本發(fā)明涉及一種利用耐乙醇片球菌（pediococcusethanolidurans）復合發(fā)酵生產(chǎn)含gaba果蔬酵素的方法，屬于發(fā)酵型功能飲品加工領域。

背景技術：

酵素（enzyme）又稱為“酶”，是一種由氨基酸組成的具有特殊生物活性的物質，是維持機體正常功能以及消化食物、修復組織等生命活動的一種必需物質。2016年中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會針對酵素制定了《酵素產(chǎn)品分類導則》，按生產(chǎn)工藝分為純種發(fā)酵酵素、群種發(fā)酵酵素及復合發(fā)酵酵素。純種發(fā)酵工藝指以動物、植物、菌類等為原料，由人工培養(yǎng)的有明確分類名稱的微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的酵素產(chǎn)品。群種發(fā)酵工藝，即自然發(fā)酵工藝，指以動物、植物、菌類等為原料，由特定自然環(huán)境中的微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的酵素產(chǎn)品。復合發(fā)酵工藝指以動物、植物、菌類等為原料，以純種發(fā)酵和群種發(fā)酵兩種工藝共同制得的含有特定生物活性成分的酵素產(chǎn)品。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，簡稱gaba），又稱4-氨基丁酸、氨酪酸、哌啶酸，是一種普遍存在的非蛋白質氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質。它由谷氨酸脫羧酶（gad）催化l-谷氨酸發(fā)生不可逆的α-脫羧反應而生成。它具有多種生理功能，如調節(jié)血壓、治療癲癇、促進細胞新陳代謝、保護肝臟、促進生長激素分泌、預防肥胖、促進酒精代謝等功效。目前gaba主要生產(chǎn)方法包括化學合成和生物合成?；瘜W合成過程中所用化學溶劑具有毒性和腐蝕性，產(chǎn)品中副產(chǎn)物多，缺乏安全性；相反，生物合成生產(chǎn)過程條件溫和、環(huán)境污染較低，且產(chǎn)品中副產(chǎn)物少、安全性高。因此利用微生物生產(chǎn)gaba，不受資源、環(huán)境和空間的限制，具有顯著的優(yōu)點。2009年我國衛(wèi)生部批準希氏乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的gaba為新資源食品，可用于普通食品及保健食品的生產(chǎn)。

在我國的專利及文獻中有利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)gaba的方法，如乳酸乳球菌(專利號zl201310486474.7)、短乳桿菌(專利號zl200510049188.x)、植物乳桿菌（專利號zl201010167058.7）、嗜熱鏈球菌（專利號zl201410480097.0）、發(fā)酵乳桿菌(專利號zl201210136696.1）、屎腸球菌（專利號zl200910114018.3）、紅色紅曲霉(專利號zl201010167058.7)、釀酒酵母（專利號zl201010194431.8）等。

片球菌為有益的乳酸菌，在參與肉類、蔬菜及白酒的發(fā)酵過程中，往往會產(chǎn)生一些發(fā)酵食品的風味物質。劉莉萌等在文獻（釀酒科技,2007,2:22-28）中報道：從不同白酒酒醅發(fā)酵窖池中分離出20株片球菌，包括耐乙醇片球菌、戊糖片球菌及窖池片球菌等，并指出窖池中片球菌種類及數(shù)量是影響白酒風味的重要因素。陳功等在文獻（食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(3):1-4）中研究表明耐乙醇片球菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌等乳酸菌是四川泡菜發(fā)酵的優(yōu)勢菌群，是影響四川泡菜風味物質及功能性的重要因素?？梢姡鸵掖计蚓鷮儆谟幸娴娜樗峋?，可用于普通食品的生產(chǎn)與加工。

目前市場上酵素產(chǎn)品，大多數(shù)采用群種自然發(fā)酵方式生產(chǎn)。群種自然發(fā)酵方式生產(chǎn)酵素過程中，發(fā)酵菌種主要來源于各種水果蔬菜自帶天然酵母、乳酸菌等，屬于“自然落菌式”發(fā)酵。在整個發(fā)酵過程，天然酵母將含有糖質的原料“糖化”和“酒化”，會產(chǎn)生大量乙醇、二氧化碳等物質。一方面乙醇可以抑制雜菌的生長，但同時也抑制了生產(chǎn)gaba的乳酸菌繁殖與代謝。因此，獲得既能耐受乙醇，又具有生產(chǎn)gaba能力的發(fā)酵菌種，是解決生物發(fā)酵法生產(chǎn)含gaba酵素產(chǎn)品的關鍵途徑。

通過上述專利文獻和非專利文獻的檢索，但目前尚未見有關于既能耐受乙醇，又具有生產(chǎn)gaba能力的耐乙醇片球菌及其應用的報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，利用首次篩選得到的既能耐受乙醇，又能生產(chǎn)gaba耐乙醇片球菌為發(fā)酵菌種，采用復合發(fā)酵方式，解決了群種自然發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量乙醇與后期發(fā)酵過程中產(chǎn)gaba微生物無法細胞繁殖及累積gaba的矛盾。耐乙醇片球菌既能耐受一定濃度酒精而生長繁殖，又可以利用谷氨酸脫羧酶生產(chǎn)gaba。通過復合發(fā)酵方式和分步控制發(fā)酵條件，既可以完成群種自然發(fā)酵周期，又能純種發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸，達到生產(chǎn)含γ-氨基丁酸的果蔬酵素的目的，簡化了發(fā)酵工藝、提高了設備利用率和降低了生產(chǎn)成本，同時提升了酵素產(chǎn)品的保健功能，屬于發(fā)酵型功能飲品加工領域。

本發(fā)明提供利用耐乙醇片球菌復合發(fā)酵生產(chǎn)含gaba果蔬酵素的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)以新鮮刺梨、蘆筍等果蔬為原料，洗凈、去籽、破碎，轉移至發(fā)酵罐中勻漿，加入蜂蜜后靜置密封，進行群種自然發(fā)酵，獲得第一發(fā)酵液；

(2)向第一發(fā)酵液接入耐乙醇片球菌cgmccno.13929，進行純種前期發(fā)酵，然后加入谷氨酸或谷氨酸鈉，進行純種后期發(fā)酵，當發(fā)酵液中gaba含量高于200mg/l時，獲得第二發(fā)酵液；

(3)將所述第二發(fā)酵液混勻后，離心、均質及滅菌后，制得含gaba果蔬酵素。

步驟（1）中所述的群種自然發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度為25-35℃，發(fā)酵時間為30-90d。

步驟（2）中所述的耐乙醇片球菌cicc6282，菌種保藏號cgmccno.13929，保藏日期為2017年3月24日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；純種初期發(fā)酵時間為16-36h，控制谷氨酸或谷氨酸鈉終濃度為0.5-2g/l，純種后期發(fā)酵時間為60-180h，發(fā)酵溫度為28-40℃，攪拌速度為80-150r/min，gaba濃度為200-800mg/l。

本發(fā)明的優(yōu)點：

首次發(fā)現(xiàn)既能耐受乙醇，又能生產(chǎn)gaba耐乙醇片球菌。本發(fā)明方法利用耐乙醇片球菌對酒精的耐受性，可作為發(fā)酵菌種，解決了群種自然發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量乙醇與后期發(fā)酵產(chǎn)gaba微生物無法細胞繁殖及gaba累積的矛盾。最終通過復合發(fā)酵方式，達到生產(chǎn)含γ-氨基丁酸果蔬酵素的目的，簡化了發(fā)酵工藝，提高了設備利用率，大大降低了生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中薄層層析法檢測耐乙醇片球菌產(chǎn)gaba。

圖2為本發(fā)明中hplc法檢測耐乙醇片球菌產(chǎn)gaba。

具體實施方式

下面將結合具體實施例來進一步對本發(fā)明作詳細描述，以使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚。以下實施例僅僅用于舉例說明，并不對本發(fā)明構成任何限制。

實施例1

本發(fā)明產(chǎn)gaba耐乙醇片球菌的分離方法，采用梯度稀釋混菌法，從新疆巴音郭楞蒙古自治州博湖縣發(fā)酵辣椒醬中分離。包括以下步驟：取25g的辣椒醬加入到225ml無菌生理鹽水中，用渦旋振蕩器搖勻，制得10^-1的稀釋液，梯度稀釋以制得10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的稀釋液。分別取100?μl稀釋液涂布于添加了2%caco3的mrs培養(yǎng)基，置于37℃下培養(yǎng)48h。挑取有溶鈣圈的單菌落進行平板劃線純化，并將分離的菌株保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為cicc6282。將菌株cicc6282接種于mrs固體培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)48h，菌落呈乳白色，圓形扁平，不透明，邊緣整齊；顯微鏡下觀察菌體呈球狀，大小為（0.3-0.5）μm，成對或呈四聯(lián)球狀排列，革蘭氏染色陽性。通過接觸酶實驗和api50chl試劑條對菌株cicc6282的酶活性、碳源利用等生理生化特征檢測，結果顯示菌株cicc6282接觸酶反應陰性，能夠利用半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、n-乙酰葡糖胺、七葉靈、水楊苷、纖維二糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、龍膽二糖為碳源生長，不能利用其他的碳源。

菌株cicc6282的16srdnapcr擴增產(chǎn)物大小約為1.4kb，在genbank上的登錄號為ky681774。將該序列通過ezbiocloud數(shù)據(jù)庫比對，結果顯示：同cicc6282的16srdna序列相似性高于97%的序列全部是片球菌屬的模式菌株序列，其中菌株cicc6282同耐乙醇片球菌pediococcusethanoliduransz-9^t的16srdna序列相似性最高，為99.86%。以lactobacillusozensismizu2-1^t序列為外群，構建cicc6282與相關近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示，通過16srdna序列系統(tǒng)發(fā)育分析可將菌株cicc6282鑒定為片球菌屬（pediococcussp.）。菌株cicc6282的phes基因pcr擴增產(chǎn)物大小約為400bp，在genbank上的登錄號為ky681775。通過mega軟件進行比對，結果顯示：cicc6282的phes基因序列與耐乙醇片球菌pediococcusethanolidurans模式菌株相似性最高，為100%，而與片球菌屬其余菌株phes基因序列的相似性均低于90%。以lactobacillusshenzhenensisly-73^t序列為外群，構建cicc6282與相關近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，phes基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，菌株cicc6282鑒定為耐乙醇片球菌pediococcusethanolidurans。通過形態(tài)學觀察并結合16srdna和phes基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，結合微生物代謝類型差異，菌株cicc6282被鑒定為耐乙醇片球菌pediococcusethanolidurans。

本發(fā)明中耐乙醇片球菌產(chǎn)gaba定性檢測，采用薄層層析法，具體步驟包括：取出發(fā)酵液，震蕩均勻，8000r/min離心10min，棄沉淀，取上清。層析板為商品化10×20cm微晶纖維素玻璃板。以1mg/ml的gaba標準液、1mg/ml的l-glu標準液為對照，每組點樣量為0.5μl，點樣間距為1cm，點樣的同時迅速用吹風機將點樣處吹干，以防樣品溶液擴散，影響層析效果。以正丁醇：冰醋酸：水（4：3：1，v/v）作展層劑，以0.4%茚三酮水飽和正丁醇試劑作顯色劑，置于80℃烘箱內(nèi)，顯色10min。觀察薄層層析結果，耐乙醇片球菌cicc6282發(fā)酵液中有與gaba標品相同層析距離的條帶，如圖1所示。

本發(fā)明中耐乙醇片球菌產(chǎn)gaba定量檢測，采用高效液相法，具體步驟如下：取100μl發(fā)酵液上清或gaba標準液，加入800μlopa衍生液，震蕩5s，過0.45μm濾膜。色譜分析條件：色譜柱：c18色譜柱（250×4.6mm，5μm）。流動相：流動相a為純乙腈；流動相b為25mmol/l乙酸鈉，用5%乙酸調ph至5.90。設置液相色譜流動相流速為1ml/min，保持柱溫40℃，進樣量5μl，檢測波長334nm。結果表明本發(fā)明的耐乙醇片球菌發(fā)酵液中gaba含量達到了250mg/100g，如圖2所示。

上述發(fā)明中的耐乙醇片球菌發(fā)酵菌，保藏號cgmccno.13929，保藏日期為2017年3月24日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

首先按質量比選取2份新鮮刺梨和1份蘆筍，清洗、消毒，去籽、破碎，轉移至發(fā)酵罐中勻漿，加入0.5份蜂蜜后靜置密封，進行群種自然發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為30d，得第一發(fā)酵液。其次，按10%（v/v）接種耐乙醇片球菌cgmccno.13929種子液，進行純種初期發(fā)酵，發(fā)酵24h后，加入谷氨酸鈉終濃度為0.5g/l，進行純種后期發(fā)酵，發(fā)酵溫度為37℃，攪拌速度為80r/min，當發(fā)酵液中gaba含量達到200mg/l時，獲得第二發(fā)酵液。然后固液分離得發(fā)酵汁，125℃滅菌15s，得到發(fā)明品—含gaba果蔬酵素產(chǎn)品1。

實施例2

首先按質量比選取1份新鮮刺梨、2份蘆筍和2份山楂，清洗、消毒，去籽、破碎，轉移至發(fā)酵罐中勻漿，加入1份蜂蜜后靜置密封，進行群種自然發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為40d，得第一發(fā)酵液。其次，按8%（v/v）接種耐乙醇片球菌cgmccno.13929種子液，進行純種初期發(fā)酵，發(fā)酵30h后，加入谷氨酸鈉終濃度為1g/l，進行純種后期發(fā)酵，發(fā)酵溫度為37℃，攪拌速度為100r/min，當發(fā)酵液中gaba含量達到500mg/l時，獲得第二發(fā)酵液。然后固液分離得發(fā)酵汁，125℃滅菌15s，得到發(fā)明品—含gaba果蔬酵素產(chǎn)品2。

以上結合具體實施方式對本發(fā)明進行了說明，這些具體實施方式僅僅是示例性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍，本領域技術人員在不脫離本發(fā)明實質的前提下可以進行各種修改、變化或替換。因此，依照本發(fā)明所作的各種等同變化，仍屬于本發(fā)明所涵蓋范圍。