均采用試劑盒(購(gòu)買自南京建成生物工程研究所)測(cè)定。
3.抗病力測(cè)定
在60d養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每個(gè)平行組隨機(jī)抽取10只刺參，每只刺參體腔注射100μL濃度為1×109cfu mL-1刺參致病菌—燦爛弧菌的菌懸液，連續(xù)注射3天，期間不進(jìn)行飼料投喂，觀察兩周后，統(tǒng)計(jì)刺參累計(jì)發(fā)病率(累積發(fā)病率＝發(fā)病刺參個(gè)數(shù)/刺參總數(shù))。
本發(fā)明合生元對(duì)刺參生長(zhǎng)性能及非特異免疫力的影響如表1及表2所示：
表1.飼喂本發(fā)明合生元對(duì)刺參生長(zhǎng)性能的影響(n＝30)
表2.飼喂本發(fā)明合生元對(duì)刺參免疫力及抗病力的影響
試驗(yàn)結(jié)果表明：在刺參基礎(chǔ)飼料中額外添加本發(fā)明合生元，可以顯著提高刺參特定生長(zhǎng)率等生長(zhǎng)性能，有效增強(qiáng)刺參體腔細(xì)胞吞噬率、超氧化物歧化酶、溶菌酶及一氧化氮合酶活性，并能夠顯著降低刺參在燦爛弧菌脅迫下的累計(jì)發(fā)病率。因此，在刺參基礎(chǔ)飼料中適量添加本發(fā)明合生元能夠顯著促進(jìn)刺參生長(zhǎng)性能與非特異免疫力及抗病力，可以作為刺參新型綠色飼料添加劑使用。
本發(fā)明采用合生元的模式制得飼料添加劑，合生元是益生菌與益生元科學(xué)配伍制成的生物制劑，其本質(zhì)不是兩種產(chǎn)品的簡(jiǎn)單疊加，而是一個(gè)質(zhì)的變化。通過(guò)高效配伍特定的益生菌和益生元，有針對(duì)性地促進(jìn)外源性益生菌在動(dòng)物腸道中定植和生長(zhǎng)，并選擇性刺激內(nèi)源有益菌群的增殖，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體對(duì)病原微生物的防御能力，改善動(dòng)物腸道微生態(tài)群系平衡，起到益生菌和益生元的雙重作用，達(dá)到“1+1>2”的效果，從而更好地促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和健康。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。