本發(fā)明屬于糖尿病研究領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)2型糖尿病靈長類動(dòng)物動(dòng)物模型的高糖高脂半流質(zhì)膳食及其誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
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隨著人類生活水平的提供，糖尿病的發(fā)病率也越來越高，糖尿病及其并發(fā)癥已經(jīng)成為威脅人類健康的一類重要疾病。因?yàn)樘悄虿〉陌l(fā)病率居高不下，所以降糖藥的研發(fā)一直是藥物研發(fā)中的熱點(diǎn)，而降糖藥物的研發(fā)離不開良好的動(dòng)物疾病模型。目前用于降糖藥研發(fā)的動(dòng)物疾病模型主要有轉(zhuǎn)基因疾病模型和發(fā)化學(xué)法誘導(dǎo)的高血糖動(dòng)物模型，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型如小鼠糖尿病模型(db/db、KK小鼠等)、大鼠糖尿病模型(GK、ZDF大鼠等)。化學(xué)藥物(四氧嘧啶、鏈脲佐菌素)誘導(dǎo)的高血糖模型包括單獨(dú)誘發(fā)和/或配合高脂飼料誘發(fā)的小鼠、大鼠、猴糖尿病模型。由于人類糖尿病的成因多數(shù)與飲食不節(jié)(與生活條件提高后高糖、高脂大量攝入有關(guān))有關(guān)，但上述模型多數(shù)為嚙齒類動(dòng)物疾病模型，雖然與人類的同源性較高，但其疾病形成原因以及基因組與人類還是存在較大差異，在生物技術(shù)藥物迅猛發(fā)展的今天，由于藥物的特異性(如生物藥有動(dòng)物種屬的選擇特異性)上述模型已經(jīng)不能滿足藥物研發(fā)的需求。嚙齒類疾病動(dòng)物模型的應(yīng)用領(lǐng)域正逐漸轉(zhuǎn)向降糖藥物的篩選方面。而化學(xué)藥物誘發(fā)的靈長類動(dòng)物糖尿病模型是成因也與人類糖尿病成因具有明顯的差別，如人類2型糖尿病患者多數(shù)伴有胰島素抵抗、高胰島素血癥等特點(diǎn)，而化學(xué)藥物誘發(fā)的靈長類動(dòng)物糖尿病模型無上述該特征，其成因?yàn)榛瘜W(xué)藥物損傷胰島細(xì)胞后導(dǎo)致的胰島素絕對不足。因此，建立與人類糖尿病發(fā)病相似的靈長類動(dòng)物模型對新型降糖藥物的研發(fā)具有非常重要的意義。
高糖高脂膳食，指的是通過人工的行為，將人類飲食結(jié)構(gòu)中最常見的糖類和脂肪按一定比例混合所得的混合物。
通過高糖高脂飼料誘發(fā)靈長類動(dòng)物糖尿病模型已有報(bào)道，但其制作方法為將高糖高脂加入到猴飼料中，猴通過攝入飼料而將高糖高脂成分?jǐn)z入體內(nèi)，日久成模。該法的不足之處為未充分考慮到靈長類動(dòng)物喜愛用飼料玩耍的生活習(xí)性，飼養(yǎng)過程中，多數(shù)的飼料被其玩耍丟棄而浪費(fèi)，不能準(zhǔn)確的計(jì)算每個(gè)動(dòng)物每天攝入高糖高脂的數(shù)量，無法量化。且由于飼料含熱量較高、油膩感強(qiáng)，且飼料本身的口感發(fā)生了較大的變化，動(dòng)物在攝入一定量的飼料后會(huì)有飽漲感，出于自我保護(hù)的作用，動(dòng)物會(huì)停止攝入更大量的高糖高脂飼料，導(dǎo)致高糖高脂的攝入量會(huì)相對減少，從而使得造模時(shí)間大大延長。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能量化、快速誘導(dǎo)出2型糖尿病靈長類動(dòng)物動(dòng)物模型的高糖高脂半流質(zhì)膳食。
本發(fā)明的誘導(dǎo)2型糖尿病靈長類動(dòng)物動(dòng)物模型的高糖高脂半流質(zhì)膳食，其特征在于，是通過以下方法制備的：按質(zhì)量比將蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽＝5～15:5～15:0.5～1.5:0.1～1.0進(jìn)行混合，加熱攪拌均勻乳化制備成半流質(zhì)狀膳食，即為誘導(dǎo)2型糖尿病靈長類動(dòng)物動(dòng)物模型的高糖高脂半流質(zhì)膳食。按照各成分的最大質(zhì)量比配制的高糖高脂其流動(dòng)性已達(dá)極限，即再增加各成分的質(zhì)量所配制的膳食將不具備流動(dòng)特性，難以通過灌胃器具送達(dá)動(dòng)物的胃部。按照低于各成分最小質(zhì)量比配制的高糖高脂膳食流動(dòng)性較好，長期將其灌胃給予靈長類動(dòng)物理論上可復(fù)制2型糖尿病靈長類動(dòng)物造模，但需要耗費(fèi)的時(shí)間也將會(huì)明顯延長。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種2型糖尿病靈長類動(dòng)物的誘導(dǎo)方法，其特征在于，將上述誘導(dǎo)2型糖尿病靈長類動(dòng)物模型的高糖高脂半流質(zhì)膳食灌入靈長類動(dòng)物胃部，誘導(dǎo)靈長類動(dòng)物產(chǎn)生2型糖尿病，而得到2型糖尿病模型靈長類動(dòng)物模型。
優(yōu)選，是將誘導(dǎo)2型糖尿病靈長類動(dòng)物模型的高糖高脂半流質(zhì)膳食按照9.2-17.2g/kg靈長類動(dòng)物的體重的量通過鼻飼管灌胃給予，每天一次，每周6天，連續(xù)給予25個(gè)月。
優(yōu)選，所述的靈長類動(dòng)物優(yōu)選為食蟹猴。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于篩選和評價(jià)抗2型糖尿病類藥物篩選和評價(jià)研究的方法，其特征在于，根據(jù)候選藥物的特點(diǎn)，按照一定的劑量和頻率給予上述2型糖尿病靈長類動(dòng)物模型，根據(jù)效果評價(jià)候選藥物是否具有抗2型糖尿病作用，從而為候選藥物提供篩選和/或評價(jià)研究結(jié)果。
本發(fā)明的誘導(dǎo)2型糖尿病靈長類動(dòng)物模型的高糖高脂半流質(zhì)膳食中使用的糖類和脂肪分別為人類日常生活中攝入量比較大的蔗糖、豬油、膽固醇和膽酸鹽，將上述四種物質(zhì)按一定的比例混合，制備成半流質(zhì)膳食，將其通過鼻飼管將其灌入靈長類動(dòng)物胃部，這樣就可以使得靈長類動(dòng)物按照體重、被動(dòng)地按照一定的時(shí)間和頻率精準(zhǔn)的攝入上述高糖高脂混合物，模擬人類因物質(zhì)生活條件提高而導(dǎo)致的飲食失節(jié)而產(chǎn)生的2型糖尿病。
本發(fā)明可以量化每個(gè)動(dòng)物每天攝入高糖高脂的數(shù)量，并且無口感變化造成動(dòng)物攝入量不足的擔(dān)憂，能定時(shí)定量的攝入高糖高脂，從而大大加快了2型糖尿病模型的發(fā)病進(jìn)程。本發(fā)明制作的2型糖尿病靈長類動(dòng)物模型具有嚙齒動(dòng)物、化學(xué)藥物誘發(fā)的猴糖尿病模型無法比擬的優(yōu)勢，可用于各種類型降糖類藥物(特別是生物技術(shù)類抗糖尿病藥物)的研發(fā)及評價(jià)。
具體實(shí)施方式：
以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1：
1.實(shí)驗(yàn)材料
1.1蔗糖：500g/瓶，分析純，西隴化工。
1.2豬油：15kg/桶，食品級，海南省鼎升食品有限公司。
1.3膽固醇：500g/瓶，分析純，上海博奧生物科技有限公司。
1.4膽酸鹽：500g/瓶，分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。
1.5葡萄糖：500g/瓶，分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。
1.6食蟹猴：3-7歲10只，8-20歲，26只雄性，普通級，從廣東藍(lán)島生物技術(shù)有限公司購入。
1.7胰島素ELISA測定試劑盒，猴血漿/血清專用，從大連泛邦試劑有限公司購入，96T，原裝進(jìn)口。
1.8胰高血糖素ELISA測定試劑盒，，猴血漿/血清專用，從大連泛邦試劑有限公司購入，96T，原裝進(jìn)口。
1.9血糖測定試劑：浙江伊利康生物技術(shù)有限公司。
1.10糖化血清白蛋白測定試劑：50T/48樣，南京建成生物工程研究所。
1.11胰島素：諾華公司產(chǎn)品。
2.主要儀器
2.1 7020生化分析儀：7020型，日本日立公司。
2.2糖化血紅蛋白測定儀：NycoCard Reader II型，挪威NycoCard公司
2.3血糖儀：強(qiáng)生公司產(chǎn)品。
2.4分光光度計(jì)：722N型，上海菁華科技儀器有限公司。
2.5恒速泵：SN-50C6型，深圳圣諾醫(yī)療設(shè)備有限公司。
2.6酶標(biāo)儀：ELX808型，美國伯騰儀器有限公司
3.實(shí)驗(yàn)方法
3.1半流質(zhì)高糖高脂膳食的制備：蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽按質(zhì)量百分比為下述比例混合：蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽＝5～15:5～15:0.5～1.5:0.1～1.0進(jìn)行混合，加熱至約70攝氏度，攪拌均勻乳化，即制備成半流質(zhì)狀膳食，即為本發(fā)明的誘導(dǎo)2型糖尿病靈長類動(dòng)物橫下的高糖高脂半流質(zhì)膳食。
3.2選取正常的8-20歲的雄性中老年食蟹猴26只，按體重隨機(jī)分為5組，分別為高糖高脂組、高糖低脂組、低糖高脂組、低糖低脂組，每組6-7只，另外選用10只年齡為3-7歲的成年雄性猴，5只為陰性對照組，5只為高糖高脂成年組。高糖高脂組膳食質(zhì)量比配方為：蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽＝10：10：1：0.5，將各組份按其含量混合均勻，加熱至約70攝氏度，攪拌均勻乳化即得，膳食給予量為17.2g/kg；高糖低脂組膳食質(zhì)量比配方為：蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽＝10：5：1：0.5，將各組份按其含量混合均勻，加熱至約70攝氏度，攪拌均勻乳化即得，膳食給予量為13.2g/kg；低糖高脂組膳食質(zhì)量比配方為：蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽＝5：10：1：0.5，將各組份按其含量混合均勻，加熱至約70攝氏度，攪拌均勻乳化即得，膳食給予量為13.2g/kg；低糖低脂組膳食質(zhì)量比配方為：蔗糖、豬油、膽固醇、膽酸鹽＝5：5：1：0.5，將各組份按其含量混合均勻，加熱至約70攝氏度，攪拌均勻乳化即得，膳食給予量為9.2g/kg；各試驗(yàn)組動(dòng)物分組后按照設(shè)定的方案灌胃給予高糖高脂膳食，每天一次，每周6天，連續(xù)19個(gè)月。按要求測定食蟹猴空腹血糖、糖化血清白蛋白、糖化血紅蛋白、糖耐量、胰島素、胰高血糖素、胰島素抵抗等指標(biāo)。
血糖測定方法：(1)食蟹猴使用氯胺酮麻醉后，從頭靜脈和/或隱靜脈采血約1.0ml，離心后取血清，用日立7020生化分析儀測定。(2)食蟹猴保定后，手指常規(guī)消毒，用針頭扎破后擠掉第一滴血液后，用血糖試紙條蘸取血液，然后強(qiáng)生血糖儀測定血糖和/或靜脈采血后用生化分析儀測定血糖含量。造模期間0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19個(gè)月猴的空腹血糖情況。
糖化血清白蛋白測定方法：食蟹猴麻醉后從頭靜脈和/或后肢隱靜脈取出血液，離心后取血清，用南京建成生物研究所研發(fā)的測定試劑盒測定，測定流程嚴(yán)格執(zhí)行試劑盒說明書。造模前、造模期間7、13、19個(gè)月猴的血清糖化白蛋白情況。
糖化血紅蛋白測定方法：食蟹猴麻醉后從頭靜脈和/或后肢隱靜脈取血，EDTA抗凝，用挪威小旋風(fēng)血紅蛋白測定儀測定，測定過程嚴(yán)格執(zhí)行試劑盒說明書。測定造模前、造模期間7、13、19個(gè)月猴的糖化血紅蛋白含量。
口服糖耐量測定(OGTT)方法：食蟹猴禁食不禁水過夜，保定后按體重灌胃給予50％的葡萄糖溶液(5g/kg)10ml/kg。測定給藥后30min、60min、120min各試驗(yàn)組猴的血糖變化情況并計(jì)算曲線下面積。測定造模前、造模期間7、13、19個(gè)月猴的口服糖耐量。
胰島素、胰高血糖素測定方法：食蟹猴麻醉后從頭靜脈和/或后肢隱靜脈取血，EDTA抗凝，分離血漿，按照ELISA試劑盒說明書嚴(yán)格執(zhí)行，然后使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。測定造模期間13、19個(gè)月猴的血清胰島素、胰高血糖素情況。
胰島素抵抗測定方法：食蟹猴空腹12h后測定空腹血糖和胰島素水平，然后建立兩條靜脈輸注通道，靜脈輸注胰島素和葡萄糖，5min測定血糖一次，并依靠此數(shù)據(jù)調(diào)節(jié)胰島素的輸注量，使血糖維持在正常水平，維持1.5小時(shí)，該狀態(tài)下胰島素輸注量越少，胰島素抵抗就越小。測定造模期間13、19個(gè)月猴胰島素抵抗情況。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
4.1血糖研究結(jié)果(具體見表1)：研究結(jié)果表明，高糖高脂成年組、低糖低脂中老年組、低糖高脂中老年組、高糖低脂中老年組、高糖高脂中老年組在造模第11月開始血糖均明顯升高，并隨著造模時(shí)間的延長血糖上升的更高。各試驗(yàn)組血糖上升的幅度大小為：高糖高脂中老年組>低糖高脂中老年組>低糖高脂中老年組>低糖低脂中老年組>高糖高脂成年組，雖然高糖高脂成年組在成模速度方面最慢，但其使用的為正常成年動(dòng)物，因此，其應(yīng)用價(jià)值也最大。
表1-1食蟹猴血糖含量變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
表1-2食蟹猴血糖含量變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
4.2糖化血清白蛋白研究結(jié)果(具體見表2)：研究結(jié)果表明，陰性組糖化血清白蛋白(GSP)含量試驗(yàn)期間相對平穩(wěn)，未見明顯異常。與陰性對照組相比，高糖高脂成年猴組、低糖低脂中老年組、低糖高脂中老年組、高糖低脂中老年組、高糖高脂中老年組造模第13月至19月GSP均明顯升高。
表2食蟹猴糖化血清白蛋白變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
4.3糖化血紅蛋白研究結(jié)果(具體見表3)：陰性對照組試驗(yàn)期間糖化血紅蛋白(HbA1c)含量穩(wěn)定，未見明顯異常。與陰性對照組相比，高糖高脂青年組、低糖低脂組中老年組、低糖高脂組中老年組、高糖低脂組中老年組、高糖高脂組中老年組動(dòng)物造模第13月至19月HbA1c含量均明顯升高，有統(tǒng)計(jì)差異(P<0.01)；低糖低脂中老年組和低糖高脂中老年組造模第19月HbA1c含量明顯升高，有統(tǒng)計(jì)差異(P<0.01)，造模19月后各試驗(yàn)組HbA1c平均含量均到達(dá)6.3％以上。
表3食蟹猴糖化血紅蛋白變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
糖耐量研究結(jié)果(具體見表4)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陰性對照組動(dòng)物試驗(yàn)期間動(dòng)物口服糖耐量(OGTT)未見明顯異常。高糖高脂青年組造模第13月至19月糖耐量明顯降低，曲線下面積明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；低糖低脂中老年組、低糖高脂中老年組、高糖低脂中老年組、高糖高脂中老年組造模第13月至19月糖耐量明顯降低，曲線下面積明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
表4食蟹猴糖耐量變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
胰島素、胰高血糖素研究結(jié)果(具體見表5)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陰性對照組血漿動(dòng)物胰島素、胰高血糖素水平實(shí)驗(yàn)期間穩(wěn)定，未見明顯異常。高糖高脂青年組動(dòng)物造模、低糖低脂中老年組、低糖高脂中老年組、高糖低脂中老年組、高糖高脂中老年組動(dòng)物造模第13月、19月后血漿胰島素和胰高血糖素水平均明顯升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。
表5食蟹猴胰島素和胰高血糖素變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
胰島素抵抗研究結(jié)果(具體見表6)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陰性對照組動(dòng)物胰島素抵抗實(shí)驗(yàn)期間穩(wěn)定，未見明顯異常。高糖高脂青年組、低糖低脂中老年組、低糖高脂中老年組、高糖低脂中老年組、高糖高脂中老年組動(dòng)物造模第13月、19月后胰島素抵抗水平均明顯升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或0.01)。
表6食蟹猴胰島素抵抗變化表
與陰性對照組相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
由此可見，本發(fā)明的高糖高脂組、高糖低脂組、低糖高脂組、低糖低脂組都成功的誘導(dǎo)出2型糖尿病靈長類動(dòng)物模型。
實(shí)施例2：使用多種降糖作用機(jī)制的藥物驗(yàn)證高糖高脂誘發(fā)的2型糖尿病食蟹猴模型及降糖藥篩選和評價(jià)平臺(tái)的建立
本發(fā)明制備的2型糖尿病食蟹猴模型與人類2型糖尿病模型非常相近，其主要特點(diǎn)為血糖升高，糖耐量受損、胰島素水平升高和胰島素抵抗。因此，根據(jù)其特點(diǎn)，選用了3種作用機(jī)制的藥物對模型動(dòng)物進(jìn)行干預(yù)。第一種為雙胍類的代表藥物二甲雙胍，其作用機(jī)制為促使外周細(xì)胞加速葡萄糖的攝取；第二類為胰島素制劑門冬胰島素30，通過外源性直接給予胰島素，增加血漿胰島素水平，從而達(dá)到降糖的目的；第三類為胰島素增敏劑類藥物的代表藥物羅格列酮，其作用為促進(jìn)胰島素和受體結(jié)合，具體實(shí)驗(yàn)方法如下：
挑選造模成功的食蟹猴20只(2型糖尿病食蟹猴模型)，按空腹血糖值和糖耐量值分為4組，分別為模型對照組、二甲雙胍組、胰島素組、格列本脲組，每組5只。分組后分別進(jìn)行給藥，連續(xù)8周。分別測定動(dòng)物的空腹血糖、糖耐量、糖化血清白蛋白、糖化血紅蛋白等指標(biāo)以評價(jià)藥物的降糖作用。
首次給藥、中期給藥、末次給藥后動(dòng)態(tài)測定動(dòng)物的隨機(jī)血糖值，測定時(shí)間給藥前、給藥后30min、1、2、4、8、12、24h。
每2周測定一次動(dòng)物給藥后1h的隨機(jī)血糖值。
每4周測定一次動(dòng)物的糖耐量和糖化血紅蛋白、糖化血清白蛋白。
試驗(yàn)結(jié)果，二甲雙胍、胰島素、羅格列酮對2型糖尿病食蟹猴模型均具有明顯的降糖作用，能夠明顯降低模型動(dòng)物的血糖、糖化血清白蛋白、糖化血紅蛋白，提高動(dòng)物的糖耐量。但胰島素的作用最為明顯，羅格列酮和二甲雙胍，該結(jié)果與上述三種藥物的作用機(jī)制完全相符。
綜上所述，本發(fā)明通過高糖高脂膳食誘導(dǎo)2型糖尿病靈長類動(dòng)物模型研發(fā)成功，可用于各類抗糖尿病藥物，特別是嚙齒類動(dòng)物無法完成的、具有物種選擇性的生物技術(shù)類抗糖尿病藥物的篩選和評價(jià)。