本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)及功能保健領(lǐng)域，具體涉及一種灰樹花全活性物質(zhì)的制備方法。

背景技術(shù)：

灰樹花（grifolafrondosa）隸屬真菌界蓋孔菌科，俗稱“栗蘑”，是食、藥兼用蕈菌，具有顯著的保健作用和很高的藥用價(jià)值。且多種營養(yǎng)素居各種灰樹花之首，能促進(jìn)兒童身體健康成長和智力發(fā)育，被譽(yù)為“灰樹花王子”和“華北人參”。研究證明，灰樹花具有顯著的抗腫瘤、降血糖、降血脂、抑制b型肝炎dna復(fù)制、抗hiv病毒、抗氧化以及改善免疫系統(tǒng)功能等功效。

隨著生活水平的提高和生活節(jié)奏的改變，被稱為“富貴病”的“三高癥”發(fā)病率越來越高，特別是50歲以上中老年人健康的常見病，高血脂可以引起血管栓塞；高血壓可以引起腦出血和腦血管破裂；高血糖可以引起糖尿病。全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬人，居各種死因首位。但目前臨床上常用的口服降血糖血脂藥都有副作用，均可引起消化系統(tǒng)的不良反應(yīng)，有些還會(huì)引起麻疹、貧血、白細(xì)胞和血小板減少、頭暈和乏力等。因此尋找開發(fā)具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力作用的保健食品，以輔助藥物治療，在有效的控制血糖和血脂的同時(shí)降低副作用已引起人們的關(guān)注。

經(jīng)檢索，在灰樹花降血糖血脂領(lǐng)域已經(jīng)有蔣峰等的“一種復(fù)合真菌多糖營養(yǎng)劑”（專利申請?zhí)?00410102983.6），將灰樹花提取物與其它真菌等提取物制成一種復(fù)合營養(yǎng)劑，并將制成的產(chǎn)品用在修復(fù)胃腸粘膜、抗腫瘤、護(hù)肝上；雷紅等的“一種降血糖組合食物”（專利申請?zhí)?01110284448.7），將由灰樹花子實(shí)體提取得到的多糖粉與傳統(tǒng)降糖中藥黃芪按特定質(zhì)量比例混合制成一種降糖食物，并對由四氧嘧啶（alloxan）致病的ⅰ型糖尿病小鼠進(jìn)行降血糖功能試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其具有降血糖功能。

雖然灰樹花有顯著并且明確的降血脂降血壓，以及抗癌，保肝健胃等功效，但目前在高效制備灰樹花的活性成分的領(lǐng)域的技術(shù)上，往往存在灰樹花活性物質(zhì)制備不完全，制作工藝繁瑣，利用率低等問題。目前，尚未見將灰樹花采用順序溶劑（極性從小到大）提取制備活性物質(zhì)的方法報(bào)道，且此方法對大規(guī)模工業(yè)化的生產(chǎn)具有良好的開發(fā)前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種灰樹花全活性物質(zhì)的制備方法，其特征在于：以灰樹花為原料，采用從小到大不同極性的溶劑提取及復(fù)合蛋白酶酶解等方法制備灰樹花全活性物質(zhì)，根據(jù)中醫(yī)“君臣佐使”理論以及現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)理論，用所述方法制備的灰樹花活性物質(zhì)與其他具有相同功效的藥食同源活性成分復(fù)配制備輔助調(diào)節(jié)血糖、血脂、血壓、保肝等功效的營養(yǎng)功能性食品。

所述的一種灰樹花全活性物質(zhì)的制備方法，具體包括如下步驟：

a.灰樹花子實(shí)體用粉碎機(jī)磨成細(xì)粉備用；

b.將制得的灰樹花細(xì)粉先用體積分?jǐn)?shù)85%-95%（v/v）乙醇為提取溶劑在45-70℃中超聲-微波協(xié)同萃取或超聲輔助提取0.5-3h，過濾獲得灰樹花醇提液??；

c.將獲得的體積分?jǐn)?shù)85%-95%（v/v）乙醇提取的灰樹花剩余物利用體積分?jǐn)?shù)55%-65%乙醇在45-70℃進(jìn)行超聲-微波協(xié)同萃取或超聲輔助提取0.5-3h，過濾獲得灰樹花醇提液ⅱ；

d.再將得到的體積分?jǐn)?shù)55%-65%（v/v）乙醇提取的灰樹花剩余物利用去離子水在70-100℃進(jìn)行超聲-微波協(xié)同萃取或超聲輔助提取0.5-3h，過濾獲得灰樹花水提液；

e.最后將獲得灰樹花水提剩余物利用復(fù)合蛋白酶在37-65℃進(jìn)行酶解0.5-3h，過濾獲得灰樹花的酶解物；

f.所述b-d制備得到的灰樹花醇提液ⅰ、灰樹花醇提液ⅱ、灰樹花水提液ⅲ經(jīng)減壓濃縮、干燥后分別制備灰樹花醇提取物ⅰ、灰樹花醇提取物ⅱ、灰樹花水提取物ⅲ，這三者與步驟e酶解物組成灰樹花全活性物質(zhì)。

其中提取溶劑與提取物料的體積重量比（l:kg）為10:1-50:1。

其中復(fù)合蛋白酶添加量為灰樹花細(xì)粉重量的0.1-2%。

利用所述方法制備灰樹花全活性物質(zhì)的一種或幾種提取物與其他具有相同功效的藥食同源活性成分復(fù)配制備如口服液，膠囊，片劑，沖劑，固體飲料的不同劑型的營養(yǎng)、功能性食品。

本發(fā)明的有益之處

（1）本發(fā)明通過利用從小到大不同極性的溶劑提取及復(fù)合蛋白酶酶解、過濾、離心、減壓濃縮、干燥制備灰樹花85%-95%（v/v）乙醇提取物、灰樹花55%-65%（v/v）乙醇提取物、灰樹花水提取物以及酶解物?？梢愿娴闹苽涓喙δ艿幕覙浠ɑ钚晕镔|(zhì)，提高資源利用率。

（2）將本發(fā)明根據(jù)中醫(yī)的“君臣佐使”以及現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)理論，用所述方法制備的一種或幾種提取物與其他具有相同功效的藥食同源活性成分復(fù)配，制備的功能性食品長期食用可起到輔助調(diào)節(jié)血糖、血脂、血壓及保肝等功效。

附圖說明

圖1為灰樹花不同極性提取物及酶解物對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠血清中總膽固醇的影響；

圖2為灰樹花不同極性提取物及酶解物對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠血清中甘油三脂的影響；

圖3為灰樹花不同極性提取物及酶解物對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠血清中高密度脂蛋白膽固醇的影響；

圖4為灰樹花不同極性提取物及酶解物對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇的影響。

具體實(shí)施方式

為進(jìn)一步公開而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

灰樹花活性物質(zhì)的制備：

a.灰樹花子實(shí)體用粉碎機(jī)磨成細(xì)粉備用；

b.將制得的灰樹花細(xì)粉先用體積分?jǐn)?shù)95%（v/v）乙醇為提取溶劑在50℃中超聲輔助提取0.5h，過濾獲得灰樹花醇提液ⅰ，再放入到高壓萃取罐中濃縮1h，得到濃縮液?。?/p>

c.將獲得的體積分?jǐn)?shù)95%（v/v）乙醇提取的灰樹花剩余物利用體積分?jǐn)?shù)55%（v/v）乙醇在50℃超聲輔助提取0.5h，過濾獲得灰樹花醇提液ⅱ，再放入到高壓萃取罐中濃縮1h，得到濃縮液ⅱ；

d.將上述濃縮液ⅰ和ⅱ用噴霧干燥器干燥得灰樹花95%（v/v）及55%（v/v）乙醇提取物干粉。

其中提取溶劑與提取物料的體積重量比（l:kg）為10:1。

應(yīng)用例1

一種輔助降血糖血脂的灰樹花保健膠囊，由下述按重量份計(jì)的原料組成：

灰樹花95%（v/v）乙醇提取物15份、灰樹花55%（v/v）乙醇提取物10份、靈芝95%乙醇提取物1份、黑木耳水提物2份。

制備方法：

1、通過實(shí)施例1制備得到灰樹花95%v/v乙醇提取物、灰樹花55%v/v乙醇提取物；

2、按用料重量份比稱取灰樹花95%v/v乙醇提取物、灰樹花55%v/v乙醇提取物、靈芝95%v/v乙醇提取物、黑木耳水提物，混合均勻，在75℃干燥3h，得到膠囊填充物；

3、將膠囊填充物經(jīng)軟膠囊壓丸機(jī)進(jìn)行制備，制得的膠囊重量為10mg/粒，塑鋁包裝即可。

實(shí)施例2

灰樹花全活性物質(zhì)的制備：

a.灰樹花子實(shí)體用粉碎機(jī)磨成細(xì)粉備用；

b.將制得的灰樹花細(xì)粉先用體積分?jǐn)?shù)90%（v/v）乙醇為提取溶劑在60℃中超聲輔助提取1h，過濾獲得灰樹花醇提液ⅰ，再放入到高壓萃取罐中濃縮1h，得到濃縮液??；

c.將獲得的體積分?jǐn)?shù)90%（v/v）乙醇提取的灰樹花剩余物利用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇在60℃超聲輔助提取1h，過濾獲得灰樹花醇提液ⅱ，再放入到高壓萃取罐中濃縮1h，得到濃縮液ⅱ；

d.再將得到的體積分?jǐn)?shù)60%（v/v）乙醇提取的灰樹花剩余物利用去離子水在100℃進(jìn)行超聲輔助提取1h，過濾獲得灰樹花水提液，再放入到高壓萃取罐中濃縮1h，得到濃縮液ⅲ；

e.最后將獲得灰樹花水提剩余物利用復(fù)合蛋白酶在40℃進(jìn)行酶解1h，過濾獲得灰樹花的酶解液，再放入到高壓萃取罐中濃縮1h，得到濃縮液ⅳ；

f.將上述濃縮液ⅰ、ⅱ、ⅲ和ⅳ用噴霧干燥器干燥得灰樹花90%、60%（v/v）乙醇提取物、水提取物和酶解物干粉。

其中提取溶劑與提取物料的體積重量比（l:kg）為20:1。

應(yīng)用例2

一種輔助降血糖降血脂、保肝的灰樹花保健口服液的制備方法的步驟為：

灰樹花保健口服液，由下述按重量份計(jì)的原料組成：

灰樹花90%（v/v）乙醇提取物20份、灰樹花60%（v/v）乙醇提取物15份、灰樹花水提取物15份、灰樹花酶解物提取物15份、靈芝水提取2份、黑木耳水提物1份、絞股藍(lán)水提物1份、甘草提取物4份。

制備方法：

1、通過實(shí)施例2制備得到灰樹花90%（v/v）乙醇提取物、灰樹花60%（v/v）乙醇提取物、灰樹花水提取物及灰樹花酶解物；

2、按配方稱取靈芝水提取2份、黑木耳水提物1份、絞股藍(lán)水提物1份、甘草提取物4份；

3、將步驟1和步驟2提取物充分混合后用10倍蒸餾水溶解，經(jīng)密封管道進(jìn)入封閉的灌裝面中，密封灌裝制成輔助降血糖降血脂、保肝的灰樹花保健口服液。

實(shí)施例3

灰樹花活性物質(zhì)的制備：

a.灰樹花子實(shí)體用粉碎機(jī)磨成細(xì)粉備用；

b.將制得的灰樹花細(xì)粉先用體積分?jǐn)?shù)85%（v/v）乙醇為提取溶劑在65℃中超聲輔助提取1.5h，過濾獲得灰樹花醇提液ⅰ，再放入到高壓萃取罐中濃縮1h，得到濃縮液ⅰ；

c.將獲得的體積分?jǐn)?shù)85%（v/v）乙醇提取的灰樹花剩余物利用體積分?jǐn)?shù)55%（v/v）乙醇在70℃超聲輔助提取1.5h，過濾獲得灰樹花醇提液ⅱ，再放入到高壓萃取罐中濃縮1h，得到濃縮液ⅱ；

d.再將得到的體積分?jǐn)?shù)55%（v/v）乙醇提取的灰樹花剩余物利用去離子水在100℃進(jìn)行超聲輔助提取1.5h，過濾獲得灰樹花水提液，再放入到高壓萃取罐中濃縮1h，得到濃縮液ⅲ；

e.將上述濃縮液ⅰ、ⅱ、ⅲ用噴霧干燥器干燥得灰樹花85%、55%（v/v）乙醇提取物和水提取物干粉。

其中提取溶劑與提取物料的體積重量比（l:kg）為30:1。

應(yīng)用例3

一種輔助降血糖降血脂、保肝的灰樹花保健口服液的制備方法的步驟為：

灰樹花保健口服液，由下述按重量份計(jì)的原料組成：

灰樹花85%（v/v）乙醇提取物5份、灰樹花55%（v/v）乙醇提取物5份、灰樹花水提取物15份、靈芝醇提取5份、黑木耳水提物5份、枸杞提取物3份。

制備方法：

1、通過實(shí)施例3制備得到灰樹花85%（v/v）乙醇提取物、灰樹花55%（v/v）乙醇提取物及灰樹花水提取物；

2、按配方稱取灰樹花85%（v/v）乙醇提取物5份、灰樹花55%（v/v）乙醇提取物5份、灰樹花水提取物15份、靈芝醇提取5份、黑木耳水提物5份、枸杞提取物3份，充分混合，用10倍的蒸餾水溶解后經(jīng)密封管道進(jìn)入封閉的灌裝面中，密封灌裝制成輔助降血糖降血脂、保肝的灰樹花保健口服液。

藥效實(shí)驗(yàn)

灰樹花不同極性提取物及酶解物對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠血脂水平的影響

實(shí)驗(yàn)方法：

以符合現(xiàn)代人類生活方式（動(dòng)物性食物為主的高脂飲食習(xí)慣）的角度出發(fā)，采用高糖高脂飼料（基礎(chǔ)飼料67%，豬油10%，蔗糖20%，膽固醇3%）建立高脂飲食誘導(dǎo)的糖脂代謝紊亂模型，進(jìn)行為期2個(gè)月的膳食干預(yù)喂養(yǎng)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)7組，包括正常對照組（nfd）、高脂對照組（hfd）、灰樹花95%（v/v）乙醇提取物組（gf95）、灰樹花55%（v/v）乙醇提取物組（gf55）、灰樹花水提取物組（gfwe）、灰樹花水提取物剩余物酶解（gfem）及灰樹花混合物組（gfmx）。給予受試樣品60天后，麻醉已禁食wistar大鼠，在潔凈工作臺中，先通過心尖取血，將血液收集在采血管中，通過自動(dòng)生化分析儀及試劑盒分析血清中總膽固醇(tc)、甘油三脂(tg)、高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)等水平。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與正常對照組比較，高脂對照組小鼠血清中tc、tg和ldl含量不同程度地高于正常對照組，而hdl則明顯低于正常對照組；灰樹花95%乙醇提取物組（gf95）及灰樹花活性物質(zhì)混合物組（gfmx）小鼠血清中tc、tg和ldl-c含量明顯低于高脂對照組，hdl-c含量則高于高脂對照組；灰樹花55%（v/v）乙醇提取物組（gf55）、灰樹花水提取物組（gfwe）、灰樹花水提取物剩余物酶解（gfem）組小鼠血清中tg、tc和ldl-c含量雖不同程度的低于高脂對照組，但不顯著，而hdl-c含量則都明顯高于高脂對照組。由此可得本發(fā)明提供的灰樹花全活性物質(zhì)具有降血脂作用，且其中灰樹花95%（v/v）乙醇提取物及灰樹花活性物質(zhì)混合物的效果較好。