本發(fā)明涉及生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合微生物飼料添加劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

微生物飼料添加劑是采用農(nóng)業(yè)部認(rèn)可的有益微生物經(jīng)發(fā)酵制成的生物制劑，是抗生素的最佳替代品。用于提高畜、禽的健康水平的人工培養(yǎng)菌群及其代謝產(chǎn)物，可調(diào)整畜、禽體內(nèi)的微生態(tài)失調(diào)，保持微生態(tài)平衡。是激發(fā)動(dòng)物自身有益菌種繁殖增長(zhǎng)，同時(shí)抵制有害菌系生長(zhǎng)的微生物制品。通過(guò)改善動(dòng)物腸道菌群生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，以提高動(dòng)物健康水平、提高抗病能力、提高消化能力的一類產(chǎn)品。是有效解決，疾病泛濫、病菌耐藥、免疫能力下降、成活率降低、養(yǎng)殖效益下降的有效手段。是畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的動(dòng)力。

微生物飼料添加劑主要包括中藥微生態(tài)制劑和益生素類制劑。中藥微生態(tài)制劑也稱為第四代益生素，性狀為潮濕粉末或養(yǎng)殖場(chǎng)自行發(fā)酵的活菌發(fā)酵液，是乳酸菌發(fā)酵中藥微生態(tài)活菌制劑。優(yōu)點(diǎn)是活菌含量高，缺點(diǎn)是不耐高溫。益生素類制劑是以枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌等多菌種發(fā)酵的一類微生物制劑的總稱。性狀為干燥粉末，載體多為稻殼粉或鈣粉，產(chǎn)品需要經(jīng)過(guò)加工、烘干、包裝等工藝，所含活菌數(shù)量很小，多為死的菌體或休眠狀態(tài)的芽孢類菌體。優(yōu)點(diǎn)是耐加工，可以供飼料廠使用，缺點(diǎn)是活菌數(shù)量少，需長(zhǎng)期使用才有效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決上述提供一種活菌數(shù)量多，耐高溫，提高飼料吸收率，促生長(zhǎng)發(fā)育的一種復(fù)合微生物飼料添加劑。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案 ：

所述飼料添加劑由以下成份及其重量組分組成：德氏乳桿菌40～60份、枯草芽孢桿菌10～20份、釀酒酵母菌10～20份、酪氨酸甜菜堿0.1～1份、6-羥基犬尿酸0.01～0.1份和寡糖5～10份。復(fù)合微生物飼料添加劑的方法，其包括以下步驟 ：采用固體發(fā)酵工藝制備德氏乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌 ，采用酶解法制備寡糖；德氏乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌以及酪氨酸甜菜堿、6-羥基犬尿酸和寡糖進(jìn)行混合加工，得到成品。

優(yōu)選地，各菌種活細(xì)胞計(jì)數(shù)為 ：德氏乳桿菌 (1～10)*10 ⁸ cfu/g，枯草芽孢桿菌(1～10)*10 ⁹ cfu/g，釀酒酵母菌 (5～10)*10 ⁹ cfu/g，總菌數(shù)≥ 3*10 ⁹ cfu/g。

優(yōu)選地，德氏乳桿菌的制備方法具體包括以下步驟 ：制備一級(jí)菌種 ：

德氏乳桿菌試管菌平板劃線或是稀釋涂平板，30℃恒溫培養(yǎng) 2～3d 得單菌落，挑取單菌落孢子接種到麩皮試管中，30℃恒溫培養(yǎng) 2～3d 至德氏乳桿菌長(zhǎng)到試管底部，得到試管菌 ；制備二級(jí)菌種 ：接種試管菌到盛有麩皮培養(yǎng)基的錐形瓶，30℃恒溫培養(yǎng) 24h，翻瓶，將結(jié)塊打散繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至 48～60h 停止培養(yǎng)，得到錐形瓶菌種 ；擴(kuò)大培養(yǎng)三級(jí)菌種 ：錐形瓶?jī)?nèi)菌種加入兩倍的滅菌水，混勻備用，接種錐形菌種到盛有麩皮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，30℃恒溫培養(yǎng) 24h，扣瓶，將結(jié)塊打散繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至 48～60h 停止培養(yǎng) ；發(fā)酵床固體發(fā)酵生產(chǎn)德氏乳桿菌制劑 ：投料、潤(rùn)料、蒸煮滅菌、降溫、接種、厚層通風(fēng)培養(yǎng)得到成品。

優(yōu)選地，枯草芽孢桿菌的制備方法具體如下所述 ：制備一級(jí)種子：甘油管保存的菌種LB固體培養(yǎng)基平板劃線，37℃恒溫培養(yǎng)24h，得單菌落。挑單菌落到盛有 LB 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃震蕩培養(yǎng) 12h。制備二級(jí)種子：一級(jí)種子液按照 1％接種到盛有 300mL LB 液體培養(yǎng)基的 500mL錐形瓶中，37℃震蕩培養(yǎng) 12h，備用。發(fā)酵床固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌：投料→潤(rùn)料→蒸煮滅菌→降溫→接種→厚層通風(fēng)培養(yǎng)→成品，培養(yǎng)基主要成分為 ：麩皮，豆粕及輔料，培養(yǎng)基定量稱重，嚴(yán)格配比，潤(rùn)料時(shí)添加的自來(lái)水體積在流量計(jì)下嚴(yán)格添加。所有設(shè)備用自來(lái)水嚴(yán)格清洗至無(wú)雜物。所有原料在蒸煮鍋內(nèi)混勻，裝料后旋緊進(jìn)出口蓋，蒸煮鍋以一定的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)，培養(yǎng)基得以翻動(dòng)，通入蒸氣，達(dá)到一定溫度后保溫滅菌，保證滅菌條件 ：121℃，30min 嚴(yán)格滅菌。所有的蒸汽滅菌的控制在電腦系統(tǒng)實(shí)時(shí)記錄，相應(yīng)的保證設(shè)施為壓力傳感器，溫度傳感器。滅菌完成后，物料傳輸?shù)綌倹鰴C(jī)上進(jìn)行降溫。降溫后傳輸?shù)交炝蠙C(jī)上進(jìn)行接種，接種完畢運(yùn)用輸送機(jī)將物料輸送到發(fā)酵床上。培養(yǎng)過(guò)程的管理 ：物料鋪滿發(fā)酵床后即進(jìn)入培養(yǎng)環(huán)節(jié)，生長(zhǎng)到一定階段物料會(huì)結(jié)塊，需通過(guò)翻曲機(jī)來(lái)進(jìn)行翻料 ；在生長(zhǎng)過(guò)程中，微生物的生長(zhǎng)和繁殖需要氧氣及水分，發(fā)酵溫度需保持在 35～40℃左右，每個(gè)發(fā)酵床對(duì)應(yīng)一個(gè)空調(diào)室來(lái)控制發(fā)酵室和物料的溫度和濕度。培養(yǎng)過(guò)程的結(jié)束 ：物料進(jìn)行培養(yǎng) 24～48h 后，培養(yǎng)過(guò)程完成，培養(yǎng)完成后運(yùn)用在線烘干，通 60℃以下的熱風(fēng)將物料干燥至水分含量為 10％左右。干燥完成后進(jìn)行粉碎，檢測(cè)，包裝。

釀酒酵母菌采取固體發(fā)酵制成，具體工藝如下 ：一級(jí)種制備：甘油管保存菌種 MRS 固體平板劃線，37℃恒溫培養(yǎng) 24h，得單菌落。挑取單菌落到盛有 MRS 液體培養(yǎng)基的 PA 瓶中，37℃靜置培養(yǎng) 12h。二級(jí)種制備：一級(jí)種子液按照1％接種到盛有300mL MRS液體培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，37℃靜置培養(yǎng) 12h，備用。淺盤發(fā)酵：按照 1～5％接種量將二級(jí)種子液均勻接種于釀酒酵母菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝于不銹鋼淺盤中，厚度 6-8cm。37℃靜止發(fā)酵 36～48h，45-50℃烘干粉碎，100 目過(guò)篩得成品。優(yōu)選地，所述固體發(fā)酵工藝采取的培養(yǎng)基包括麩皮培養(yǎng)基以及釀酒酵母菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述麩皮培養(yǎng)基包括麩皮、玉米芯、豆粕、酒糟、磷酸二氫鉀以及水，其質(zhì)量比為 16 ∶ 2 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 0.1 ∶ 25。優(yōu)選地，所述釀酒酵母菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基包括麩皮、玉米粉、豆粕、無(wú)機(jī)鹽、磷酸鹽以及水，其質(zhì)量比為 60 ∶ 20 ∶ 20 ∶ 1 ∶ 0.5 ∶ 500。優(yōu)選地，所述復(fù)合微生物飼料添加劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。

本發(fā)明的一種復(fù)合微生物飼料添加劑，其包括德氏乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌以及寡糖，能夠抑制有害菌的繁殖，使腸內(nèi)菌群保持平衡；產(chǎn)生消化酶，能夠合成維生素可以產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶等消化酶以及維生素B群；能夠增強(qiáng)免疫作用，通過(guò)刺激腸道內(nèi)免疫系細(xì)胞，增加局部抗體的形成，從而增加巨噬細(xì)胞活性。微生物飼料添加劑可使肝臟內(nèi)大量蓄集有增強(qiáng)免疫作用的維生素A；還能優(yōu)化生態(tài)環(huán)境。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：

一種復(fù)合微生物飼料添加劑，由以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的原料組成 ：德氏乳桿菌 60 份，枯草芽孢桿菌 20 份，釀酒酵母菌 15 份，寡糖 5 份。

復(fù)合微生物飼料添加劑中各菌種活細(xì)胞計(jì)數(shù)為 ：德氏乳所述飼料添加劑由以下成份及其重量組分組成：德氏乳桿菌40～60份、枯草芽孢桿菌10～20份、釀酒酵母菌10～20份、酪氨酸甜菜堿0.1～1份、6-羥基犬尿酸0.01～0.1份和寡糖5～10份。復(fù)合微生物飼料添加劑的方法，其包括以下步驟 ：采用固體發(fā)酵工藝制備德氏乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌 ，采用酶解法制備寡糖；德氏乳桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌以及酪氨酸甜菜堿、6-羥基犬尿酸和寡糖進(jìn)行混合加工，得到成品，酪氨酸甜菜堿、6-羥基犬尿酸通過(guò)寡糖具有?；罹N的作用，明顯提高活菌數(shù)量，從而提高飼料的利用率，在一定程度上提高了飼料效果，其中寡糖具有增強(qiáng)動(dòng)物免疫力防傳染病的作用。 優(yōu)選地，各菌種活細(xì)胞計(jì)數(shù)為 ：德氏乳桿菌 (1～10)*10 ⁸ cfu/g，枯草芽孢桿菌(1～10)*10 ⁹ cfu/g，釀酒酵母菌 (5～10)*10 ⁹ cfu/g，總菌數(shù)≥ 3*10 ⁹ cfu/g。

優(yōu)選地，德氏乳桿菌的制備方法具體包括以下步驟 ：制備一級(jí)菌種 ：

德氏乳桿菌試管菌平板劃線或是稀釋涂平板，30℃恒溫培養(yǎng) 2～3d 得單菌落，挑取單菌落孢子接種到麩皮試管中，30℃恒溫培養(yǎng) 2～3d 至德氏乳桿菌長(zhǎng)到試管底部，得到試管菌 ；制備二級(jí)菌種 ：接種試管菌到盛有麩皮培養(yǎng)基的錐形瓶，30℃恒溫培養(yǎng) 24h，翻瓶，將結(jié)塊打散繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至 48～60h 停止培養(yǎng)，得到錐形瓶菌種 ；擴(kuò)大培養(yǎng)三級(jí)菌種 ：錐形瓶?jī)?nèi)菌種加入兩倍的滅菌水，混勻備用，接種錐形菌種到盛有麩皮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，30℃恒溫培養(yǎng) 24h，扣瓶，將結(jié)塊打散繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至 48～60h 停止培養(yǎng) ；發(fā)酵床固體發(fā)酵生產(chǎn)德氏乳桿菌制劑 ：投料、潤(rùn)料、蒸煮滅菌、降溫、接種、厚層通風(fēng)培養(yǎng)得到成品。

優(yōu)選地，枯草芽孢桿菌的制備方法具體如下所述 ：制備一級(jí)種子：甘油管保存的菌種LB固體培養(yǎng)基平板劃線，37℃恒溫培養(yǎng)24h，得單菌落。挑單菌落到盛有 LB 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃震蕩培養(yǎng) 12h。制備二級(jí)種子：一級(jí)種子液按照 1％接種到盛有 300mL LB 液體培養(yǎng)基的 500mL錐形瓶中，37℃震蕩培養(yǎng) 12h，備用。發(fā)酵床固體發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌：投料→潤(rùn)料→蒸煮滅菌→降溫→接種→厚層通風(fēng)培養(yǎng)→成品，培養(yǎng)基主要成分為 ：麩皮，豆粕及輔料，培養(yǎng)基定量稱重，嚴(yán)格配比，潤(rùn)料時(shí)添加的自來(lái)水體積在流量計(jì)下嚴(yán)格添加。所有設(shè)備用自來(lái)水嚴(yán)格清洗至無(wú)雜物。所有原料在蒸煮鍋內(nèi)混勻，裝料后旋緊進(jìn)出口蓋，蒸煮鍋以一定的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動(dòng)，培養(yǎng)基得以翻動(dòng)，通入蒸氣，達(dá)到一定溫度后保溫滅菌，保證滅菌條件 ：121℃，30min 嚴(yán)格滅菌。所有的蒸汽滅菌的控制在電腦系統(tǒng)實(shí)時(shí)記錄，相應(yīng)的保證設(shè)施為壓力傳感器，溫度傳感器。滅菌完成后，物料傳輸?shù)綌倹鰴C(jī)上進(jìn)行降溫。降溫后傳輸?shù)交炝蠙C(jī)上進(jìn)行接種，接種完畢運(yùn)用輸送機(jī)將物料輸送到發(fā)酵床上。培養(yǎng)過(guò)程的管理 ：物料鋪滿發(fā)酵床后即進(jìn)入培養(yǎng)環(huán)節(jié)，生長(zhǎng)到一定階段物料會(huì)結(jié)塊，需通過(guò)翻曲機(jī)來(lái)進(jìn)行翻料 ；在生長(zhǎng)過(guò)程中，微生物的生長(zhǎng)和繁殖需要氧氣及水分，發(fā)酵溫度需保持在 35～40℃左右，每個(gè)發(fā)酵床對(duì)應(yīng)一個(gè)空調(diào)室來(lái)控制發(fā)酵室和物料的溫度和濕度。培養(yǎng)過(guò)程的結(jié)束 ：物料進(jìn)行培養(yǎng) 24～48h 后，培養(yǎng)過(guò)程完成，培養(yǎng)完成后運(yùn)用在線烘干，通 60℃以下的熱風(fēng)將物料干燥至水分含量為 10％左右。干燥完成后進(jìn)行粉碎，檢測(cè)，包裝。

釀酒酵母菌采取固體發(fā)酵制成，具體工藝如下 ：一級(jí)種制備：甘油管保存菌種 MRS 固體平板劃線，37℃恒溫培養(yǎng) 24h，得單菌落。挑取單菌落到盛有 MRS 液體培養(yǎng)基的 PA 瓶中，37℃靜置培養(yǎng) 12h。二級(jí)種制備：一級(jí)種子液按照1％接種到盛有300mL MRS液體培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，37℃靜置培養(yǎng) 12h，備用。淺盤發(fā)酵：按照 1～5％接種量將二級(jí)種子液均勻接種于釀酒酵母菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝于不銹鋼淺盤中，厚度 6-8cm。37℃靜止發(fā)酵 36～48h，45-50℃烘干粉碎，100 目過(guò)篩得成品。優(yōu)選地，所述固體發(fā)酵工藝采取的培養(yǎng)基包括麩皮培養(yǎng)基以及釀酒酵母菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述麩皮培養(yǎng)基包括麩皮、玉米芯、豆粕、酒糟、磷酸二氫鉀以及水，其質(zhì)量比為 16 ∶ 2 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 0.1 ∶ 25。優(yōu)選地，所述釀酒酵母菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基包括麩皮、玉米粉、豆粕、無(wú)機(jī)鹽、磷酸鹽以及水，其質(zhì)量比為 60 ∶ 20 ∶ 20 ∶ 1 ∶ 0.5 ∶ 500。優(yōu)選地，所述復(fù)合微生物飼料添加劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。

實(shí)施例2

一種復(fù)合微生物飼料添加劑，由以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的原料組成 ：德氏乳桿菌 50 份，枯草芽孢桿菌 20 份，釀酒酵母菌 20 份，寡糖 10 份。

復(fù)合微生物飼料添加劑中各菌種活細(xì)胞計(jì)數(shù)為 ：德氏乳桿菌 4*10 ⁸ cfu/g，枯草芽孢桿菌 10*10 ⁹ cfu/g，釀酒酵母菌 5*10 ⁹ cfu/g，總菌數(shù) 3*10 ⁹ cfu/

實(shí)施例 3

一種復(fù)合微生物飼料添加劑，由以下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的原料組成 ：德氏乳桿菌 55份，枯草芽孢桿菌 15份，釀酒酵母菌 20份，寡糖 10份。

復(fù)合微生物飼料添加劑中各菌種活細(xì)胞計(jì)數(shù)為 ：德氏乳桿菌 5*10 ⁸ cfu/g，枯草芽孢桿菌 9*10 ⁹ cfu/g，釀酒酵母菌 10*10 ⁹ cfu/g。

對(duì)上述實(shí)施例 1-3 所得復(fù)合微生物飼料添加劑分別進(jìn)行效果測(cè)試，投料對(duì)象是 22

日齡健康斷奶的仔豬，共 100 頭，隨機(jī)分為 4 組，每組 25 頭。對(duì)照組喂全價(jià)配合飼料 ；實(shí)驗(yàn)組 1 喂添加實(shí)施例 1 復(fù)合微生物飼料添加劑的配合飼料 ；實(shí)驗(yàn)組 2 喂添加實(shí)施例 2 復(fù)合微生物飼料添加劑的配合飼料 ；實(shí)驗(yàn)組3喂添加實(shí)施例3復(fù)合微生物飼料添加劑的配合飼料。全都不進(jìn)行抗生素等藥物的防控，日糧及其他飼養(yǎng)管理方法完全相同，飼喂 30d，結(jié)果如表1所示。由表可知，飼喂本發(fā)明公布的復(fù)合微生物飼料添加劑能顯著提高豬的免疫力及抗病力，同時(shí)對(duì)豬的日增重效果明顯，這大大節(jié)約了養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)成本。

。

注 ：腹瀉率＝ { 總腹瀉次數(shù) /( 試驗(yàn)豬頭數(shù) * 試驗(yàn)天數(shù) )}*100％

最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的幾個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。