本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，涉及一種中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹，屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)，甲殼綱(Cmstacea)，十足目(Decapoda)，弓蟹科(Varunidae)，絨螯蟹屬(Eriocheir)，是一種肉質(zhì)鮮美的特種水產(chǎn)品，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值，在江蘇水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中更是占了舉足輕重的地位——2015年江蘇河蟹養(yǎng)殖面積達(dá)到263.99千公頃，產(chǎn)量達(dá)到了364534噸，占了全國產(chǎn)量的45％。然而，隨著現(xiàn)代化養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，河蟹在集約化養(yǎng)殖過程中，一是養(yǎng)殖水環(huán)境日益惡化；二是病害問題日益凸顯，尤其是近年來河蟹“水癟子”(患病河蟹肝胰腺發(fā)白、發(fā)灰，糜爛、萎縮、壞死，導(dǎo)致河蟹干癟、殼內(nèi)積水無肉)呈現(xiàn)發(fā)病面積、發(fā)病率增多的趨勢，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，江蘇興化地區(qū)2015年約有80％以上蟹塘發(fā)病，患病河蟹達(dá)到30％～40％，嚴(yán)重影響了漁民的經(jīng)濟(jì)效益，制約了河蟹產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展；三是河蟹極易受到飼養(yǎng)密度、水質(zhì)變化和投喂管理等方面因素影響而產(chǎn)生應(yīng)激，其中運(yùn)輸應(yīng)激就是養(yǎng)殖到銷售環(huán)節(jié)之間(尤其是高溫期間)一種較為常見的氧化應(yīng)激反應(yīng)；當(dāng)應(yīng)激強(qiáng)度過強(qiáng)或時間過長時，機(jī)體會產(chǎn)生大量的自由基，抗氧化水平下降，破壞氧化-抗氧化平衡，從而免疫力下降、機(jī)體受損。由上述可見，保護(hù)肝胰腺健康，提高河蟹自身免疫力，增強(qiáng)抗應(yīng)激性能，對于河蟹產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要。

鑒于傳統(tǒng)的抗菌藥物、抗生素等具有引起病原菌耐藥性、高殘留、用量大等缺點(diǎn)，促使越來越多的科研人員將目光投向抗菌藥物替代品的研究。

目前已有一些關(guān)于果寡糖、乳酸菌、芽孢桿菌以及酵母菌等作為添加劑在水產(chǎn)飼料中的使用，但是有關(guān)這幾者之間的配伍使用，還未見報(bào)道。同時，由于甲殼動物缺乏特異性免疫，所以對其免疫動能的研究主要集中在非特異性免疫、抗氧化能力方面。此外，眾多研究表明，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶常被用作評價肝臟健康指標(biāo)；溶菌酶是重要的非特異性免疫因子；皮質(zhì)醇、血糖可以反應(yīng)魚類應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)弱，是應(yīng)激反應(yīng)的敏感指標(biāo)；此外，超氧化物氣化酶、過氧化氫酶等是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要組成成分。因此，通過對中華絨螯蟹幼蟹血淋巴相關(guān)生化指標(biāo)、肝胰腺抗氧化指標(biāo)及運(yùn)輸應(yīng)激后成活率情況的研究，研制一種針對中華絨螯蟹幼蟹的安全、高效抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑，為新形勢下進(jìn)一步完善其飼料配方提供科學(xué)依據(jù)，對中華絨螯蟹綠色健康養(yǎng)殖和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。

本發(fā)明的另一目的是提供該中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑的制備方法。

本發(fā)明的又一目的是提供該中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)組合物，由以下組分組成：果寡糖55～75重量份，乳酸菌10～25重量份，芽孢桿菌8～20重量份，酵母菌5～15重量份。

所述的組合物優(yōu)選由以下組分組成：果寡糖65～75重量份，乳酸菌12～20重量份，芽孢桿菌8～15重量份，酵母菌5～10重量份。

本發(fā)明所述的抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)組合物在制備中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激和/或提高免疫力的制劑中的應(yīng)用。

一種中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑，含有本發(fā)明所述的抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。

所述的抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑優(yōu)選通過以下方法制備得到：將本發(fā)明所述的組合物各組分分別經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎，然后過120目的篩網(wǎng)，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機(jī)內(nèi)充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，即制成所述的抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。

本發(fā)明所述的中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑的制備方法，將本發(fā)明所述的組合物各組分分別經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎，然后過120目的篩網(wǎng)，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機(jī)內(nèi)充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，即制成所述的抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。

本發(fā)明所述的中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑在制備中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)飼料中的應(yīng)用。

所述的中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)飼料是將所述的抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)組合物按照0.5wt％～1wt％的量添加到常規(guī)中華絨螯蟹飼料中所得。

有益效果：

本發(fā)明針對中華絨螯蟹幼蟹的特性，從甲殼動物的免疫機(jī)理和應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制出發(fā)，結(jié)合前期在其它甲殼動物試驗(yàn)研究，篩選出果寡糖、乳酸菌、芽孢桿菌以及酵母菌，并將其按照特定配比復(fù)配，一是利用果寡糖、乳酸菌、芽孢桿菌保護(hù)機(jī)體、提高機(jī)體抗應(yīng)激能力的功能；二是利用果寡糖、酵母菌的抗氧化功能，提高機(jī)體的抗氧化能力，保護(hù)肝胰腺，降低“水癟子”病發(fā)概率；三是利用果寡糖具有與乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌這三種益生菌一樣的抑制有害菌繁殖、改善腸道菌群平衡、促生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能，各組分相輔相成，克服了單一組分可能存在的不足之處，高效安全。四種組分復(fù)配，得到抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)組合物，并在此基礎(chǔ)上制備得到中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。此抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑有助于提高蟹肝胰腺抗氧化能力，清除體內(nèi)自由基，同時提高機(jī)體的免疫力和抗應(yīng)激能力，促使幼蟹健康生長。

本發(fā)明各組分來源穩(wěn)定，取材廣泛，制備簡單，性價比高。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

取果寡糖70重量份、乳酸菌13重量份、芽孢桿菌10重量份、酵母菌7重量份；將上述各組分經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎，過120目的篩網(wǎng)，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機(jī)內(nèi)充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。

實(shí)施例2

生長試驗(yàn)：中華絨螯蟹由江蘇省淡水水產(chǎn)研究所浦口基地提供。試驗(yàn)選擇健康、規(guī)格和重量基本一致的幼蟹(初均體重：9.91±0.05g)。隨機(jī)分組，設(shè)有對照組A(投喂基礎(chǔ)日糧)、對照組B(在基礎(chǔ)日糧中添加1.0％果寡糖)、對照組C(在基礎(chǔ)日糧中添加0.2％酵母菌+0.2％芽孢桿菌+0.1％酵母菌)和試驗(yàn)組(在基礎(chǔ)日糧中添加0.7％實(shí)施例1制備的抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑)，每組設(shè)3個平行試驗(yàn)，每平行組75只試驗(yàn)蟹。共12個水泥池(4m×4m×2m)。蟹馴化7天后投喂各組飼料70天，測定其生長、免疫相關(guān)指標(biāo)。

基礎(chǔ)日糧：河蟹飼料(粗蛋白38％，粗脂肪5.2％，粗纖維6.9％，粗灰分17.8％，總磷1.2％，賴氨酸2.1％)。

其中，所使用的酵母菌、芽孢桿菌來源沒有特殊限制，乳酸菌為高溫乳酸菌。市售可飼料用的酵母菌、芽孢桿菌、高溫乳酸菌均適宜使用于本發(fā)明，如江蘇易實(shí)生物科技有限公司生產(chǎn)的酵母菌、芽孢桿菌，思科福(北京)生物科技有限公司生產(chǎn)的高溫乳酸菌等。

表1

*增重率％＝(平均終體重-平均初體重)/平均初體重*100

結(jié)果表明：與對照組A相比，抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑組顯著提高了：增重率25.92％、溶菌酶水平38.58％、超氧化物氣化酶水平12.67％、過氧化氫酶水平68.41％(P<0.05)；顯著降低了餌料系數(shù)26.80％、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平30.03％、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平14.66％(P<0.05)。與對照組B相比，抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑組顯著提高了：增重率17.48％(P<0.05)；顯著降低了餌料系數(shù)18.25％、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平10.78％(P<0.05)。與對照組C相比，抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑組顯著提高了增重率13.57％、溶菌酶水平38.58、過氧化氫酶水平21.54％(P<0.05)；顯著降低了餌料系數(shù)13.85％、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平40.00％、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平9.37％。因此，本發(fā)明抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑的添加較之各對照組能顯著促進(jìn)中華絨螯蟹幼蟹的生長，提高蟹機(jī)體的免疫力和抗氧化能力；同時還起到保護(hù)肝臟的作用。

運(yùn)輸應(yīng)激試驗(yàn)：生長試驗(yàn)70天后，禁食24小時，再挑選規(guī)格一致的蟹，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)15只裝在一個網(wǎng)兜里，試驗(yàn)采用無水運(yùn)輸，運(yùn)輸時間為3h(鎮(zhèn)江——南京)；達(dá)到南京后，將蟹放置養(yǎng)殖箱(容積為160L，水深20cm)中觀察其生理活動，并統(tǒng)計(jì)各組蟹0d、1d、2d、3d的累積死亡率.

表2

結(jié)果表明：中華絨螯蟹幼蟹在運(yùn)輸應(yīng)激后，蟹的活力開始下降，對外界反應(yīng)能力減弱。由表3可見，與對照組A相比，抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑組死亡率在1d、2d、3d分別顯著降低了60.07％、41.94％、45.65％(P<0.05)；與對照組B相比，抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑組死亡率在2d、3d分別顯著降低了18.18％、19.35％(P<0.05)；與對照組C相比，抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑組死亡率在2d、3d分別顯著降低了35.71％、30.55％(P<0.05)。因此，該抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑能提高中華絨螯蟹幼蟹抗應(yīng)激的能力，減少由應(yīng)激造成的死亡。

實(shí)施例3

取果寡糖65重量份、乳酸菌20重量份、芽孢桿菌10重量份、酵母菌5重量份；將上述各組分經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎，過120目的篩網(wǎng)，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機(jī)內(nèi)充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。

實(shí)施例4

取果寡糖65重量份、乳酸菌12重量份、芽孢桿菌15重量份、酵母菌8重量份；將上述各組分經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎，過120目的篩網(wǎng)，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機(jī)內(nèi)充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。

實(shí)施例5

取果寡糖66重量份、乳酸菌17重量份、芽孢桿菌11重量份、酵母菌6重量份；將上述各組分經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎，過120目的篩網(wǎng)，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機(jī)內(nèi)充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。

實(shí)施例6

取果寡糖68重量份、乳酸菌13重量份、芽孢桿菌12重量份、酵母菌7重量份；將上述各組分經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎，過120目的篩網(wǎng)，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機(jī)內(nèi)充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。

實(shí)施例7

取果寡糖70重量份、乳酸菌12重量份、芽孢桿菌8重量份、酵母菌10重量份；將上述各組分經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎，過120目的篩網(wǎng)，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機(jī)內(nèi)充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。

實(shí)施例8

取果寡糖73重量份、乳酸菌12重量份、芽孢桿菌7重量份、酵母菌8重量份；將上述各組分經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎，過120目的篩網(wǎng)，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機(jī)內(nèi)充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。

實(shí)施例9

取果寡糖75重量份、乳酸菌12重量份、芽孢桿菌8重量份、酵母菌5重量份；將上述各組分經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎，過120目的篩網(wǎng)，先將乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌于混合機(jī)內(nèi)充分混勻后，再將果寡糖與上述混合物混勻，制成抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。

實(shí)施例10

按照實(shí)施例2中的生長試驗(yàn)和應(yīng)激試驗(yàn)方法，分別測定投喂含實(shí)施例3～9中制備的抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑的蟹的生長、免疫等指標(biāo)以及應(yīng)激后2d成活率。對照組投喂基礎(chǔ)日糧，各試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.7％實(shí)施例3～9制備的抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。結(jié)果見表4和表5。

表3

*平均增重率％＝(平均終體重-平均初體重)/平均初體重*100

表4

表3和4中的實(shí)驗(yàn)組A～G分別對應(yīng)實(shí)施例3～9制備的抗應(yīng)激免疫增強(qiáng)劑。