本發(fā)明屬于精油應用領域，涉及四季桔精油及其制備方法和對食源性致病菌的抑制作用，尤其涉及四季桔精油在食品防腐、果蔬保鮮領域的應用。

背景技術：

食品安全是全球性的公共衛(wèi)生問題，2016年who數(shù)據(jù)顯示每年約42萬人因食源性疾病而死亡，研究表明食源性致病菌是導致發(fā)病甚至死亡的主要原因。如單增李斯特菌可引起嚴重的食物中毒，繼而引發(fā)敗血癥、腦膜炎甚至死亡。同時化學合成防腐劑濫用帶來的殘留和耐藥性等負面效應也直接威脅人類的健康。因此尋找安全有效的食品防腐劑和保鮮劑迫在眉睫。從天然植物中篩選抗菌活性成分成為近年來的研究熱點。

四季桔(citrusmitisblanco)是蕓香科(rutaceae)柑橘屬(citrusl.)常綠灌木或小喬木，是金桔(fortunellamargarita)和柑橘(citrusreticulata)的雜交種。分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，如菲律賓、中美洲、日本等地。中國各地均有種植，南方栽培較為常見，如廣東、廣西等地。藥用價值明顯，有化痰、止咳、理氣、消食等功效。目前，關于四季桔精油的研究很少，僅有的研究也多集中在化學成分方面，對生物活性方面的研究非常有限。但是從其他植物精油的研究中發(fā)現(xiàn)，四季桔精油中的主要化學成分芳樟醇、檸檬烯、檜烯、月桂烯、β-蒎烯有抑制微生物活性，因此推測四季桔精油具有抑菌活性。且柑橘屬的其他植物精油已證實具有抑菌、抗真菌、抗氧化、殺蟲、改善肝毒性和腎毒性等多種生物活性，被廣泛于醫(yī)療保健、食品防腐、果蔬保鮮、害蟲防治、生態(tài)旅游和日化產(chǎn)品等領域。

綜上，四季桔植物精油作為植物源抑菌劑具有良好的開發(fā)應用前景，有待進一步研究。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術對四季桔精油沒有進一步研究的現(xiàn)狀，開發(fā)出一種具有抑菌活性的四季桔精油。

本發(fā)明的技術方案為：一種具有抑菌活性的四季桔精油，包括分別用四季桔的葉、青皮或者黃皮制備的精油。采用的部分不同，制備的精油抑菌效果也不同。

本方案中的具有抑菌活性的四季桔精油的制備方法，包括下述步驟：

步驟一、采集四季桔的葉、青皮或者黃皮，將其分別粉碎；

步驟二、用水蒸汽蒸餾法在料液比為1/5～1/3，蒸餾時間為50～70min的條件下分別提取四季桔桔葉精油、四季桔青皮精油或者四季桔黃皮精油。

優(yōu)選的，所述步驟1中粉碎的粒徑為10-20目。在這個粒徑下既能保證原材料粉碎度能夠與水充分接觸，減少精油從內(nèi)部擴散到表面的距離，又能避免粒徑太小而出現(xiàn)的粉末結(jié)塊的現(xiàn)象。

優(yōu)選的，所述步驟2中水蒸汽蒸餾法在具體操作時，需將原材料分成5份，分次蒸餾，每50～70min更換新的原料。為了避免加熱時間過長，使精油成分散失，所以采取分次蒸餾的方式，且也便于將精油混合，在操作時，需控制溫度為95～105℃，使蒸餾過程中一直保持微沸狀態(tài)，避免局部過熱使精油的化學成分發(fā)生變化。

此法所得四季桔桔葉、青皮、黃皮精油得率分別為0.28％、1.06％、0.80％，與文獻中柑橘屬植物精油得率基本一致：葉子精油得率0.23～0.29％，不同成熟度果皮精油得率0.75％～1.75％。

該提取工藝簡單，無其他添加劑或者成分，在保證提取率的前提下，盡可能縮短加熱時間，降低加熱溫度，避免精油成分的散失和改變，具有安全、有效、無毒、綠色環(huán)保等優(yōu)點。

進一步，所述的菌為食源性致病菌，微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要問題，尋找有效、安全的抑菌劑可以從源頭上解決問題。

優(yōu)選的，所述食源性致病菌為金黃葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌或者大腸桿菌，它們是我國食品中最常見的食源性病原菌，因其引起的食物中毒占有主要位置。

具有抑菌活性的四季桔精油在食品防腐、果蔬保鮮領域的應用。上述致病菌主要存在于蔬菜、水果、生肉、熟肉等食品中，可通過精油香薰、浸泡、噴灑或者直接作為食品添加劑加工食品等方法，進行有效抑菌，防止食品污染。

本發(fā)明的工作原理及有益效果：本發(fā)明揭示四季桔精油作為植物源抑菌劑的應用潛力和優(yōu)點。通過水蒸汽蒸餾法提取四季桔的桔葉精油、青皮精油或者黃皮精油，采用濾紙片瓊脂擴散法和微量肉湯稀釋法測定了它們對金黃葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌的抑菌活性。通過對比實驗表明四季桔不同部位精油，對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌)和革蘭氏陰性菌(鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌)都有抑制作用，且抑菌活性順序是桔葉精油＞青皮精油＞黃皮精油。四季桔桔葉精油對這4種菌的抑制作用都為極敏(26.76-32.20mm)；對金黃色葡萄桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度(mic)都為1.88μl/ml，對單增李斯特菌的mic為30μl/ml。青皮精油對大腸桿菌為極敏(22.76mm)，對金色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌為中敏(12.60-13.70mm)，對大腸桿菌的mic為60μl/ml，對金黃色葡萄桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌的mic都為240μl/ml。黃皮精油對單增李斯特菌為中敏(10.03mm)，對其他3種菌為低敏(7.53-9.13mm)；對四種菌的mic都大于240μl/ml。以上結(jié)果說明四季桔精油可作為一種天然植物抑菌劑開發(fā)應用，同時該提取工藝簡單，無其他添加劑或者成分，具有安全、有效、無毒、綠色環(huán)保等優(yōu)點。

附圖說明

圖1為四季桔精油對金色葡萄球菌的抑菌效果圖；

圖2為四季桔精油對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果圖；

圖3為四季桔精油對單增李斯特菌的抑菌效果圖；

圖4為四季桔精油對大腸桿菌的抑菌效果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術方法進行詳細介紹：

參看圖1～圖4，從左往右順序依次為桔葉、青皮、黃皮精油。

1.四季桔抑菌活性精油的制備

實施例1：一種具有抑菌活性的四季桔精油的制備方法，包括以下步驟：

步驟一：收集新鮮四季桔葉，洗凈，過蒸餾水，室溫下晾干，經(jīng)粉碎機得粉末900.110g。

步驟二：將桔葉粉末平均分為5份，分5次蒸餾，用水蒸汽蒸餾法在料液比1:3，溫度100℃，時間60min的條件下制備，得淡黃色透明精油2.535g，ρ葉＝.0.881g/ml，提取率為0.28％。四季桔精油提取率(％)＝(精油的質(zhì)量/原材料的質(zhì)量)×100％。

步驟三：采用濾紙片瓊脂擴散法，用無菌移液槍吸取10⁶cfu/ml的懸菌液200μl，在營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基平皿均勻涂布。取10μl四季桔桔葉精油輕輕吸附在滅菌濾紙片(6mm)上，將濾紙片輕放在含菌平皿后，37℃培養(yǎng)24h，觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小。以無菌蒸餾水為空白對照，青霉素g藥敏片做陽性對照。每組樣品做三組平行對照，取平均值。實驗結(jié)果詳見表1。精油對菌種的抑菌效果的判斷標準為：抑菌圈直徑大?。?mm沒有敏感抑菌作用，6-9mm低度敏感作用，10-14mm中度敏感抑制作用，15-20mm高度敏感抑制作用，＞20mm極度敏感抑制作用。

步驟四：采用微量肉湯稀釋法，首先配制一系列梯度濃度的四季桔桔葉精油溶液(1.88-480μl/ml)。向96孔板加入配制好的懸菌液和精油溶液各50μl，混合均勻，細菌的最終濃度為5×10⁵cfu/ml。以不接種菌液，不加精油溶液的液體培養(yǎng)基做空白對照，以接種相同數(shù)量菌液，不加精油溶液的液體培養(yǎng)基做為培養(yǎng)對照。每個樣品設置三次重復。96孔板37℃培養(yǎng)20h后觀察，記錄mic。實驗結(jié)果詳見表2。

實施例2：一種具有抑菌活性的四季桔精油的制備方法，包括以下步驟：

步驟一：收集新鮮四季桔青皮，洗凈，過蒸餾水，室溫下晾干，經(jīng)粉碎機后得粉末900.007g。

步驟二：將青皮粉末平均分為5份，分5次蒸餾，用水蒸汽蒸餾法在料液比1:3，溫度100℃，時間60min的條件下制備，得無色透明精油9.546g，ρ青皮＝0.817g/ml，提取率為1.06％。

步驟三：采用濾紙片瓊脂擴散法，用無菌移液槍吸取10⁶cfu/ml的懸菌液200μl，在營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基平皿均勻涂布。取10μl四季桔青皮精油輕輕吸附在滅菌濾紙片(6mm)上，將濾紙片輕放在含菌平皿后，37℃培養(yǎng)24h，觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小。以無菌蒸餾水為空白對照，青霉素g藥敏片做陽性對照。每組樣品做三組平行對照，取平均值。實驗結(jié)果詳見表1。

步驟四：采用微量肉湯稀釋法，首先配制一系列梯度濃度的四季桔青皮精油溶液(1.88-480μl/ml)。向96孔板加入配制好的懸菌液和精油溶液各50μl，混合均勻，細菌的最終濃度為5×10⁵cfu/ml。以不接種菌液，不加精油溶液的液體培養(yǎng)基做空白對照，以接種相同數(shù)量菌液，不加精油溶液的液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)對照。每個樣品設置三次重復。96孔板37℃培養(yǎng)20h后觀察，記錄mic。實驗結(jié)果詳見表2。

實施例3：一種具有抑菌活性的四季桔精油的制備方法，包括以下步驟：

步驟一：收集新鮮四季桔黃皮，洗凈，過蒸餾水，室溫下晾干，經(jīng)粉碎機得粉末900.108g。

步驟二：將黃皮粉末平均分為5份，分5次蒸餾，用水蒸汽蒸餾法在料液比1:3，溫度100℃，時間60min的條件下制備，得無色透明精油7.203g，ρ黃皮＝0.816g/ml，提取率為0.80％。

步驟三：采用濾紙片瓊脂擴散法，用無菌移液槍吸取10⁶cfu/ml的懸菌液200μl，在營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基平皿均勻涂布。取10μl四季桔黃皮精油輕輕吸附在滅菌濾紙片(6mm)上，將濾紙片輕放在含菌平皿后，37℃培養(yǎng)24h，觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小。以無菌蒸餾水為空白對照，青霉素g藥敏片做陽性對照。每組樣品做三組平行對照，取平均值。實驗結(jié)果詳見表1。

步驟四：采用微量肉湯稀釋法，首先配制一系列梯度濃度的四季桔黃皮精油溶液(1.88-480μl/ml)。向96孔板加入配制好的懸菌液和精油溶液各50μl，混合均勻，細菌的最終濃度為5×10⁵cfu/ml。以不接種菌液，不加精油溶液的液體培養(yǎng)基做空白對照，以接種相同數(shù)量菌液，不加精油溶液的液體培養(yǎng)基做為培養(yǎng)對照。每個樣品設置三次重復。96孔板37℃培養(yǎng)20h后觀察，記錄mic。實驗結(jié)果詳見表2。

實施例4：一種具有抑菌活性的四季桔精油的制備方法，包括以下步驟：

步驟一：收集新鮮四季桔黃皮洗凈，過蒸餾水，室溫下晾干，經(jīng)粉碎機后得粉末900.211g。

步驟二：將黃皮粉末平均分為5份，分5次蒸餾，用水蒸汽蒸餾法在料液比1:5，溫度100℃，每70min更換一次原料，5次蒸餾完成后得無色透明精油7.301g，ρ黃皮＝0.818g/ml，提取率為0.81％。

表1四季桔精油抑菌圈大小

注：同列數(shù)據(jù)肩標相同字母表示差異不顯著(p>0.05)，不同字母表示差異顯著(p<0.05)；敏感性的標準：≦6mm不敏，6-9mm低敏，10-14mm中敏，15-20mm高敏，＞20mm極敏。

表2四季桔精油最低抑菌濃度(μl/ml)

表1和表2均為四季桔精油對金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌和大腸桿菌抑菌效果和抑菌濃度的相關數(shù)據(jù)列舉。

2.四季桔精油的應用

應用例1：四季桔精油對水果的保鮮效果，包括以下步驟：

步驟一：選擇大小勻稱、新鮮的草莓作為保鮮實驗材料，清水洗凈，晾干，隨機分組，每300g分成一組，共四組。

步驟二：將四季桔桔葉、青皮、黃皮精油，用少量乙醇溶解，再加入適量吐溫80充分乳化，蒸餾水定容到20ml配制成精油保鮮液，使用時再用水將其稀釋至相應濃度。前三組分別放入3.0％四季桔桔葉、青皮、黃皮精油稀釋液中浸泡5min。第四組僅放入空白溶液中浸泡5min。草莓取出自然瀝干，放置在25±2℃室溫、空氣濕度為85％～90％的條件下貯存。經(jīng)過四季桔桔葉、青皮、黃皮精油處理后的草莓比第四組出現(xiàn)腐爛所延遲的天數(shù)分別為1.5天、1天、0.5天。

應用例2：四季桔精油對蔬菜的保鮮效果，包括以下步驟：

步驟一：選擇大小勻稱、新鮮的青菜作為保鮮實驗材料，去黃葉，清水洗凈，晾干，隨機分組，每200g分成一組，共四組。

步驟二：將四季桔桔葉、青皮、黃皮精油，用少量乙醇溶解，再加入適量吐溫80充分乳化，蒸餾水定容到20ml配制成精油保鮮液，使用時再用水將其稀釋至相應濃度。前三組分別放入3.0％四季桔桔葉、青皮、黃皮精油稀釋液中浸泡5min。第四組僅放入空白溶液中浸泡5min。青菜取出自然瀝干，放置在25±2℃室溫、空氣濕度為85％～90％的條件下貯存。經(jīng)過四季桔桔葉、青皮、黃皮精油處理后的青菜比第四組出現(xiàn)葉面發(fā)黃、腐爛所延遲的天數(shù)分別為4天、3天、1天。

應用例3：四季桔精油對肉類的防腐效果，包括以下步驟：

步驟一：用75％的酒精檫試案板、刀具、將新鮮鹵豬肉切成約50g左右的肉塊，隨機分組，每6塊分成一組，共四組。

步驟二：將四季桔桔葉、青皮、黃皮精油，用少量乙醇溶解，再加入適量吐溫80充分乳化，蒸餾水定容到20ml配制成精油保鮮液，使用時再用水將其稀釋至相應濃度。前三組分別放入3.0％四季桔桔葉、青皮、黃皮精油稀釋液中浸泡5min。第四組僅放入空白溶液中浸泡5min。將鹵肉取出自然瀝干，裝進滅菌的食品袋中，放置4±1℃下貯存。按照gb47892-2016法，測定細菌總數(shù)。根據(jù)《gb2726-2016食品安全國家標準熟肉制品》，實驗以菌落總數(shù)≥1×10⁵cfu/g作為鹵肉腐敗變質(zhì)的參考指標。經(jīng)過四季桔桔葉、青皮、黃皮精油處理后的鹵肉比第四組鹵肉菌落總數(shù)超標所延遲的天數(shù)分別為5天、3天、1天。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。