本發(fā)明涉及飼料及畜禽養(yǎng)殖領域，具體地涉及一種新型飼料防霉劑脫氫醋酸鈉預混劑的研制及其防霉應用。

背景技術(shù)：

脫氫醋酸鈉又稱脫氫乙酸鈉(sodiumdehydroacetate，簡稱na-dha)，化學名為6-甲基-3-乙?；?2，4-吡喃二酮鈉，casno.4418-26-2，分子式為c8h7nao4.h2o。脫氫醋酸鈉對細菌、酵母菌、霉菌等多種微生物具有廣譜的抗菌抑菌作用^[1]，是繼苯甲酸鈉、尼泊金酯、和山梨酸鉀之后的一種替代型化學防腐劑。脫氫醋酸鈉是聯(lián)合國糧農(nóng)組織(fao)和世界衛(wèi)生組織(who)下食品聯(lián)合專家委員會(jecfa)許可在食品中使用的一種新型安全防腐保鮮添加劑。目前被廣泛應用于食品、飼料及保健品等相關(guān)領域。我國《食品添加劑使用標準》(gb2760-2011)規(guī)定脫氫醋酸及其鈉鹽在黃油和濃縮黃油、腌漬的蔬菜、腌漬的食用菌和藻類、發(fā)酵豆制品及果蔬汁(漿)中的最大使用量為0.3g/kg；淀粉制品的最大使用量為1.0g/kg；在面包、糕點、焙烤食品餡料及表面用掛漿、預制肉制品、熟肉制品、復合調(diào)味料中的最大使用量為0.5g/kg。在日本，脫氫醋酸鈉作為食品防腐劑，在奶酪、黃油及人造黃油中的添加濃度為0.5g/kg。fda允許脫氫醋酸鈉作為防霉劑用于破損或剝皮食品的涂抹，根據(jù)規(guī)定脫氫醋酸鈉在處理食品中的殘留不得超過65mg/kg(21cfr172.130)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種飼料防霉劑及其制備方法與應用，本發(fā)明可有效地防止飼料霉變、防霉期達2月以上；經(jīng)過高溫、高濕、強光和長期試驗，制劑穩(wěn)定性良好。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種飼料防霉劑，包括以下重量百分比的各組分：脫氫醋酸鈉10％，輕質(zhì)碳酸鈣90％。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種飼料防霉劑的制備方法，其特征是，將所述重量百分比的脫氫醋酸鈉、輕質(zhì)碳酸鈣充分攪拌混勻，制得10％脫氫醋酸鈉預混劑。

優(yōu)選的，所述攪拌混勻時間為10min/2kg。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種飼料防霉劑的應用，將所述飼料防霉劑添加于飼料中，飼料防霉劑的有效添加量為0.02～0.08％脫氫醋酸鈉。

優(yōu)選的，所述飼料防霉劑的推薦添加量為0.02％脫氫醋酸鈉。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

第一，本發(fā)明研制了一種飼料防霉劑―10％脫氫醋酸鈉預混劑，處方如下：脫氫醋酸鈉100g，輕質(zhì)碳酸鈣900g。經(jīng)充分攪拌混勻后，制得10％脫氫醋酸鈉預混劑。經(jīng)產(chǎn)品質(zhì)量考察、防霉有效性、制劑穩(wěn)定性試驗，表明本發(fā)明的預混劑質(zhì)量可靠、制劑性質(zhì)穩(wěn)定，具有較好的防霉作用和對動物的安全性。

第二，本發(fā)明通過比較基質(zhì)的流動性、容重、粒度、吸濕性及價格篩選預混劑的基質(zhì)，選擇輕質(zhì)碳酸鈣為基質(zhì)，確定了10％脫氫醋酸鈉預混劑的處方。通過建立脫氫醋酸鈉分光光度法含量測定方法，比較攪拌速度、攪拌時間及含量均勻度，確定預混劑生產(chǎn)的基本工藝。通過防霉推薦量試驗、防霉常規(guī)試驗、強化防霉試驗等評價制劑的防霉有效性、防霉期時間和制劑的穩(wěn)定性。

第三，本發(fā)明的10％脫氫醋酸鈉預混劑，以0.2％(相當于0.02％脫氫醋酸鈉)添加于飼料中，可有效地防止飼料霉變、防霉期達2月以上；經(jīng)過高溫、高濕、強光和長期試驗，制劑穩(wěn)定性良好。

第四，脫氫醋酸鈉的抗菌防腐作用除了廣泛應用于食品、農(nóng)產(chǎn)品等保鮮、防腐外，添加于飼料或青貯飼料中對多種微生物如真菌屬、葡萄菌屬、念珠菌屬、青霉屬和黃曲霉菌屬等均有較好的抑制作用。在飼料中添加0.08％脫氫醋酸鈉時，對霉菌具有良好的抑菌效果。在青貯飼料中0.2％脫氫醋酸鈉可降低病原菌的生長。脫氫醋酸鈉在弱酸性條件下，對從霉變的雞飼料中分離出的6種霉菌表現(xiàn)出最佳的防霉效果，中性條件下次之，堿性條件下最差。當ph＝4.5時，脫氫醋酸鈉對飼料中6種混合霉菌、黃曲霉菌、煙曲霉菌的最低抑菌濃度為70mg/kg，對枯青霉菌、島青霉菌、串珠鐮刀菌、禾谷鐮刀菌為80mg/kg；當ph＝5.5時，脫氫醋酸鈉的mic為80mg/kg；當ph＝7.0時，其mic為130mg/kg；但ph＝7.5時，其mic為140mg/kg。較苯甲酸鈉(ph≤4)和山梨酸鉀(ph≤7)的有效ph范圍廣。而且經(jīng)過121℃高溫處理30min，其防霉效果也未發(fā)生變化，可應用于顆粒飼料的生產(chǎn)。

附圖說明

圖1是紫外分光光度法測定脫氫醋酸鈉的標準曲線圖；

圖2是脫氫醋酸鈉預混劑常規(guī)防霉試驗結(jié)果圖；

圖3是脫氫醋酸鈉預混劑強化防霉試驗結(jié)果圖；

圖4是脫氫醋酸鈉預混劑防霉期試驗結(jié)果圖。

具體實施方式

1、預混劑的處方及工藝篩選

1.1基質(zhì)的選擇

主要以基質(zhì)的流動性、容重、粒度、吸濕性為評價指標進行基質(zhì)的篩選。

1.1.1流動性

休止角是表示粉體學流動性的最常用的方法之一。本試驗采用固定圓錐底法，將顆粒放置在固定于表面皿的中心位置的三個串聯(lián)漏斗內(nèi)，使其自由下流，直至顆粒堆積到不再下流為止，測定顆粒堆積高度(h)，及錐體地面半徑(r)，tanθ＝h/r，θ即為休止角。適度的流動性(又稱流散性)以靜止角在40°～60°為宜。

1.1.2容重

容重是指單位容積內(nèi)物料的重量，本試驗中釆取的測量方法如下：

首先取一個500ml的量杯，稱重，記為m0。將預混料載體樣品混合均勻后采用四分法取樣，輕且仔細地裝入500ml量杯中，直到裝滿為止，以直尺為刮板調(diào)整容積，使得樣品與量杯口平齊，再稱量并記錄量杯和樣品的總質(zhì)量，如此反復進行三次得到m1、m2、m3，取均值。

將量杯洗凈瞭干，裝入蒸餾水，直到液面與量杯口平齊為止，稱量并記錄量杯和水的總質(zhì)量，如此反復進行三次，得到三個質(zhì)量mw1、mw2，mw3取均值為mw。

預混料載體容重：

載體容重與脫氫乙酸鈉容重的差值：

r差＝|rdha-s-r|

1.1.3粒度

采用雙篩分法，取不能通過小號篩(100目)和能通過大號篩(65目)的顆粒及粉末，稱定重量，以收率反映其所占比例(％)。

1.1.4基質(zhì)的吸濕性

基質(zhì)的水分宜控制在合適的水平?；|(zhì)的吸濕性測定如下：取供試品，按《中國獸藥典》2010版附錄中干燥失重測定法檢查，在105℃干燥至衡重，減失重量無機基質(zhì)不得超過3.0％，有機基質(zhì)不得超過8.0％。

1.1.5處方篩選結(jié)果

基質(zhì)的流動性、粒度及吸濕性數(shù)據(jù)見表1。由表可看出，載體流動性均良好，依次為豆粕、麥麩、輕質(zhì)碳酸鈣、碳酸鈣、淀粉。脫氫乙酸鈉可全部通過四號篩，能通過六號篩的不超過10％，收率為94％±1.32％。輕質(zhì)碳酸鈣與脫氫乙酸鈉粒度相近。含水量檢測中無機基質(zhì)(輕質(zhì)碳酸鈣、碳酸鈣)未超過3.0％，有機基質(zhì)(麥麩、豆粕、淀粉)均超過8.0％；載體成本大小依次為：碳酸鈣、麥麩、輕質(zhì)碳酸鈣、淀粉、豆粕。

表1不同基質(zhì)的流動性、水分及成本估算(n＝3,)

表2為不同載體的容重數(shù)據(jù)?？梢钥闯觯d體容重大小依次為：碳酸鈣、豆粕、輕質(zhì)碳酸鈣、淀粉、麥麩；脫氫醋酸鈉的容重與淀粉較接近，其次是輕質(zhì)碳酸鈣、豆粕與麥麩。

綜合考慮基質(zhì)的流動性、粒度、水分、容重和價格，選擇基質(zhì)材料為輕質(zhì)碳酸鈣。

表2不同基質(zhì)的容重

1.2混合

1.2.1儀器與材料

vh10型實驗混合機(廣州市旭朗機械設備有限公司)；最佳裝量2kg；最大裝量3kg；混合轉(zhuǎn)速24r/min。

uv-2600型紫外-可見光分光光度計、bp110s電子分析天平，德國賽多利斯天平公司。

脫氫醋酸鈉(純度為99.8％)，由江蘇天成動物保健品公司提供。

1.2.2試驗方案

采用單因子分組試驗，取脫氫醋酸鈉與輕質(zhì)碳酸鈣按照1：9分別制成1kg、2kg和3kg裝量的預混料進行混合?；旌蠒r間分4個處理組(5、10、15、20min)，每個處理分別做3組重復。每批預混料按不同位置及深度取6個樣品，取樣的時候充分考慮各方位、深度，取樣時不允許有任何翻動或混合。每個樣品的采樣數(shù)量約為5g，取出的樣品裝入密封袋內(nèi)，并編號。樣品及時進行含量測定，以每個處理的6個樣品含量測定的變異系數(shù)評價混合的均勻度。

1.2.3混合工藝篩選結(jié)果

v型混合機不同混合時間及裝量混合時，含量測定的變異系數(shù)及顯著性差異見表3?？梢钥闯?，v型混合時間為10min時，對不同裝量及同一裝量時的混合均勻度為最好。

表3v型混合器混合時間、裝量對混合均勻性的影響

注：同列中不同字母表示差異顯著，p<0.05；相同字母差異不顯著，p﹥0.05。

2脫氫醋酸鈉預混劑的質(zhì)量研究

預混劑應混合均勻、色澤一致、流動性好、干燥松散、易與飼料混合。除另有要求外，預混劑應進行以下檢查。

2.1外觀均勻度、水分及裝量差異

分別參照《中華人民共和國獸藥典》2010年版一部附錄外觀均勻度檢查、水分測定法及最低裝量檢查法進行檢查。本品三個批次檢查結(jié)果見表4。

表4脫氫醋酸鈉預混劑的外觀均勻度、水分和裝量檢查結(jié)果

2.2含量測定

脫氫醋酸鈉預混劑含量測定方法采用紫外分光光度法。

2.2.1材料和儀器

uv-2600型紫外-可見光分光光度計，上海精密儀器有限公司。

脫氫乙酸鈉標準儲備液(1.00mg/ml)：準確稱取0.1010g脫氫乙酸鈉(99.0％)，用純水溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，并定容至刻度。

脫氫乙酸鈉標準使用液(0.10mg/ml)：準確移取標準儲備液10.00ml于100ml容量瓶中，用水定容至刻度。

2.2.2脫氫乙酸鈉標準曲線的建立

取標準使用液適量，稀釋為濃度為0.00，0.20，0.50，2.00，5.00，10.00，20mg/l的標準系列，293nm波長處測定吸光值。以脫氫乙酸鈉濃度(mg/l)為自變量(c)，相應各濃度水平的吸光度為應變量(a)，作線性回歸，得出標準曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，并繪制標準曲線。

圖1為分光光度法測定脫氫醋酸鈉的標準曲線，在0.00，0.20，0.50，2.00，5.00，10.00，20mg/l系列濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為r²＝0.9999，擬合曲線方程為y＝0.08822x-0.0017，y為od，x為脫氫乙酸鈉濃度mg/l。

2.2.3回收率與精密度

以輕質(zhì)碳酸鈣為基質(zhì)，分別制得含脫氫醋酸鈉0.625％，6.25％，25％的三個空白添加預混劑樣品。以輕質(zhì)碳酸鈣為空白對照樣品。

取空白添加樣品各0.4g，用適量純水使其溶解，轉(zhuǎn)移至500ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；過濾后精密量取2.5ml，置25ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；分別制得0.5、5.0、25mg/l的溶液。以水為對照，在293nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算含量和回收率。每個濃度5個重復，分別在同一天或連續(xù)三天進行批內(nèi)、批間精密度試驗。

式中：c為從標準曲線中計算而得測定吸光度時溶液中脫氫醋酸鈉的濃度，mg/l；w為樣品量，g。

表5為分光光度法測定脫氫醋酸鈉的回收率與精密度。回收率在101.99～102.05％，批內(nèi)批間精密度均小于3％。

表5分光光度法測定預混劑中脫氫醋酸鈉的回收率與精密度

2.2.4樣品含量測定

取脫氫醋酸鈉預混劑樣品0.4g，用適量水溶解后，轉(zhuǎn)移至500ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；過濾后精密量取2.5ml，置25ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。以水為對照，在293nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算含量，標示量計算公式如下：

本品三個批次，測定結(jié)果為標示量的100.21％～101.46％，見表6。三個批次預混劑產(chǎn)品含量均符合要求。

表6脫氫醋酸鈉預混劑含量測定結(jié)果

2.3含量均勻度

在每一批次預混料的上、中、下層分別選取4個點，共取樣12個，進行含量測定，每一樣品重復三次。含量測定方法同2.2.4，在293nm處測定吸光度。表7為均勻度分析數(shù)據(jù)，從中可見三個批次預混劑均勻度符合要求。

表7脫氫醋酸鈉預混劑的含量均勻度檢查

3防霉有效性

3.1材料與儀器

0.85％生理鹽水：稱取分析純nacl8.5g，定容至1000ml，121℃高溫、高壓滅菌30min，作為稀釋液。

高鹽察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉2g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂(mgs04·7h20)0.5g、氯化鉀0.5g、硫酸亞鐵0.01g、氯化鈉60g、蔗糖30g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml。加熱溶解，分裝后，121℃高壓滅菌30min。必要時，可酌量增加瓊脂。

試驗用飼料采用自配料，70％玉米和30％豆粕。

儀器設備：霉菌培養(yǎng)箱、電子天平、高壓滅菌鍋、試管、無菌工作臺、ph計等。

3.2防霉推薦量試驗

試驗分為6個組，每組3個重復。飼料中添加適量脫氫醋酸鈉預混劑并混勻，添加終濃度含脫氫醋酸鈉分別為0、0.01％、0.02％、0.03％、0.06％、0.08％，分別為ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ和ⅵ組。

稱取試驗所需的飼料量，提高飼料水分至16％～18％，將飼料置于滅菌的三角瓶中，用牛皮紙封口并置于霉菌培養(yǎng)箱中(溫度35～38℃，相對濕度95％以上)培養(yǎng)。分別于0d、3d、5d、15d、20d檢測霉菌數(shù)。飼料中霉菌總數(shù)測定方法按“gb13092-2006”進行。

防霉推薦量試驗結(jié)果見表8?？梢钥闯觯摎浯姿徕c預混劑在飼料中的添加終濃度在0.02～0.08％，在添加后的3～20d內(nèi)對飼料可以起到有效防霉作用。

表8飼料中添加脫氫醋酸鈉后不同時間的霉菌總數(shù)(cfu/g)

注：同列中不同肩標字母表示差異顯著(p＜0.05)；相同字母表示差異不顯著(p＞0.05)。

3.3常規(guī)防霉試驗

試驗分4個組，每個組3個重復。對照組飼料中不添加脫氫醋酸鈉預混劑，160111、160112、160113三個批次脫氫乙酸鈉預混劑在飼料中的添加量均為0.02％。以正常飼料(水分11.0％～12.5％)在自然環(huán)境下存放1w、2w、3w、4w、6w、8w后，按gb13092-2006抽樣進行霉菌數(shù)檢測。

常規(guī)試驗結(jié)果見圖2。與空白對照組比較，脫氫醋酸鈉預混劑添加于飼料后，在6w內(nèi)對飼料有明顯的防霉作用。

3.3強化防霉試驗

試驗分4個組，每個組3個重復。對照組飼料中不添加脫氫醋酸鈉預混劑，160111、160112、160113三個批次脫氫乙酸鈉預混劑在飼料中的添加量均為0.02％。提高飼料水分至16％～18％，置培養(yǎng)箱(溫度35～38℃，相對濕度95％以上)培養(yǎng)，分別于3d、5d、15d、20d取樣，按gb13092-2006抽樣檢測飼料中的霉菌數(shù)。

強化防霉試驗結(jié)果見圖3。與空白對照組比較，在溫度35～38℃，相對濕度95％以上條件下，脫氫醋酸鈉預混劑添加于飼料后于20d內(nèi)對飼料有明顯的防霉作用。

3.4防霉期的試驗

試驗分4個組，每個組3個重復。基礎飼料高溫滅菌處理，對照組飼料中不添加脫氫醋酸鈉預混劑，160111、160112、160113三個批次脫氫乙酸鈉預混劑在飼料中的添加量均為0.02％。調(diào)整飼料水分至13.0％，置溫度25±1.0℃，相對濕度60±2.0％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔15日取樣檢驗霉菌總數(shù)，試驗期60天。

脫氫醋酸鈉預混劑防霉期試驗結(jié)果見圖4。從中可以看出，與對照組比較，在60天的防霉期試驗時間內(nèi)，試驗組霉菌數(shù)極顯著低于對照組。脫氫醋酸鈉至少在60天內(nèi)可以有效地防止飼料霉變。

4制劑穩(wěn)定性

為了脫氫醋酸鈉預混劑的生產(chǎn)、包裝、貯存、運輸條件，及確立該產(chǎn)品的有效期提供科學依據(jù)，根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》2010年版一部《獸藥穩(wěn)定性試驗指導原則》進行了制劑的穩(wěn)定性試驗。

4.1影響因素試驗

取脫氫醋酸鈉預混劑(160112)除去外包裝，置培養(yǎng)皿中，攤成≤5mm厚的薄層，進行以下試驗。

4.1.1高溫試驗

供試品置60℃溫度下放置10天，于第5天和第10天取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目進行檢測，與0天測定結(jié)果相比較。檢驗結(jié)果見表7。

結(jié)果：脫氫醋酸鈉預混劑在60℃溫度下放置10天，于第5天和第10天分別取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目進行檢測，與0天測定結(jié)果相比較。脫氫醋酸鈉預混劑在60℃溫度下放置10天，外觀性狀、顏色、含量無明顯變化。

4.1.2高濕度試驗

供試品置恒濕密閉容器中，分別在25℃、相對濕度90％±5％和25℃、相對濕度75％±5％條件下放置10天，分別于第5天和第10天取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目要求檢測，檢驗結(jié)果見表9。

供試品在25℃、相對濕度90％±5％高濕的環(huán)境下外觀、顏色、含量均無明顯變化。

恒濕條件：干燥器下部放置kno3飽和溶液。

結(jié)果：供試品在高濕的環(huán)境下外觀、顏色、含量均無明顯變化。

4.1.3強光照射試驗

供試品在照度為4500lx±500lx的條件下放置10天，于第5天和第10天取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目要求檢測，與0天測定結(jié)果相比較。檢測結(jié)果脫氫醋酸鈉預混劑在4500lx±500lx的條件下放置10天，外觀與內(nèi)在質(zhì)量無變化，檢測結(jié)果見表10。

結(jié)果：本預混劑在高濕、高溫、高濕及強光照射的影響因素下性狀、外觀及含量均無明顯變化。

4.2加速試驗

取本品三批，按市售包裝，在溫度40±2℃，相對濕度75±5％的條件下放置六個月。分別于第1、2、3、6個月末分別取樣一次，按穩(wěn)定性重點考察項目檢測，檢驗結(jié)果見表11。

表10脫氫醋酸鈉預混劑(160112)影響因素試驗結(jié)果

結(jié)果：模擬市售包裝條件下，本品于溫度40±2℃，相對濕度75±5％環(huán)境中考察6個月，各項指標與0月相比無明顯變化，說明本品在此包裝條件下比較穩(wěn)定。

4.3長期試驗

長期試驗是在接近獸藥的實際貯存條件下進行的，其目的是為制訂獸藥的有效期提供依據(jù)。取本品三批，模擬市售包裝，在溫度25±2℃，相對濕度60±10％條件下放置12個月。分別于0、3、6、9、12個月取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目進行檢測，長期試驗結(jié)果見表12。

結(jié)果：本品采用市售包裝條件于長期試驗條件下考察至12個月，結(jié)果各項指標與0天相比無明顯變化，說明脫氫醋酸鈉預混劑長期儲存12個月性質(zhì)穩(wěn)定。

4.4結(jié)論

本產(chǎn)品在高溫60±2℃、高濕90±5％、強光照射下放置10天，外觀性狀、顏色、含量均無明顯變化。

本產(chǎn)品在溫度40±2℃，相對濕度75±5％的條件下放置六個月，性狀、顏色、外觀均勻度、含量均無明顯變化；在溫度25±2℃，相對濕度60±10％的條件下放置12個月，各項指標均符合規(guī)定，本品的有效期可暫定為2年。

貯藏條件：常溫密封保存。

表11脫氫醋酸鈉預混劑加速試驗結(jié)果

表12脫氫醋酸鈉預混劑長期試驗結(jié)果