本發(fā)明涉及食品保鮮
技術(shù)領域：
，具體地說，涉及一種群體感應淬滅酶和細菌素聯(lián)合防腐保鮮方法。
背景技術(shù)：
：群體感應(quorumsensing,qs)是細菌通過產(chǎn)生、分泌和感知信號分子調(diào)節(jié)相關基因表達，從而控制一系列生理過程的一種信號交流機制。qs系統(tǒng)能調(diào)控細菌的多種行為例如致病性、生物被膜的形成、對抗菌物質(zhì)的拮抗，對真核宿主細胞的防御響應等。近年來研究發(fā)現(xiàn)食品中微生物的某些行為(產(chǎn)生腐敗酶，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，生物被膜形成，通過競爭獲得新特性或抗生素抗性)及微生物之間的相互影響及交流受qs調(diào)控，qs可能參與食品腐敗。由于腐敗菌的腐敗行為可能受qs調(diào)控，因此通過阻斷qs系統(tǒng)可以控制細菌中食品腐敗相關基因的表達，最終控制腐敗。群體感應淬滅酶能夠破壞細菌的qs信號分子結(jié)構(gòu)從而對其qs系統(tǒng)進行阻斷，是一種有效的qs阻斷方法。革蘭氏陰性菌的qs信號分子通常為n-?；呓z氨酸內(nèi)酯(ahl),而ahl內(nèi)酯酶是一種高度特定性的酶，它能夠破壞ahls的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)，具有廣泛的底物活性，因此能夠被用于阻斷革蘭氏陰性菌的qs系統(tǒng)。據(jù)報道，來源于芽孢桿菌ai96(bacillussp.ai96)的ahl內(nèi)酯酶aiiaai96對多種ahls底物都具有水解活，且它與其它來源于bacillus的ahl內(nèi)酯酶相比具有更穩(wěn)定的理化性質(zhì)，aiiaai96在ph8.0、10～40℃的條件下能維持接近100％的活性，在ph8.0，70℃條件下1h處理后能維持60％活性，并且能抵抗蛋白酶的水解作用，將aiiaai96口服斑馬魚，能顯著減少嗜水氣單胞菌對斑馬魚的致病力。目前，將ahl內(nèi)酯酶應用于食品防腐的研究還未見報道。乳酸菌細菌素由于其高效、安全、無毒、可被人體消化等的優(yōu)點，使其成為天然生物防腐劑的研究熱點。目前乳酸菌細菌素中只有乳酸鏈球菌素(nisin)被批準添加到食品中。食品腐敗特別是水產(chǎn)品的腐敗主要由革蘭氏陰性菌引起，而nisin對革蘭氏陽性菌有非常強的抑制作用，對革蘭氏陰性菌的抑制作用非常弱，因此它在食品腐敗中的應用存在一定的局限性。將作用于革蘭氏陰性菌的ahl內(nèi)酯酶和作用于革蘭氏陽性菌的nisin聯(lián)合使用理論上可以達到更強的食品防腐效果，然而群體感應淬滅酶單獨使用以及它與nisin復合使用應用于食品防腐方面的研究還未見報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種群體感應淬滅酶和細菌素聯(lián)合防腐保鮮方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種防腐保鮮劑，其含有群體感應淬滅酶和乳酸鏈球菌素。優(yōu)選地，本發(fā)明的防腐保鮮劑是將群體感應淬滅酶和乳酸鏈球菌素制成ph值為6.0-8.0的混合溶液；混合溶液中，群體感應淬滅酶的終濃度為6.6×10-2u/ml-66u/ml，乳酸鏈球菌素的終濃度為1800-2300iu/ml。優(yōu)選地，本發(fā)明防腐保鮮劑中的群體感應淬滅酶的終濃度為6.6×10-1u/ml-6.6u/ml，乳酸鏈球菌素的終濃度為1900-2200iu/ml。更優(yōu)選地，本發(fā)明防腐保鮮劑中的群體感應淬滅酶的終濃度為6.6×10-2u/ml，6.6×10-1u/ml或6.6u/ml，乳酸鏈球菌素的終濃度為2000iu/ml。最優(yōu)選地，本發(fā)明防腐保鮮劑中的群體感應淬滅酶的終濃度為6.6u/ml，乳酸鏈球菌素的終濃度為2000iu/ml。進一步地，將群體感應淬滅酶和乳酸鏈球菌素制成ph為7.0的混合溶液；混合溶液的溶劑為0.1m和ph7.0的磷酸鹽緩沖溶液。本發(fā)明提供了上述防腐保鮮劑在食品防腐保鮮中的應用。本發(fā)明提供了群體感應淬滅酶和細菌素聯(lián)合防腐保鮮方法，是將待保鮮的食品在本發(fā)明上述的防腐保鮮劑液中浸泡處理。所述的食品為水產(chǎn)品或非水產(chǎn)品的肉類。浸泡處理時間為3-5min。本發(fā)明的群體感應淬滅酶和細菌素聯(lián)合防腐保鮮方法還包括將浸泡后的食品取出瀝干，0-4℃儲藏或真空包裝。本發(fā)明在不使用任何化學防腐劑的情況下，結(jié)合了群體感應淬滅酶對革蘭氏陰性菌起主要作用和nisin對革蘭氏陽性菌起主要作用的特點，對低溫食品特別是水產(chǎn)品的防腐保鮮提供了一種新的方法。該技術(shù)不僅可以明顯延長真空包裝鱘魚片4℃冷藏的貨架期延長5天，有效減少貯藏過程中揮發(fā)性鹽基氮和生物胺的積累，還可以延緩魚肉色澤、氣味、質(zhì)構(gòu)等感官品質(zhì)的下降。附圖說明圖1真空包裝鱘魚片4℃貯藏過程中總菌數(shù)的變化.a,0.1mph7.0磷酸鹽緩沖液處理組；b,c,d分別為6.6,6.6×10-1,6.6×10-2u/ml淬滅酶處理組；e,f,g分別為6.6,6.6×10-1,6.6×10-2u/ml淬滅酶與2000iu/mlnisin復合處理組；h為2000iu/mlnisin處理組。a～h圖例適用于圖2至圖7。圖2真空包裝鱘魚片4℃貯藏過程中氣單胞菌數(shù)的變化。圖3真空包裝鱘魚片4℃貯藏過程中耐冷菌數(shù)的變化。圖4真空包裝鱘魚片4℃貯藏過程中腸科菌菌數(shù)的變化。圖5真空包裝鱘魚片4℃貯藏過程中感官分值的變化。圖6真空包裝鱘魚片4℃貯藏過程中tvb-n的變化。圖7真空包裝鱘魚片4℃貯藏過程中生物胺的變化。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。本發(fā)明實施例采用的乳酸鏈球菌素(nisin)，購于浙江新銀象生物工程有限公司，效價為1×106iu/g。群體感應淬滅酶購于北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司，n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶酶活為1000u/g。下文將其簡稱為淬滅酶。實施例1利用群體感應淬滅酶和細菌素對鱘魚片的防腐保鮮1、含有群體感應淬滅酶和乳酸鏈球菌素的防腐保鮮劑的制備淬滅酶酶活的測定方法采用瓊脂平板擴散法。將3-oxo-c8-hsl溶于1×pbsph8.0緩沖液中，使其終濃度為1mg/l。酶活反應體系：將20μl酶液，179ul的1×pbsph8.0緩沖液和1μl的3-oxo-c8-hsl的溶液混合，搖勻。30℃溫育30min后，反應體系中加入50μl10％的sds溶液終止反應。在用平板擴散法檢測中，atmm瓊脂用手術(shù)刀切割成4×60mm的膠條，用牙簽將檢測菌kyc55間隔4mm點接于膠條上，將10μl的反應終止的酶反應液滴定至膠條一端，30℃培養(yǎng)24h后計數(shù)變藍點數(shù)，計算距離，按標準曲線公式計算3-oxo-c8-hsl消耗。對照組加酶液和緩沖液后，先加sds溶液再加信號分子。標準曲線制備，將3-oxo-c8-hsl溶于1×pbsph8.0緩沖液中，終濃度為1mg/l。分別向1×pbsph8.0的緩沖液中添加10、5、1、0.5、0.1和0.05μl的3-oxo-c8-hsl的溶液，用1×pbsph8.0的緩沖液將體系補充至200μl，搖勻。30℃溫育30min后，反應體系中加入50μl10％的sds溶液終止反應。用牙簽將檢測菌kyc55間隔4mm點接于膠條上，將10μl反應終止的反應液滴至膠條一端，30℃培養(yǎng)24h后計數(shù)變藍點數(shù)，計算距離(mm)，以加入3-oxo-c8-hsl物質(zhì)量為縱軸(y)，以擴散距離為橫軸(x)，建立回歸方程，計算3-oxo-c8-hsl消耗量。并以回歸方程為基礎建立酶活計算公式。酶活(u/ml)單位定義：在30℃條件下1min分解1nmol3-oxo-c8-hsl定義為一個酶活單位。以0.1mph7.0磷酸鹽緩沖液為母液，添加一定量的nisin配制成2000iu/ml的nisin儲備液。將淬滅酶用0.1mph7.0磷酸鹽緩沖液配制成6.6、6.6×10-1、6.6×10-2u/ml3個不同濃度的淬滅酶溶液。同時，在0.1mph7.0磷酸鹽緩沖液中添加一定量的nisin和淬滅酶溶液配制成3種不同的nisin-淬滅酶復配液，即防腐保鮮劑，其中nisin的效價均為2000iu/ml，群體感應淬滅酶的效價分別為6.6、6.6×10-1、6.6×10-2u/ml。2、群體感應淬滅酶和細菌素聯(lián)合防腐保鮮方法的建立將鮮活鱘魚用無菌水清洗、去頭、去內(nèi)臟、切片并再次清洗。將鱘魚樣品隨機分成8個處理組：(a)0.1mph7.0磷酸鹽緩沖液(空白對照組)，(b)6.6u/ml淬滅酶，(c)6.6×10-1u/ml淬滅酶，(d)6.6×10-2u/ml淬滅酶，(e)6.6u/ml淬滅酶與2000iu/mlnisin復合液，(f)6.6×10-1u/ml淬滅酶與2000iu/mlnisin復合液，(g)6.6×10-2u/ml淬滅酶與2000iu/mlnisin復合液，(h)2000iu/mlnisin。將魚片在各處理溶液中浸泡3min，撈出瀝干15s，然后將魚片置于真空包裝袋中進行真空包裝。3、效果檢測將已經(jīng)浸泡處理并真空包裝的魚肉樣品立即取出部分魚肉進行分析，數(shù)據(jù)記為第0天，剩余魚肉冷藏于4℃冰鮮中，分別在貯藏的第3，6，8，10，12，14天進行取樣分析。每個處理組取3袋進行測定，測定結(jié)果取平均值。(1)不同處理組魚片的微生物變化分析取經(jīng)過上述防腐劑浸泡處理過25g鱘魚肉于225ml生理鹽水(0.85％,w/v)中，均質(zhì)60s，用生理鹽水做10倍梯度稀釋，在選擇性培養(yǎng)基平板中做傾注法計數(shù)，表1中每種微生物選擇三個梯度進行計數(shù)，每個梯度做兩個平行。微生物分析方法參照國家標準進行，不同菌群分別采用不同的選擇性培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行分離和計數(shù)，詳見表1。本試驗中各微生物的檢測方法的檢測極限均為10cfu/g。表1魚片中不同微生物的培養(yǎng)條件微生物種類培養(yǎng)基培養(yǎng)條件所參考標準平板計數(shù)(pca)瓊脂36±1℃48h①氣單胞菌氨芐青霉素麥康凱瓊脂(ama)28±1℃48h②耐冷菌平板計數(shù)(pca)瓊脂6.5±0.5℃10d③大腸菌群結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(vrba)36±1℃18-24h④表1中①為gb4789.2-2010《食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》，②為guim,etal.biogenicaminesformation,nucleotidedegradationandtvb‐naccumulationofvacuum‐packedmincedsturgeon(acipenserschrencki)storedat4℃andtheirrelationtomicrobiologicalattributes[j].journalofthescienceoffoodandagriculture,2014,94(10):2057-2063.，③為ny/t1331-2007《乳與乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數(shù)的測定》，④為gb4789.3-2008《食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》。圖1-4描述了淬滅酶和細菌素處理對鱘魚片4℃冷藏過程中細菌總數(shù)、氣單胞菌、耐冷菌和大腸菌群的變化。各組樣品在儲藏期間總菌數(shù)顯著增加(p<0.05)(圖1)，各組樣品總菌數(shù)增加到7logcfu/g的天數(shù)分別：a組為3-6天，d組、c組為6-8天，b組、h組約為8天，g組、f組為8-10天，e組為10-12天。這說明群體感應淬滅酶對鱘魚片微生物生長具有抑制作用，且群體感應淬滅酶量越大，抑制能力越強；6.6u/ml淬滅酶(b組)與2000iu/mlnisin(h組)抑菌效果相當。從本試驗中還可以發(fā)現(xiàn)，與單獨淬滅酶處理相比，淬滅酶與nisin復配后對鱘魚片的抑菌效果增強，與對照組相比，6.6u/ml淬滅酶處理組魚片貨架期延長了約3天，而6.6u/ml淬滅酶與2000iu/mlnisin復配后貨架期延長了約5天。淬滅酶對氣單胞菌、耐冷菌和腸科菌均呈現(xiàn)不同程度的抑制效果(圖2-4)，且6.6u/ml淬滅酶抑菌效果均顯著好于6.6×10-2u/ml和6.6×10-1u/ml淬滅酶處理效果。將淬滅酶與nisin復配后使用抑菌效果增強，6.6u/ml淬滅酶與2000iu/mlnisin復配處理組在所有處理組中抑菌效果均最好。(2)不同處理魚片的理化及感官特性變化分析1)感官特性變化分析采用定量描述分析(quantitativedescriptiveanalysis,qda)對各處理樣品進行感官評定。評定小組由6個經(jīng)過培訓過的感官評價人員組成的評定小組依據(jù)表2中質(zhì)量指標評定方法進行打分。4個得分水平(0-3)和4個參數(shù)(質(zhì)地、氣味、顏色和不緊密性)用于評價鱘魚片的感官情況。表2鱘魚魚片感官評價標準鱘魚片在不同處理條件下感官分值變化如圖5所示。0分代表魚處于完全新鮮的狀態(tài)，6分代表魚片到達了感官可接受限值。所有處理組魚片在儲藏期間感官分值均顯著性上升(p<0.05)，說明魚片在逐漸腐敗，隨著儲藏時間增加，魚片主要表現(xiàn)在質(zhì)地變軟、出水量增加、逐漸變的不緊密，酸敗味加重且魚片顏色由白色變成偏黃色。感官評價的貨架期a組為3～6天，c、d組為6～8天，b組、h組、f組、g組組均為8～10天，e組為10～12天，與微生物評價的貨架期基本一致。與對照組感官評價貨架期相比，b組延長了約3天，而e組延長了約5天，說明6.6u/ml淬滅酶處理能有效延緩魚片感官品質(zhì)的變壞程度，且6.6u/ml淬滅酶與2000iu/mlnisin復配處理能使魚片感官品質(zhì)得到更好的控制。2)總揮發(fā)性鹽基氮(tvb-n)的變化采用gb/t5009.44-2003《肉與肉制品衛(wèi)生標準的分析方法》中半微量定氮法測定。簡述如下：稱取10g碎肉(前述8種不同處理方式下的魚肉，分別采集碎肉)于100ml水中，震蕩均勻，浸漬30min過濾。采用fosskjeltec2300型凱氏定氮儀。將盛有10ml吸收液及5至6滴混合指示液的錐形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下，準確量取5ml樣液于消化管中，進行蒸餾，5min后停止，吸收液用鹽酸標準液(0.01mol/l)進行滴定，終點至藍紫色。以蒸餾水為空白。結(jié)果計算：試樣中揮發(fā)性鹽基氮的含量按式(1)計算x＝((v1-v2)×c×14)/(m×5/100)×100式(1)中：x—試樣中揮發(fā)性鹽基氮的含量，單位為毫克每百克(mg/100g)vi—測定用樣液消耗鹽酸或硫酸標準溶液體積，單位為毫升(ml)；v2—試劑空自消耗鹽酸或硫酸標準溶液體積，單位為毫升(ml)；c一鹽酸標準溶液的實際濃度，單位為摩爾每升(mo1/l)；14一與1.00ml鹽酸標準滴定溶液(c(hci)＝1.000mol/l)相當?shù)牡馁|(zhì)量，單位為毫克(mg)；m—試樣質(zhì)量，單位為克(g)。魚肉中tvb-n的增加主要來源于細菌降解蛋白質(zhì)、氨基酸和魚肉中其它堿性氮類化合物產(chǎn)生的氨,它一定程度上反應魚皮的微生物腐敗程度。鱘魚魚片在不同處理條件下tvb-n變化如圖6所示。在各處理組鱘魚片到達感官拒絕點時，各處理組的tvb-n值處于20～30mg/100g，低于歐洲委員會規(guī)定的魚腐敗可接受上限35mg/100g。在0～14天(第0天除外)儲藏期間，鱘魚片各處理組tvb-n均顯著低于對照組(p<0.05)。在8～10天儲藏期間b組tvb-n值顯著低于c組及d組(p<0.05)，而e組顯著低于其它處理組(p<0.05)，說明淬滅酶能有效抑制鱘魚魚片tvb-n的積累，且淬滅酶量增加至6.6u/ml時抑制效果最明顯，淬滅酶與nisin復配時對tvb-n積累的抑制效果優(yōu)于單獨淬滅酶處理時效果。3)生物胺的變化生物胺是微生物將氨基酸脫羧后產(chǎn)生的非揮發(fā)性物質(zhì)，它們的存在與腐敗相關。鱘魚片在不同處理條件下生物胺總數(shù)的變化如圖7所示。a組、c組、d組在儲藏第6天，b組、h組、f組、g組在儲藏第8天，e組在儲藏第10天，即各處理組總菌數(shù)達到接近7logcfu/g時生物胺總數(shù)開始陡然上升，這與tvb-n的變化趨勢一致。儲藏第6天開始，b組生物胺總數(shù)顯著低于a組、c組、d組，而c組和d組在第6～10天無顯著性差異(p>0.05)，且c組、d組在第10天和第8天與a組也無顯著性差異(p>0.05)，這說明淬滅酶對鱘魚魚片生物胺積累具有抑制作用，但這種抑制作用并不與淬滅酶的劑量呈簡單的依賴關系，只有當淬滅酶量達到6.6u/ml時，才對生物胺的積累產(chǎn)生明顯的抑制作用，在微生物和tvb-n試驗中也發(fā)現(xiàn)了同樣規(guī)律。在整個儲藏期間(除第12天外)，h組與b組生物胺總數(shù)無顯著性差異(p>0.05)，這說明6.6u/ml淬滅酶抑制鱘魚魚片生物胺積累的效果與2000iu/mlnisin效果一致。e組在鱘魚魚片儲藏后期(第10～14天)均顯著低于其它處理組(p<0.05)，說明6.6u/ml淬滅酶與2000iu/mlnisin復配后對生物胺積累的抑制效果最好，這與微生物、感官及tvb-n的結(jié)果一致，這說明6.6u/ml淬滅酶與2000iu/mlnisin復配后對鱘魚魚片防腐效果具有疊加效應，優(yōu)于單獨淬滅酶處理或者nisin處理時防腐效果。綜合微生物、理化及感官特性分析，確定6.6u/ml淬滅酶與2000iu/mlnisin復配處理的效果最好，可將產(chǎn)品貨架期延長5天左右。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁12