本發(fā)明涉及一種具有調(diào)節(jié)腸道菌群功能的微量元素硒膳食補(bǔ)充劑及其應(yīng)用，屬于食品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腸道是人體最大的消化器官，也是人體最大的排毒器官，因此腸道的健康狀況直接決定了人體的健康狀況。與腸道健康息息相關(guān)的是腸道菌群的生態(tài)平衡。健康人的腸道中寄居著種類繁多的微生物，這些微生物構(gòu)成一個(gè)巨大而復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，目前腸道微生物中已發(fā)現(xiàn)的屬超過(guò)千種，總數(shù)量大約是1013個(gè)。穩(wěn)定的腸道菌群能有效幫助人體消化食物吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過(guò)自身代謝分泌維生素以及拮抗致病菌，為人體的健康發(fā)揮重要作用。
腸道菌群包括了益生菌、中性菌和致病菌。其中益生菌包括了雙歧桿菌、乳桿菌等，它們能促進(jìn)腸道內(nèi)食物的消化，合成人體所需的維生素，還能利用蛋白質(zhì)殘?jiān)铣杀仨毎被幔瑫r(shí)還能促進(jìn)礦物質(zhì)元素的吸收，對(duì)人體的健康十分有益。中性菌包括大腸桿菌、腸球菌等，在正常情況下這些菌在腸道內(nèi)的生長(zhǎng)定植對(duì)人體是有益的或者無(wú)害的，但是一旦增殖過(guò)多或者轉(zhuǎn)移到了其他器官中，就可能引起機(jī)體的某些疾病。致病菌則主要包括腸桿菌科下的一些菌屬如：沙門氏菌屬和志賀氏菌屬，如果這些菌在腸道內(nèi)大量繁殖會(huì)引發(fā)機(jī)體腹瀉、發(fā)燒甚至死亡。有研究指出，健康人群腸道內(nèi)有益菌的比例應(yīng)該達(dá)到70％，普通人群則是25％，便秘人群直接降到了15％，而癌癥人群則低至10％。所以腸道菌群的健康對(duì)人體的健康有著不可替代的作用。
如今改善腸道微生物的方法主要有：益生菌活菌的服用和益生元的食用。益生元的主要作用是達(dá)到腸道中，刺激有益菌的生長(zhǎng)，從而調(diào)節(jié)腸道微生物。但是如今市面上廣泛使用的益生元(如：低聚果糖)十分昂貴。而且如果直接添加到食品中可能會(huì)與食品中的其他組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，降低食品的保質(zhì)期，單獨(dú)保存則所需條件比較苛刻。因此需要尋找一種廉價(jià)、易儲(chǔ)存的益生元來(lái)調(diào)節(jié)人體的腸道菌群。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了能夠調(diào)節(jié)腸道菌群功能的膳食補(bǔ)充劑，是以亞硒酸鈉為有效成分或者主要有效成分。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能夠調(diào)節(jié)腸道菌群功能的膳食補(bǔ)充劑，所述膳食補(bǔ)充劑以亞硒酸鈉為主要有效成分。
在一種實(shí)施方式中，所述膳食補(bǔ)充劑為飼料、飲料、小麥粉、小麥制品等。
在一種實(shí)施方式中，所述飼料中還包括在飼料中可接受的載體。
在一種實(shí)施方式中，所述飼料是顆粒型飼料。
在一種實(shí)施方式中，所述飼料是小鼠飼料。
在一種實(shí)施方式中，所述飼料的制備：將把亞硒酸鈉溶解在去離子水中，然后與飼料混勻，制粒；其中硒含量為0.15～2.00mg/kg飼料。
在一種實(shí)施方式中，所述飼料中硒含量為0.40～1.00mg/kg飼料。
在一種實(shí)施方式中，所述飲料為含乳飲料，比如發(fā)酵乳。
在一種實(shí)施方式中，所述小麥制品包括面包等。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種能夠調(diào)節(jié)腸道菌群功能的藥物或者藥物組合物，所述藥物或者藥物組合物以亞硒酸鈉為主要有效成分。
在一種實(shí)施方式中，所述藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體。
在一種實(shí)施方式中，所述藥物組合物中的亞硒酸鈉是由冷凍干燥所得的亞硒酸鈉粉。
在一種實(shí)施方式中，藥物或者藥物組合物可配制成若干種劑型，其中含有藥學(xué)領(lǐng)域中常用的一些賦形劑；例如，口服制劑(如片劑，膠囊劑，溶液或混懸液)；可注射的制劑(如可注射的溶液或混懸液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制劑(例如軟膏或溶液)。
在一種實(shí)施方式中，所述藥物組合物為膠囊劑或者片劑。
在一種實(shí)施方式中，用于本發(fā)明藥物組合物的載體是藥學(xué)領(lǐng)域中可得到的常見類型，包括：口服制劑用的粘合劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、助溶劑、稀釋劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、無(wú)色素、矯味劑等；可注射制劑用的防腐劑、加溶劑、穩(wěn)定劑等；局部制劑用的基質(zhì)、稀釋劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑等。
在一種實(shí)施方式中，所述藥物組合物與標(biāo)簽放在一起；所述標(biāo)簽上記載硒攝入量在200～400μg/d。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種制備增加腸道微生物中益生菌豐度的藥物或者食品的方法，所述方法是將亞硒酸鈉添加到食品或者藥物中。
在一種實(shí)施方式中，所述益生菌為雙歧桿菌和/或植物乳桿菌。
在一種實(shí)施方式中，所述致病菌為腸桿菌科和/或梭菌屬等。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種制備降低腸道微生物中致病菌豐度的藥物或者食品的方法，所述方法是將亞硒酸鈉添加到食品或者藥物中。
本發(fā)明涉及的亞硒酸鈉皆滿足食用要求，形態(tài)呈結(jié)晶型粉末，溶于水，不溶于乙醇。熔點(diǎn)為350℃，純度>99.99％，分子量為119.9634，在空氣中穩(wěn)定，對(duì)濕度敏感，易結(jié)晶。
本發(fā)明中，調(diào)節(jié)腸道菌群是指增加腸道微生物中益生菌豐度和/或降低腸道微生物中致病菌豐度。
本發(fā)明的微量元素硒膳食補(bǔ)充劑或者藥物或者藥物組合物具有下述有益特性：
1、能夠增加腸道微生物中益生菌，如：雙歧桿菌和植物乳桿菌相對(duì)豐度。
2、能夠降低腸道微生物中致病菌，如：腸桿菌科，梭菌屬等相對(duì)豐度。
3、能夠提高機(jī)體的抗氧化能力。
本發(fā)明表明，當(dāng)微量元素硒膳食補(bǔ)充劑添加量為富硒組和高硒組水平時(shí)，機(jī)體腸道微生物能得到明顯的改善，益生菌如：乳桿菌、雙歧桿菌相對(duì)豐度得到了顯著提升；致病菌，如腸桿菌科和梭菌屬的相對(duì)豐度明顯的降低。并且本發(fā)明能夠有效提高機(jī)體抗氧化能力，非常具有應(yīng)用前景。
附圖說(shuō)明
圖1是飼料制作方法流程；
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：小鼠飼料制備
本發(fā)明的飼料制作方法如圖1所示。
把亞硒酸鈉溶解在去離子水中，然后與飼料混勻，制粒。詳細(xì)方法如下：分別稱量0.15，0.40，1.00和2.00mg亞硒酸鈉，溶解在200mL的去離子水中，倒入1kg的飼料原料中，混合制粒。形成硒含量為0.15，0.40，1.00和2.00mg/kg的小鼠飼料，分別命名為對(duì)照組、富硒組、高硒組和極高硒組。它們相當(dāng)于人的攝入量分別為50，200，400和800ug/d?；A(chǔ)飼料的成分如下表1、表2所示：
表1基礎(chǔ)飼料組成及含量
表2基礎(chǔ)飼料組成和營(yíng)養(yǎng)成分含量
實(shí)施例2：微量元素硒膳食補(bǔ)充劑對(duì)小鼠腸道菌群的影響
將40只四周齡的SPF級(jí)小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。分組分別是，對(duì)照組，富硒組，高硒組和極高硒組。每組分別喂食硒含量為0.15，0.40，1.00和2.00ppm的飼料。小鼠自由采食飲水，實(shí)驗(yàn)周期為2個(gè)月。兩個(gè)月結(jié)束后收集每只小鼠的糞便。使用糞便DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)，提取小鼠糞便的基因組。并使用PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA中的V4V5區(qū)。擴(kuò)增引物為515F(5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′，序列如SEQ ID NO:1所示)，907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′，序列如SEQ ID NO:2所示)。對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行電泳純化，使用膠回收試劑盒(Axygen Biosciences,CA,US)回收純化的產(chǎn)物。將純化后的產(chǎn)物等量混合后，采用Illumina MiSeqTM測(cè)序技術(shù)對(duì)混合樣進(jìn)行兩端測(cè)序。使用QIIME(版本1.17)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行de-multiplex以及quality-filter。使用UPARSE將相似度在97％以上的片段序列聚類成為分類操作單元(OTUs)，并利用UCHIME識(shí)別并移除嵌合序列。使用DPR分類(http://rdp.cme.msu.edu/)以及SILVA(SSU115)16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)每個(gè)16S rRNA進(jìn)行比對(duì)分類(置信度閾值為70％)。
小鼠腸道菌群分類結(jié)果如表3，在屬水平上，富硒組和高硒組的Allobaculum，Prevotella數(shù)量與對(duì)照組相比顯著上升，Lachnospiraceae呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。同時(shí)Alistipes和Bacteroides也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，有研究指出這兩種菌與肥胖呈正相關(guān)關(guān)系。
雖然乳桿菌和雙歧桿菌這兩種益生菌在整個(gè)腸道菌群中所占比例較小，但是起著不可替代的益生作用。梭菌屬和埃希-志賀氏菌菌屬是人體中常見的致病菌，它們也廣泛的存在于自然界中，正常人體腸道菌群中它們所占比例很小，一旦因?yàn)槟承┰虮l(fā)增長(zhǎng)，則會(huì)導(dǎo)致人體腹瀉、發(fā)熱、嘔吐甚至死亡等現(xiàn)象。因此將乳桿菌屬和雙歧桿菌屬以及一些致病菌屬的宏基因組數(shù)據(jù)單獨(dú)列入表3中。表3的數(shù)據(jù)顯示富硒組和高硒組的乳桿菌屬和雙歧桿菌屬高于對(duì)照組，有顯著性(p<0.05)，且梭菌屬和艾希-志賀氏菌屬的生長(zhǎng)被明顯抑制(p<0.01)。極高硒組雖然在乳桿菌屬上高于對(duì)照組，但是艾希-志賀氏菌屬相對(duì)豐度要高于對(duì)照組?？梢哉J(rèn)為，本發(fā)明的富硒組和高硒組的微量元素硒膳食補(bǔ)充劑可以明顯促進(jìn)益生菌的增殖，抑制致病菌的生長(zhǎng)，有效調(diào)節(jié)腸道菌群。
表3小鼠腸道益生菌與致病菌屬水平相對(duì)豐度％
注：*表示該組與對(duì)照組相比有顯著性差異，p<0.05；**表示該組與對(duì)照組比較有極大顯著性差異，p<0.01。
隨后采用特異性的引物對(duì)小鼠糞便中乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、腸桿菌科進(jìn)行熒光定量PCR(qPCR)分析，進(jìn)一步驗(yàn)證Illumina的分析結(jié)果。
表4小鼠糞便中不同菌群含量(log拷貝數(shù)/g糞便)
注：*表示該組與對(duì)照組相比有顯著性差異，p<0.05；**表示該組與對(duì)照組比較有極大顯著性差異，p<0.01。
表4的數(shù)據(jù)為qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，基本與宏基因組結(jié)果一致。富硒組和高硒組腸道中雙歧桿菌和乳桿菌的含量均高于對(duì)照組，致病菌腸桿菌科的含量低于對(duì)照組，且都有顯著性差異(P<0.05)。以上的數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的微量元素硒膳食補(bǔ)充劑的富硒組和高硒組能有效調(diào)節(jié)機(jī)體的腸道微生物組成和豐度，擁有促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)，抑制腸道病原菌生長(zhǎng)的能力。
實(shí)施例3：微量元素硒膳食補(bǔ)充劑對(duì)小鼠抗氧化能力的影響
按照實(shí)施例1所述的小鼠實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，眼眶取血處死小鼠，取小鼠的肝臟和腎臟，用預(yù)冷的生理鹽水清洗，勻漿。測(cè)定肝臟中SOD(超氧化物歧化酶)，MDA(丙二醛)和T-AOC(總抗氧化能力)等抗氧化指標(biāo)。測(cè)試結(jié)果如下表。
表5小鼠肝臟抗氧化測(cè)定
注：*表示該組與對(duì)照組相比有顯著性差異，p<0.05；**表示該組與對(duì)照組比較有極大顯著性差異，p<0.01。
從表5的數(shù)據(jù)可以看出，富硒組和高硒組的抗氧化能力要高于對(duì)照組、氧化應(yīng)激水平要低于對(duì)照組。SOD(過(guò)氧化物歧化酶)是動(dòng)植物體內(nèi)重要的抗氧化活性物，它的功能包括：清除體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的活性氧等自由基和修復(fù)自由基損傷的細(xì)胞。從表中數(shù)據(jù)可以看出，隨著膳食硒濃度的不斷增加，小鼠肝臟中SOD的活力也不斷增加，富硒組、高硒組和對(duì)照組之間有顯著性的差異。極高硒組SOD活力出現(xiàn)了略微下降的現(xiàn)象，但是和對(duì)照組也有顯著性差異。T-AOC(總抗氧化能力)是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的一個(gè)綜合指標(biāo)，當(dāng)機(jī)體組織的抗氧化能力越強(qiáng)的時(shí)候，T-AOC的數(shù)值越大。從表5可以看出富硒組、高硒組的T-AOC高于對(duì)照組，有顯著性。雖然極高硒組的SOD含量較對(duì)照組要高但是T-AOC卻比對(duì)照組要低。說(shuō)明本發(fā)明在富硒組和高硒組的應(yīng)用能夠提高機(jī)體的抗氧化能力。MDA(丙二醛)是生物體內(nèi)自由基與脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的標(biāo)志性產(chǎn)物，是生物體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的指標(biāo)。從表5的數(shù)據(jù)可以看出，富硒組、高硒組的MDA濃度顯著低于對(duì)照組，極高硒組略微高于對(duì)照組沒有顯著性差異。說(shuō)明，本發(fā)明的微量元素硒膳食補(bǔ)充劑能夠提高機(jī)體抗氧化能力，清除自由基保護(hù)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。
應(yīng)用實(shí)施例1：制備含有微量元素硒膳食補(bǔ)充劑的發(fā)酵乳
鮮奶加糖溶解后，加入一定量亞硒酸鈉，使其濃度為200μg/kg，于60℃，20MPa條件下進(jìn)行均質(zhì)，然后在95℃條件下殺菌5min，降溫到35℃，加入商業(yè)干粉發(fā)酵劑保加利亞乳桿菌和商業(yè)干粉發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌，所述混合菌的接種量為鮮奶重量的0.03％，混勻，在40℃下保溫發(fā)酵，凝乳后，在溫度4℃下冷藏24h，得到所述富硒發(fā)酵乳。
應(yīng)用實(shí)施例2：制備含量微量元素硒膳食補(bǔ)充劑的面包
將10g白砂糖和200μg的亞硒酸鈉溶于300ml的溫水(41～45℃)中，將干酵母灑在水上，攪拌，靜置10-15min。然后將水倒入1kg面粉中，混勻，揉面，于室溫下放置60min。用拳頭壓扁面團(tuán)排除其中氣泡，將面團(tuán)分成等大小若干份，再將小面團(tuán)放置室溫下繼續(xù)發(fā)酵至原先體積的兩倍大，發(fā)酵時(shí)間依據(jù)室溫而定，為60min～120min之間。在面團(tuán)表面涂少許黃油，與220℃的烤箱中烘烤30～35min。冷卻至室溫，即得到所述的富硒面包。
應(yīng)用實(shí)施例3：制備含微量元素硒膳食添加劑的顆粒飼料
將0.4～1mg的亞硒酸鈉添加入1kg粉狀預(yù)混飼料中，充分混勻，以小型顆粒飼料機(jī)進(jìn)行制粒，制粒溫度為65℃，得到富硒顆粒飼料，所得顆粒飼料硒含量為0.4～1mg/kg。
應(yīng)用實(shí)施例4：制備含有微量元素硒膳食補(bǔ)充劑的膠囊制品
稱量亞硒酸鈉200μg，加入到以重量計(jì)算3％的海藻酸鈉溶液中，充分?jǐn)嚢枞芙?，然后將此混合液以重量?jì)2％氯化鈣溶液中形成膠粒，靜置固化30min，過(guò)濾收集膠粒，將收集到膠粒進(jìn)行冷凍干燥48h，得到含有亞硒酸鈉的粉劑，將這種粉劑裝入目前市場(chǎng)上銷售的藥用膠囊中，得到所述的膠囊制品。
應(yīng)用實(shí)施例5：制備含有微量元素硒膳食補(bǔ)充劑的片劑
分別稱取采用冷凍干燥方法制備的亞硒酸鈉粉劑25.7重量份、淀粉55.0重量份、纖維素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉鈉12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份與水1.0重量份，充分混勻，采用常規(guī)方法制成濕顆粒，然后使用例如中南制藥機(jī)械廠生產(chǎn)的壓片機(jī)進(jìn)行壓片，然后使用例如青州市益康中藥機(jī)械有限公司生產(chǎn)的小型藥物干燥劑中進(jìn)行干燥，再包裝得到本發(fā)明的片劑。
應(yīng)用實(shí)施例6：制備含微量元素硒膳食補(bǔ)充劑的小鼠顆粒飼料
將0.4～1mg的亞硒酸鈉添加入1kg粉狀預(yù)混飼料中，充分混勻，以小型顆粒飼料機(jī)進(jìn)行制粒，制粒溫度為65℃，得到富硒顆粒飼料，所得顆粒飼料硒含量為0.4～1mg/kg。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
序列表
<110> 江南大學(xué)
<120> 一種具有調(diào)節(jié)腸道菌群功能的微量元素硒膳食補(bǔ)充劑及其應(yīng)用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgccagcmg ccgcgg 16
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgtcaattc mtttragttt 20