本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可用于制作輔助治療動脈粥樣硬化的保健食品或藥品。

背景技術(shù)：

黑木耳是我國傳統(tǒng)藥食同源的食品，作為我國傳統(tǒng)中醫(yī)中藥文化中的一顆璀璨明珠，一直為歷代醫(yī)家所推崇，我國很早以前就開始將其應用于中藥、藥膳來治療或輔助治療很多疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學研究認為黑木耳具有降壓、調(diào)脂、保肝和改善腎功能等功效，是中醫(yī)藥食療心腦血管疾病、高脂血癥、便秘的代表性食物。

眾所周知，動脈粥樣硬化(as)是一組稱為動脈硬化的血管病中最常見、最重要的一種，其特點是動脈血管壁平滑肌細胞異常增殖導致管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小，由于在動脈內(nèi)膜上積聚的脂質(zhì)外觀呈黃色粥樣，因此稱為動脈粥樣硬化。近年來，動脈粥樣硬化的發(fā)病率逐年升高，導致以動脈粥樣硬化為主要病理基礎(chǔ)的多種心血管疾病逐漸成為人類死亡的主要原因之一，因此早期預防和合理治療動脈粥樣硬化將大大降低冠心病等心血管疾病的發(fā)病率。目前臨床上常用的抗動脈粥樣硬化藥物主要為他汀類和貝特類調(diào)血脂藥物，但它們主要用于冠心病的早期治療，且有一定的副作用，積極開發(fā)安全有效輔助治療動脈粥樣硬化的保健食品或藥品具有重要意義。

目前國內(nèi)外專家對黑木耳用于制備輔助治療動脈粥樣硬化的保健食品或藥品也已有發(fā)明專利，如：(1)一種抗動脈粥樣硬化的藥物組合物及其應用(專利申請?zhí)?201510281712.x)；(2)動脈粥樣硬化醫(yī)學配方食品(專利申請?zhí)枺?01610233650.x)；(3)動脈粥樣硬化全營養(yǎng)配方食品(專利申請?zhí)枺?01410405596.3)。與以上專利相比，本專利的不同之處在功效成分是黑木耳木酚素提取物，是一種新型主要功能是抑制平滑肌細胞異常增殖的保健類藥物成分，而前面的三個專利都是用黑木耳菌體做為原料進行組方，以達到抗動脈粥樣硬化的效果。對木酚素用于保健食品或藥品也已有發(fā)明專利，如：(1)一種以木酚素為主的防治腫瘤及三高病癥的營養(yǎng)強化劑(專利申請?zhí)枺?01310221034.9)；(2)木酚素類化合物的新用途(專利申請?zhí)枺?00680010424.x)；(3)木酚素類化合物用于治療或預防炎癥性疾病的用途(200680001988.7)。與以上專利相比，本專利的不同之處在黑木耳木酚素提取物是抑制平滑肌細胞的異常增殖，而前面的三個專利都是分別用木酚素研究其防治腫瘤、抗氧化、抑制炎癥等效果，而沒有研究其抑制平滑肌細胞異常增殖的作用，本發(fā)明者除考察了其有效性外，發(fā)現(xiàn)此黑木耳提取物有較高安全性。故本發(fā)明具有經(jīng)濟、可開發(fā)的可行性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一種具有抑制平滑肌細胞異常增殖作用的黑木耳木酚素提取物及其在制備抗動脈粥樣硬化藥物及保健食品中的應用。

該黑木耳木酚素提取物對動脈血管平滑肌細胞異常增殖具有顯著抑制效果。

該黑木耳木酚素提取物由以下方法制備得到:黑木耳經(jīng)機械粉碎，過篩，用15-20倍黑木耳重量的60％乙酸乙酯溶液進行熱回流提取，熱回流溫度為60-80℃，提取2-3次，每次1.5-2.5h，合并提取液，抽濾，取上清液，減壓回收溶劑，即得黑木耳木酚素粗提取物濃縮液；用洗脫劑溶解黑木耳木酚素粗提取物濃縮液，離心過濾除去雜質(zhì)，溶液定容至黑木耳木酚素粗提取物濃縮液的質(zhì)量濃度為0.1g/ml，然后進行柱色譜分離，以200-300目硅膠為固定相，二氯甲烷-乙酸乙酯為柱層析洗脫劑(體積比97:3)，流速2.0ml/min，進樣量6ml(質(zhì)量濃度0.1g/ml)，得到黑木耳木酚素提取物。其純度達91.12％，回收率為81.95％。

所述用于溶解黑木耳木酚素粗提取物濃縮液的洗脫劑為二氯甲烷-乙酸乙酯(體積比97:3)。

該黑木耳木酚素提取物含有的有效成分是木酚素，其純度達91.12％。

本發(fā)明所述黑木耳木酚素提取物可按常規(guī)工藝制成抗動脈粥樣硬化保健食品及藥品，包括膠囊、片劑、顆粒劑、酒劑、口服液等常規(guī)劑型。

附圖說明

圖1是在20％濃度的含藥血清干預下，培養(yǎng)時間為24h時，丹參酮與黑木耳木酚素提取物對ox-ldl誘導的血管平滑肌細胞異常增殖的影響示意圖。a：丹參酮組；b：黑木耳木酚素提取物組；k：空白對照組；m：模型對照組。其中，與model組相比，*p<0.05，#p<0.01。

圖2是在20％濃度的含藥血清干預下，培養(yǎng)時間為48h時，丹參酮與黑木耳木酚素提取物對ox-ldl誘導的血管平滑肌細胞異常增殖的影響示意圖。a：丹參酮組；b：黑木耳木酚素提取物組；k：空白對照組；m：模型對照組。其中，與model組相比，*p<0.05，#p<0.01。

圖3是在20％濃度的含藥血清干預下，培養(yǎng)時間為24h時，丹參酮與黑木耳木酚素提取物對ox-ldl誘導的血管平滑肌細胞異常增殖的影響示意圖。a：丹參酮組；b：黑木耳木酚素提取物組；k：空白對照組；m：模型對照組。其中，與model組相比，*p<0.05，#p<0.01。

具體實施方式

下面詳細說明本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。

本發(fā)明公布了作為黑木耳木酚素提取物作為抑制平滑肌細胞異常增殖藥物的制備方法和藥效試驗。制備方法采用了兩個實施例；采用血清藥理學實驗，通過血管平滑肌細胞的體外細胞培養(yǎng)模型，研究了黑木耳木酚素提取物對抑制血管平滑肌細胞異常增生能力證明其藥效。

本發(fā)明的制備方法如下:

實施例一:

黑木耳經(jīng)機械粉碎，過篩，用15倍黑木耳重量的60％乙酸乙酯溶液進行熱回流提取，熱回流溫度為：65℃，提取3次，每次1.5h，合并提取液，抽濾，取上清液，減壓回收溶劑，即得黑木耳木酚素粗提取物濃縮液。用洗脫劑溶解黑木耳木酚素粗提取物濃縮液，離心過濾除去雜質(zhì)，溶液定容至黑木耳木酚素粗提取物濃縮液質(zhì)量濃度為0.1g/ml，然后進行柱色譜分離，以200目硅膠為固定相，二氯甲烷-乙酸乙酯為柱層析洗脫劑(體積比97:3)，流速2.0ml/min，進樣量6ml(質(zhì)量濃度0.1g/ml)，得到黑木耳木酚素提取物。

實施例二:

黑木耳經(jīng)機械粉碎，過篩，用20倍黑木耳重量的60％乙酸乙酯溶液進行熱回流提取，熱回流溫度為：75℃，提取2次，每次2.5h，合并提取液，抽濾，取上清液，減壓回收溶劑，即得黑木耳木酚素粗提取物濃縮液。用洗脫劑溶解黑木耳木酚素粗提取物濃縮液，離心過濾除去雜質(zhì)，溶液定容至黑木耳木酚素粗提取物濃縮液質(zhì)量濃度為0.1g/ml，然后進行柱色譜分離，以300目硅膠為固定相，二氯甲烷-乙酸乙酯為柱層析洗脫劑(體積比97:3)，流速2.0ml/min，進樣量6ml(質(zhì)量濃度0.1g/ml)，得到黑木耳木酚素提取物。

抑制平滑肌細胞異常增殖藥效試驗如下:

實施例三:

含黑木耳木酚素提取物的血清對ox-ldl誘導兔胸主動脈平滑肌細胞異常增殖具有顯著抑制作用。

1實驗材料與儀器

1.1動物

清潔級雄性sd大鼠，36只，體重190士10g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號scxk(湘)2011-0003。

1.2試劑

普通飼料(江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司)；兔胸主動脈血管平滑肌細胞(中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心)，氧化型低密度脂蛋白(ox-ldl)(中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心)，丹參酮(昆明科翔生物科技有公司)，dmem粉劑(高糖)，胎牛血清，青霉素鏈霉素溶液，(均購于美國gibco公司)，二甲基亞砜(dmso)，mtt，胰蛋白酶，一氧化氮(no)試劑盒(均購于美國sigma化學公司)。

1.3儀器

xdos-1b倒置生物顯微鏡(重慶光電有限公司)；sw-cj-2fd雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；37℃co2培養(yǎng)箱(日本sanyo公司)；multiskanmk3型自動酶標分析儀(美國thermo公司)；wmv-1000微視攝像頭系統(tǒng)(北京微視新紀元科技公司)。

2實驗方法

2.1含藥血清的制備

為了觀察丹參酮、黑木耳木酚素提取物抗動脈粥樣硬化的藥理作用，將sd大鼠共分為3組，每組2只，即：空白對照組(control)、丹參酮(aap)、黑木耳木酚素提取物組(aae)。各組自由進食普通飼料。各組灌胃處理情況如下：丹參酮組灌胃量為300mg/kgb.w.，黑木耳木酚素提取物組(實施例1)灌胃量為200mg/kgb.w.，每日灌胃兩次，早晚各一次，空白對照組每日灌胃同體積蒸餾水。灌胃7天，在最后一次灌胃后一小時，立即在無菌條件下進行腹部大動脈采血，血樣于37℃水浴15min，3000r/min離心10min，取得血清，然后于56℃水浴30min進行滅活。最后將血清分裝，凍存?zhèn)溆?，用前?jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。2.2兔胸主動脈血管平滑肌細胞的復蘇與培養(yǎng)

2.2.1細胞復蘇

(1)將恒溫水浴鍋調(diào)至37-40℃的溫水；

(2)從液氮中取出凍存小管，用鑷子夾住凍存管的蓋于37-40℃的溫水中快速晃動，直至凍存液完全融解。要在1-2min中完成復溫；

(3)將細胞凍存懸液移入離心管，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹勻；

(4)將細胞懸液經(jīng)800-1000r/min離心5min，棄去上清；

(5)給細胞沉淀物加入含20％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，輕輕吹吸均勻。將細胞懸液移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加足培養(yǎng)液至4ml左右，放入5％co2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

2.2.2細胞傳代培養(yǎng)

(1)從細胞生長至融合形成致密單層細胞時即可傳代培養(yǎng)；

(2)傳代時，首先傾去培養(yǎng)液，以pbs溶液輕輕沖洗瓶壁上的細胞2次；

(3)加入0.25％胰蛋白酶溶液約1.5ml，覆蓋細胞表面即可。在室溫下作用4-5min，并用倒置顯微鏡觀察，可見大部分細胞收縮，邊緣清楚，此時立即加入含20％的胎牛血清培養(yǎng)基，終止胰蛋白酶活性，停止消化并棄去懸液；

(4)加入3ml含20％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，用彎頭吸管吹打分散細胞，制成細胞懸液；

(5)然后將培養(yǎng)液平均分配于3個25ml培養(yǎng)瓶中，即進行“一傳三”傳代，最后將每個培養(yǎng)瓶中各加3-4ml完全培養(yǎng)培養(yǎng)基，放入5％co2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。測定指標

棄去培養(yǎng)液，每孔加入20μl0.5mg/ml的mtt溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加150μldmso(二甲基亞楓)，振蕩10min；在570nm波長下進行比色，在酶標儀上測定各孔吸光度值。

2.3統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均用spss13.0統(tǒng)計軟件進行處理，用單因素方差分析anova(one-wayanalysisofvariance)，以duncans多種比較檢驗(duncansmultiplerangetests)。

分析實驗結(jié)果以均值±標準偏差(mean±sd)表示，采用組間t檢驗，p<0.05具有顯著性差異，p<0.01具有極顯著性差異。

3實驗結(jié)果

3.1丹參酮及黑木耳木酚素提取物對兔胸主動脈血管平滑肌細胞增生的抑制作用

通過mtt法測定吸光值(od值)，可反映細胞生長及增殖活性，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，mtt結(jié)晶物形成的量與活細胞數(shù)成正比，即吸光值越高增殖活性越強。實驗結(jié)果顯示：在20％濃度的含藥血清干預下，丹參酮組在作用48h及72h后對vsmc增殖才表現(xiàn)出顯著抑制作用(p<0.05)，而黑木耳木酚素提取物組，在作用24h后就對vsmc增殖已經(jīng)具有顯著抑制作用(p<0.05)，當作用時間達48h及72h時對vsmc增殖具有極顯著抑制作用(p<0.01)。從試驗結(jié)果中我們可以發(fā)現(xiàn)，丹參酮只有在高濃度長時間的作用下才對血管平滑肌細胞異常增殖具有顯著抑制效果(p<0.05)，而黑木耳木酚素提取物在中等濃度，較短時間內(nèi)就對血管平滑肌細胞異常增殖具有顯著抑制效果(p<0.05)，當黑木耳木酚素提取物在高濃度下，在短時間內(nèi)對血管平滑肌細胞異常增殖具有極顯著抑制效果(p<0.01)。這說明了黑木耳木酚素提取物具有比丹參酮更強的抑制血管平滑肌細胞異常增殖的功能作用。

綜上說明：黑木耳木酚素提取物具有抑制平滑肌細胞異常增殖的作用。在抑制動脈粥樣硬化方面有很大的開發(fā)空間，可開發(fā)為抗動脈粥樣硬化的保健品及藥品等。