本發(fā)明屬于食品加工領(lǐng)域，涉及一種功能性食品，具體為一種富含功能因子的風(fēng)味酸奶及其制備方法。
背景技術(shù)：
黃酮類化合物是一類由兩個(gè)苯環(huán)通過中央三碳連接(c6-c3-c6)作為基本分子結(jié)構(gòu)的化合物，廣泛存在于高等植物及羊齒植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等中，是植物多酚的一個(gè)亞群。其種類繁多，目前發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物已經(jīng)有9000多種，根據(jù)c環(huán)結(jié)構(gòu)的不同，可將黃酮類化合物分為黃酮類、黃酮醇類、黃烷酮類、黃烷醇類、兒茶酸類、花色素類、異黃酮類、查兒酮等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃酮類化合物具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種生物活性，在腫瘤治療、延緩衰老等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。黃酮類化合物廣泛分布在自然界，主要存在于植物體內(nèi)，并且大多以黃酮糖苷的形式存在。黃酮糖苷作為一類大分子物質(zhì)，不易滲入腸上皮細(xì)胞，從而難以被人體吸收，生物利用率低，降低了其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。通過技術(shù)手段將黃酮糖苷轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的黃酮苷元，可大大提高其生物利用率。然而，傳統(tǒng)的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法環(huán)境友好度低，不利于大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用。一些微生物在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，可以把黃酮糖苷水解成相應(yīng)的苷元。因此，近年來研究人員致力于研究新型黃酮糖苷轉(zhuǎn)化方法。利用乳酸菌、靈芝等微生物發(fā)酵對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化是一種非常安全、高效和低成本的方法。
銀杏葉含有20多種黃酮類化合物，包括銀杏雙黃酮、異銀杏雙黃酮、7-去甲基銀杏雙黃酮等；山楂葉中黃酮類化合物含量高達(dá)1.8～2％，為果實(shí)含量的20～120倍；荷葉含有豐富的槲皮素、異槲皮素、蓮甙等黃酮類化合物；靈芝含有多糖、多肽、三萜類、16種氨基酸(其中含有7種人體必需氨基酸)、蛋白質(zhì)、甾類、甘露醇、香豆精苷、生物堿、有機(jī)酸，以及微量元素ge、fe、ca、mn、zn等。靈芝菌絲體發(fā)酵液富含多糖、氨基酸、微量元素，具有抗疲勞、強(qiáng)化人體免疫、抗氧化、延緩衰老、抗腫瘤等功能，一些靈芝菌絲體在發(fā)酵過程中產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，能把黃酮苷轉(zhuǎn)化為黃酮苷元，提高其利用率。
紅豆含蛋白質(zhì)、纖維素、異黃酮、礦物質(zhì)及維生素。研究發(fā)現(xiàn)大豆、紅豆等發(fā)芽后，其γ-氨基丁酸(gaba)、vc和、異黃酮等功能性因子含量都有明顯提高，在發(fā)芽過程中添加谷氨酸鈉，能提高gaba的產(chǎn)量。γ-氨基丁酸具有鎮(zhèn)靜、降低血壓、抗癲癇、調(diào)節(jié)激素、增加胃黏膜屏障機(jī)能等作用。除此之外，gaba還有修復(fù)皮膚、預(yù)防肥胖、改善更年期綜合癥等功能。
目前，市售酸奶大多是以牛奶或奶粉為原料經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制成，種類和功能比較單一，未見利用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)富含黃酮苷元、活性多糖、γ-氨基丁酸及膳食纖維等功能因子的特色風(fēng)味酸奶研究報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種功能多樣化的酸奶制品，本發(fā)明提供了一種富含功能因子的風(fēng)味酸奶及其制備方法。
技術(shù)方案：一種富含功能因子的風(fēng)味酸奶的制備方法，所述方法包括兩次發(fā)酵：第一次發(fā)酵，以酶解后的山楂葉、荷葉、銀杏葉和紅豆渣為底物，接種靈芝發(fā)酵劑發(fā)酵；第二次發(fā)酵，在第一次發(fā)酵產(chǎn)物的基礎(chǔ)上加入紅豆芽漿、脫脂奶粉、蔗糖作為發(fā)酵底物，接種德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌和短乳桿菌發(fā)酵。
優(yōu)選的，所述方法具體步驟如下：
(1)菌株活化：在無菌條件下，將德氏乳桿菌保加利亞亞種(bncc336436或bncc186626或bncc138500或bncc187941)、植物乳桿菌(bncc337796或bncc191046或bncc192556)、短乳桿菌(bncc337373或bncc189074或bncc181703)、嗜熱鏈球菌(bncc187932或bncc186629或bncc175966或bncc175937)分別接種于mrs液體培養(yǎng)基中，分別在35～43℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～36小時(shí)；
(2)發(fā)酵劑制備：無菌條件下，將步驟(1)活化后的菌種分別接種在37～40℃脫脂乳培養(yǎng)基中，37～43℃保溫箱中培養(yǎng)3～8小時(shí)，至活菌數(shù)達(dá)到107～108cfu/ml；
(3)靈芝菌種培養(yǎng)：將靈芝菌株(bncc190549或bncc143287或bncc185311或bncc143288)在28℃活化30min，接種至pda斜面培養(yǎng)基上，生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)8～9天至斜面長滿菌絲；將活化后的斜面菌種接種到裝有pdb培養(yǎng)基的搖瓶中，28℃、180rpm培養(yǎng)8天；
(4)紅豆芽漿制備：將紅豆于23～28℃水中浸泡5～8小時(shí)，然后調(diào)節(jié)ph至5.1～6.0，加入0.08～0.15％谷氨酸鈉，0.2～0.6mmol/lvb6，轉(zhuǎn)入方形篩中，在23～29℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，芽莖長至3～4cm后收集發(fā)芽紅豆，置于60～70℃烘箱中處理2～5小時(shí)，加入5～7倍質(zhì)量的水進(jìn)行熱磨漿，分離后得紅豆芽漿和紅豆渣；
(5)山楂葉、荷葉和銀杏葉的粉末制備：將山楂葉、荷葉和銀杏葉洗凈、晾干，分別置于60～70℃干燥箱中處理6～9小時(shí)后常溫冷卻，粉碎過60～100目篩，再超微粉碎至細(xì)度為300～500目；
(6)超聲處理及酶解：將山楂葉、荷葉和銀杏葉的粉末按質(zhì)量比1～3:1～2:1混合，分散于8～12倍質(zhì)量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，緩沖液的ph為3.5～4.6，向緩沖液中加入15～25％的紅豆渣，250～300w超聲處理15～30min；向上述溶液中加入0.01～0.05％、活力10000～100000u/g的纖維素酶和0.005～0.01％、活力為20000～100000u/g的果膠酶，35～50℃酶解3～10小時(shí)，酶解過程中以90～100rpm速度攪拌，酶解反應(yīng)結(jié)束后將ph調(diào)至5.5～6.5，制得富含黃酮類物質(zhì)的混合酶解液；
(7)深層發(fā)酵培養(yǎng)液配制：將步驟(6)制得的酶解液裝于發(fā)酵罐中，裝液量為發(fā)酵罐體積的40～60％，按質(zhì)量比添加蔗糖2.0～3.0％、葡萄糖1.0～2.0％、硫酸鋅0.001％、大豆肽粉0.1～0.5％、玉米粉1.0～3.0％、的谷胺酸鈉0.10～0.15％，混合均勻，加熱至75～85℃，保溫20～30min殺菌；
(8)靈芝菌絲種子液接種、發(fā)酵：將步驟(7)的發(fā)酵液冷卻至29℃后，按質(zhì)量比或體積比加入靈芝菌絲種子液10～15％，27～29℃通氣攪拌培養(yǎng)36～48h，再25～26℃下通氣攪拌培養(yǎng)48～96h，攪拌速度為200～250rpm，通氣速度為10～25l/min；
(9)配料、殺菌：將步驟(8)制得的靈芝菌絲發(fā)酵液的ph調(diào)至6.8～7.0，按質(zhì)量比2～3:1與紅豆芽漿混合，再按混合液的總質(zhì)量加入10～13％的脫脂奶粉、6.0～8.0％的蔗糖，混合均勻后，先用膠體磨磨3～4次，加熱至50～65℃，再用高壓均質(zhì)機(jī)，在20～25mpa的壓力下均質(zhì)，均質(zhì)結(jié)束后，加熱至75～90℃，保溫殺菌15～25min；
(10)接種乳酸菌、發(fā)酵：將步驟(9)制得的發(fā)酵液冷卻至38～43℃后，按質(zhì)量比加入2.0～3.0％的植物乳桿菌發(fā)酵劑、2.0～3.0％的短乳桿菌發(fā)酵劑、1.5～3.0％的保加利亞乳桿菌發(fā)酵劑、2.5～3.5％的嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑，混合均勻后，分裝至經(jīng)殺菌的200～250ml玻璃瓶或塑料杯中、封口，置于37～42℃發(fā)酵箱或發(fā)酵室內(nèi)，保溫培養(yǎng)3～5小時(shí)后，移入4～8℃冰箱或冷藏室內(nèi)，經(jīng)6～12小時(shí)發(fā)酵成熟，制得富含功能因子的風(fēng)味酸奶。
進(jìn)一步的，步驟(1)中所述mrs液體培養(yǎng)基由以下配方制得：蛋白胨l0g，牛肉膏l(xiāng)0g，酵母提取物5g，k2hpo42g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，吐溫-80ml，mgso4·7h2o0.5g，mnso40.25g，溶于1l蒸餾水，調(diào)ph至6.2～6.4，121℃滅菌20min。
進(jìn)一步的，步驟(3)中所述pda斜面培養(yǎng)基由以下方法制得：馬鈴薯200～250g去皮、切片、加水1000ml，煮沸15～20分鐘，取濾汁加瓊脂20～25g繼續(xù)煮，待瓊脂全部溶解加入葡萄糖20～25g，攪拌至全部溶解，補(bǔ)水至1000ml，裝入試管，裝量為試管高度的1/5～1/4，塞上棉塞，1.05kg蒸氣壓保持20～25分鐘滅菌擺成斜面。
進(jìn)一步的，步驟(3)中所述的pdb培養(yǎng)基的配方如下：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖25g，蒸餾水1000ml。
任一所述方法制得的富含功能因子的風(fēng)味酸奶。
優(yōu)選的，所述功能因子包括活性多糖、黃酮、γ-氨基丁酸和膳食纖維。
本發(fā)明的原理在于：(1)先將山楂葉、荷葉和銀杏葉超微粉碎、配成液體，再加入紅豆渣，并經(jīng)超聲波處理和纖維素酶解，能夠促進(jìn)植物葉片細(xì)胞壁的纖維素骨架降解，破壞細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)，加速細(xì)胞內(nèi)黃酮類物質(zhì)等功能性成分釋放；(2)通過靈芝菌絲孢子發(fā)酵產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，把黃酮苷類物質(zhì)分解為易被腸道吸收的黃酮苷元，同時(shí)產(chǎn)生多糖等功能因子；(3)靈芝菌絲發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，再加入脫脂奶粉、蔗糖及富含γ-氨基丁酸的紅豆芽漿，混合均勻后，經(jīng)膠體磨勻漿、高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)、殺菌、冷卻后，接種乳酸菌發(fā)酵劑，混勻、發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵過程中，植物乳桿菌分泌出β-葡萄糖苷酶，促進(jìn)黃酮苷類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為黃酮苷元，短乳桿菌能夠把配料中的谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸；(4)通過靈芝與乳酸菌分步發(fā)酵轉(zhuǎn)化，顯著提高了植物源黃酮類物質(zhì)的生物活性，利用紅豆發(fā)芽與短乳桿菌發(fā)酵等生物轉(zhuǎn)化法，促進(jìn)了γ-氨基丁酸的產(chǎn)生，制得富含活性多糖、黃酮、γ-氨基丁酸及膳食纖維等功能因子，具有抗氧化、抗疲勞及免疫調(diào)節(jié)等功能的靈芝風(fēng)味酸奶制品。
有益效果：(1)本發(fā)明所述風(fēng)味酸奶富含活性多糖、黃酮、γ-氨基丁酸和膳食纖維等功能因子；(2)本發(fā)明所述風(fēng)味酸奶具有抗氧化、抗疲勞和免疫調(diào)節(jié)等功能；(3)本發(fā)明所述風(fēng)味酸奶的制備方法通過超聲處理、酶解及分步發(fā)酵等步驟實(shí)現(xiàn)有效成分的生物轉(zhuǎn)化，提高植物源黃酮類物質(zhì)的生物活性；(4)本發(fā)明所述方法為特色風(fēng)味功能性酸奶的開發(fā)提供了思路，也為山楂葉、荷葉和銀杏葉的深度加工、利用探索了一條經(jīng)濟(jì)實(shí)用的途徑。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
一、實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法
1、總黃酮類化合物及苷元含量的測(cè)定
(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取蘆丁對(duì)照品200mg，加70％(v/v)乙醇溶解后，定容至100ml。精密吸取10ml，用蒸餾水定容至100ml，得到0.2mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0ml、0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.0ml、2.4ml，分別置于10ml量瓶中，加蒸餾水至2.4ml，加入5％亞硝酸鈉溶液0.4ml，混勻，放置6min，加入10％硝酸鋁0.40ml，搖勻，放置6min，加入4.3％氫氧化鈉4.0ml，再加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15min，以試劑空白為對(duì)照。在500nm波長處測(cè)定吸收度a，以吸光度a為縱坐標(biāo)、濃度c為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁濃度-吸收度標(biāo)準(zhǔn)曲線，作線性回歸，得方程：c＝78.52a-0.7302(r＝0.9991)。
(2)黃酮類化合物含量測(cè)定：準(zhǔn)確稱取一定量的酸奶冷凍干燥后,放入燒杯中，加入一定量70％的乙醇，用玻璃棒攪成漿糊狀，放入500ml帶塞的燒杯中,用70％乙醇清洗燒杯和玻璃棒，洗液也倒入燒杯中，再加70％乙醇至250ml，然后用超聲處理20分鐘，過濾，然后用移液管吸取10ml濾液,用70％乙醇定容到100ml，按上述方法測(cè)定吸光度值,用標(biāo)注曲線計(jì)算出黃酮類化合物的含量。
(3)黃酮苷元含量測(cè)定采用雙波長光度法(依據(jù)錢麗麗等，雙波長光度法測(cè)定染料木黃酮和黃豆苷元含量，中國糧油學(xué)報(bào)，2010年第7期)
2、多糖、γ-氨基丁酸及膳食纖維含量測(cè)定
(1)多糖含量測(cè)定：采用苯酚-硫酸法(依據(jù)丁鋼強(qiáng)等,食品多糖含量不同測(cè)定方法的研究,實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2000年，第7卷第5期，325-327頁).
(2)γ-氨基丁酸(gaba)含量測(cè)定可采用以下二種方法：
(3)膳食纖維含量的測(cè)定(酶重量法)：樣品經(jīng)α-淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶酶解、消化以去除蛋白質(zhì)和淀粉，酶解液用乙醇沉淀、過濾，殘?jiān)靡掖己捅礈?，干燥后的物質(zhì)即為總膳食纖維殘?jiān)?，蛋白質(zhì)、灰分和空白后即可計(jì)算出樣品中的總膳食纖維含量(依據(jù)林賽君等，食品中總膳食纖維測(cè)定方法的改進(jìn),中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志2013年10月第23卷第14期，2877-2879；胡彩霞等，乳及乳制品中膳食纖維測(cè)定方法的研究，中國食品工業(yè)，2010年第4期)。
3、抗氧化能力指標(biāo)測(cè)定
(1)總抗氧化能力的測(cè)定：在氧化反應(yīng)體系中添加酸奶粗提物，利用fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生羥自由基，以抗壞血酸作為陽性對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后于510nm處測(cè)定吸光值；總抗氧化能力按下面的公式計(jì)算：
(2)超氧陰離子自由基的測(cè)定：在反應(yīng)系統(tǒng)中，每升樣品在37℃反應(yīng)40min所抑制的超氧陰離子自由基相當(dāng)于1mg的維生素c所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個(gè)活力單位。
od1：對(duì)照管的吸光度；od2：測(cè)定管的吸光度；od3：標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度。
(3)羥自由基的測(cè)定：fenton反應(yīng)是最常見的產(chǎn)生羥自由基的化學(xué)反應(yīng)，h2o2的量和fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基成正比，當(dāng)給予電子受體后，用gress試劑顯色，形成紅色物質(zhì)，其呈色與羥自由基的多少成正比關(guān)系。
標(biāo)準(zhǔn)管濃度為8.824mmol/l；取樣量為1ml；od1：對(duì)照管的吸光度；od2：測(cè)定管的吸光度；od3：標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度；od4：空白管的吸光度。
4、免疫指標(biāo)測(cè)定
(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及灌胃
60只小鼠隨機(jī)分成3組，每組20只。分別為正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺(cy)對(duì)照組、cy+酸奶組(實(shí)驗(yàn)組)。在小鼠適應(yīng)一周后，開始灌胃，正常對(duì)照組和cy對(duì)照組每天灌胃生理鹽水0.10ml/10g體重，實(shí)驗(yàn)組每天灌胃酸奶粗提物0.10ml/10g體重，連續(xù)30天。在灌胃的前5天，除正常對(duì)照組外，環(huán)磷酰胺(cy)對(duì)照組每日腹腔注射等容積的環(huán)磷酰胺100mg/kg體重。
(2)臟器指數(shù)計(jì)算公式
各組小鼠在末次給藥24h后稱重，尾靜脈取血，脫頸椎處死小鼠后，剖取肝臟、脾臟和胸腺。用濾紙吸干在電子天平上稱重計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。
(3)吞噬指數(shù)測(cè)定
k：未經(jīng)校正吞噬的指數(shù)；od1：2分鐘時(shí)血標(biāo)本od值；od2：20分鐘時(shí)血標(biāo)本od值。
5、抗疲勞實(shí)驗(yàn)
以市售酸奶對(duì)照組及本發(fā)明開發(fā)的酸奶低、中、高三個(gè)不同濃度劑量組灌胃小鼠25天后對(duì)其血清與肝臟的超氧化歧化酶(superoxidedismutasesod)活性、丙二醛(maleicdialdehydemda)含量及肌糖原、肝糖原、血清尿素氮、血乳酸水平等進(jìn)行測(cè)試，并進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，具體方法參考付云寶等方法[付云寶等，和田茴香籽總黃酮體內(nèi)抗氧化抗疲勞試驗(yàn)研究，新疆師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版，2013年12月，第32卷，第4期，33-38頁]。
實(shí)施例1
一種富含功能因子的風(fēng)味酸奶的制備方法，所述方法包括兩次發(fā)酵：第一次發(fā)酵，以酶解后的山楂葉、荷葉、銀杏葉和紅豆渣為底物，接種靈芝發(fā)酵劑發(fā)酵；第二次發(fā)酵，在第一次發(fā)酵產(chǎn)物的基礎(chǔ)上加入紅豆芽漿、脫脂奶粉、蔗糖作為發(fā)酵底物，接種德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌和短乳桿菌發(fā)酵。
所述方法具體步驟如下：
(1)菌株活化：在無菌條件下，將德氏乳桿菌保加利亞亞種(bncc336436)、植物乳桿菌(bncc337796)、短乳桿菌(bncc337373)、嗜熱鏈球菌(bncc187932)分別接種于mrs液體培養(yǎng)基中，分別在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30小時(shí)；
(2)發(fā)酵劑制備：無菌條件下，將步驟(1)活化后的菌種分別接種在37℃脫脂乳培養(yǎng)基中，37℃保溫箱中培養(yǎng)6小時(shí)，至活菌數(shù)達(dá)到107cfu/ml；
(3)靈芝菌種培養(yǎng)：將靈芝菌株(bncc190549)在28℃活化30min，接種至pda斜面培養(yǎng)基上，生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)8天至斜面長滿菌絲；將活化后的斜面菌種接種到裝有pdb培養(yǎng)基的搖瓶中，28℃、180rpm培養(yǎng)8天；
(4)紅豆芽漿制備：將紅豆于23℃水中浸泡7小時(shí)，然后調(diào)節(jié)ph至6.0，加入0.10％谷氨酸鈉，0.2mmol/lvb6，轉(zhuǎn)入方形篩中，在23℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，芽莖長至3～4cm后收集發(fā)芽紅豆，置于60℃烘箱中處理4小時(shí)，加入5倍質(zhì)量的水進(jìn)行熱磨漿，分離后得紅豆芽漿和紅豆渣；
(5)山楂葉、荷葉和銀杏葉的粉末制備：將山楂葉、荷葉和銀杏葉洗凈、晾干，分別置于60℃干燥箱中處理8小時(shí)后常溫冷卻，粉碎過60目篩，再超微粉碎至細(xì)度為300目；
(6)超聲處理及酶解：將山楂葉、荷葉和銀杏葉的粉末按質(zhì)量比1:1:1混合，分散于8倍質(zhì)量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，緩沖液的ph為3.5，向緩沖液中加入15％的紅豆渣，250w超聲處理30min；向上述溶液中加入0.04％、活力10000～20000u/g的纖維素酶和0.01％、活力為20000u/g的果膠酶，48℃酶解9小時(shí)，酶解過程中以90rpm速度攪拌，酶解反應(yīng)結(jié)束后將ph調(diào)至6.5，制得富含黃酮類物質(zhì)的混合酶解液；
(7)深層發(fā)酵培養(yǎng)液配制：將步驟(6)制得的酶解液裝于發(fā)酵罐中，裝液量為發(fā)酵罐體積的45％，按質(zhì)量比添加蔗糖2.0％、葡萄糖2.0％、硫酸鋅0.001％、大豆肽粉0.1％、玉米粉1.0％、的谷胺酸鈉0.10％，混合均勻，加熱至75℃，保溫30min殺菌；
(8)靈芝菌絲種子液接種、發(fā)酵：將步驟(7)的發(fā)酵液冷卻至29℃后，按質(zhì)量比或體積比加入靈芝菌絲種子液10％，28℃通氣攪拌培養(yǎng)42h，再26℃下通氣攪拌培養(yǎng)48h，攪拌速度為200rpm，通氣速度為15l/min；
(9)配料、殺菌：將步驟(8)制得的靈芝菌絲發(fā)酵液的ph調(diào)至6.8，按質(zhì)量比2:1與紅豆芽漿混合，再按混合液的總質(zhì)量加入10％的脫脂奶粉、6.0％的蔗糖，混合均勻后，先用膠體磨磨3次，加熱至50℃，再用高壓均質(zhì)機(jī)，在20mpa的壓力下均質(zhì)，均質(zhì)結(jié)束后，加熱至75℃，保溫殺菌25min；
(10)接種乳酸菌、發(fā)酵：將步驟(9)制得的發(fā)酵液冷卻至43℃后，按質(zhì)量比加入2.0％的植物乳桿菌發(fā)酵劑、2.0％的短乳桿菌發(fā)酵劑、1.5％的保加利亞乳桿菌發(fā)酵劑、2.5％的嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑，混合均勻后，分裝至經(jīng)殺菌的200ml玻璃瓶或塑料杯中、封口，置于42℃發(fā)酵箱或發(fā)酵室內(nèi)，保溫培養(yǎng)3小時(shí)后，移入4℃冰箱或冷藏室內(nèi)，經(jīng)6小時(shí)發(fā)酵成熟，制得富含功能因子的風(fēng)味酸奶。
步驟(1)中所述mrs液體培養(yǎng)基由以下配方制得：蛋白胨l0g，牛肉膏l(xiāng)0g，酵母提取物5g，k2hpo42g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，吐溫-80ml，mgso4·7h2o0.5g，mnso40.25g，溶于1l蒸餾水，調(diào)ph至6.2，121℃滅菌20min。
步驟(3)中所述pda斜面培養(yǎng)基由以下方法制得：馬鈴薯200g去皮、切片、加水1000ml，煮沸15分鐘，取濾汁加瓊脂20g繼續(xù)煮，待瓊脂全部溶解加入葡萄糖20g，攪拌至全部溶解，補(bǔ)水至1000ml，裝入試管，裝量為試管高度的1/5，塞上棉塞，1.05kg蒸氣壓保持20分鐘滅菌擺成斜面。
步驟(3)中所述的pdb培養(yǎng)基的配方如下：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖25g，蒸餾水1000ml。
任一所述方法制得的富含功能因子的風(fēng)味酸奶。所述功能因子包括活性多糖、黃酮、γ-氨基丁酸和膳食纖維。
實(shí)施例2
與實(shí)施例1的區(qū)別在于：
步驟(1)菌株活化：在無菌條件下，將德氏乳桿菌保加利亞亞種(bncc187941)、植物乳桿菌(bncc192556)、短乳桿菌(bncc181703)、嗜熱鏈球菌(bncc186629或bncc175937)分別接種于mrs液體培養(yǎng)基中，分別在38℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；
步驟(2)發(fā)酵劑制備：無菌條件下，將步驟(1)活化后的菌種分別接種在37℃脫脂乳培養(yǎng)基中，39℃保溫箱中培養(yǎng)4小時(shí)，至活菌數(shù)達(dá)到107cfu/ml。
實(shí)施例3
與實(shí)施例1的區(qū)別在于：
步驟(3)靈芝菌種培養(yǎng)：將靈芝菌株(bncc185311)在28℃活化30min，接種至pda斜面培養(yǎng)基上，生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)9天至斜面長滿菌絲；將活化后的斜面菌種接種到裝有pdb培養(yǎng)基的搖瓶中，28℃、180rpm培養(yǎng)8天；
步驟(4)紅豆芽漿制備：將紅豆于26℃水中浸泡5小時(shí)，然后調(diào)節(jié)ph至5.7，加入0.12％谷氨酸鈉，0.4mmol/lvb6，轉(zhuǎn)入方形篩中，在26℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，芽莖長至3～4cm后收集發(fā)芽紅豆，置于60℃烘箱中處理4小時(shí)，加入6倍質(zhì)量的水進(jìn)行熱磨漿，分離后得紅豆芽漿和紅豆渣。
實(shí)施例4
與實(shí)施例1的區(qū)別在于：
步驟(5)山楂葉、荷葉和銀杏葉的粉末制備：將山楂葉、荷葉和銀杏葉洗凈、晾干，分別置于65℃干燥箱中處理7小時(shí)后常溫冷卻，粉碎過100目篩，再超微粉碎至細(xì)度為400目；
步驟(6)超聲處理及酶解：將山楂葉、荷葉和銀杏葉的粉末按質(zhì)量比2:1:1混合，分散于9～10倍質(zhì)量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，緩沖液的ph為4.0，向緩沖液中加入20％的紅豆渣，300w超聲處理30min；向上述溶液中加入0.03％、活力30000u/g的纖維素酶和0.006％、活力為50000u/g的果膠酶，37℃酶解8小時(shí)，酶解過程中以95rpm速度攪拌，酶解反應(yīng)結(jié)束后將ph調(diào)至6.0，制得富含黃酮類物質(zhì)的混合酶解液。
實(shí)施例5
與實(shí)施例1的區(qū)別在于：
步驟(7)深層發(fā)酵培養(yǎng)液配制：將步驟(6)制得的酶解液裝于發(fā)酵罐中，裝液量為發(fā)酵罐體積的50％，按質(zhì)量比添加蔗糖3.0％、葡萄糖1.0％、硫酸鋅0.001％、大豆肽粉0.3％、玉米粉2.0％、的谷胺酸鈉0.12％，混合均勻，加熱至80℃，保溫20min殺菌；
步驟(8)靈芝菌絲種子液接種、發(fā)酵：將步驟(7)的發(fā)酵液冷卻至29℃后，按質(zhì)量比或體積比加入靈芝菌絲種子液12％，29℃通氣攪拌培養(yǎng)40h，再25℃下通氣攪拌培養(yǎng)72h，攪拌速度為230rpm，通氣速度為20l/min。
實(shí)施例6
與實(shí)施例1的區(qū)別在于：
步驟(9)配料、殺菌：將步驟(8)制得的靈芝菌絲發(fā)酵液的ph調(diào)至7.0，按質(zhì)量比3:1與紅豆芽漿混合，再按混合液的總質(zhì)量加入13％的脫脂奶粉、7.0％的蔗糖，混合均勻后，先用膠體磨磨4次，加熱至65℃，再用高壓均質(zhì)機(jī)，在25mpa的壓力下均質(zhì)，均質(zhì)結(jié)束后，加熱至85℃，保溫殺菌15min；
步驟(10)接種乳酸菌、發(fā)酵：將步驟(9)制得的發(fā)酵液冷卻至38～40℃后，按質(zhì)量比加入3.0％的植物乳桿菌發(fā)酵劑、3.0％的短乳桿菌發(fā)酵劑、3.0％的保加利亞乳桿菌發(fā)酵劑、3.0％的嗜熱鏈球菌發(fā)酵劑，混合均勻后，分裝至經(jīng)殺菌的250ml玻璃瓶或塑料杯中、封口，置于37℃發(fā)酵箱或發(fā)酵室內(nèi)，保溫培養(yǎng)5小時(shí)后，移入8℃冰箱或冷藏室內(nèi)，經(jīng)12小時(shí)發(fā)酵成熟，制得富含功能因子的風(fēng)味酸奶。
檢測(cè)實(shí)施例1～6制備獲得的富含功能因子的風(fēng)味酸奶中各功能因子的含量，結(jié)果如下表所示：