專(zhuān)利名稱(chēng)：乙肝疫苗的制備方法及其制品的制作方法
病毒性乙型肝炎是一種廣為流行的疾病。世界上乙肝病毒(HBV)攜帶者達(dá)2億以上，由乙肝或與乙肝有關(guān)的疾病導(dǎo)致的死亡人數(shù)巨大，對(duì)人類(lèi)的危害極大。
在某些HBV感染病人的血清中存在42nm的感染病毒顆粒，它由構(gòu)成病毒外殼的表面抗原(HBsAg)、病毒核心抗原(HBcAg)和病毒DNA組成。除了完整的病毒顆粒外，乙肝病人的血液中還存在著僅含HBsAg的，較小的，直徑為20至22nm的球狀顆粒和菅狀顆粒。HBsAg顆粒能誘導(dǎo)產(chǎn)生專(zhuān)一的抗體，使人體產(chǎn)生抵抗HBV感染的免疫力。但是，從血液中分離HBsAg顆粒的費(fèi)用昂貴，來(lái)源也有限，無(wú)法滿足HBV高發(fā)地區(qū)人們普遍接種需要。而且，血液中還存在著未知病因可能造成的不安全性，因此，人們正在積極研究通過(guò)其他途徑生產(chǎn)乙肝表面抗原。
HBsAg由三種不同大小的病毒外殼蛋白組成。它們由位相相同的連續(xù)編碼區(qū)編碼，但由不同的翻譯起始位點(diǎn)ATG起始。這三個(gè)蛋白是HBsAg主蛋白(或S蛋白)，含226個(gè)氨基酸，由HBsAg基因的S區(qū)編碼;少量的中分子蛋白(MS蛋白)，是在S蛋白的N端增加了55個(gè)氨基酸，含有281個(gè)氨基酸。這55個(gè)氨基酸是由基因preS2區(qū)編碼，并含有多聚人血清白蛋白(pHSA)受體;少量的大分子蛋白(LS蛋白)，由完整的表面抗原基因，即preS1、preS2和S區(qū)共同編碼，由約400個(gè)氨基酸組成。MS蛋白和LS蛋白主要存在于病毒顆粒的外殼及具有感染活性的病人血清的表面抗原顆粒中。
由于HBsAg顆?？墒谷梭w產(chǎn)生專(zhuān)一性的抗體，對(duì)病毒的感染起免疫作用，因此，其生物學(xué)特性以及在疫苗研制中的應(yīng)用引起人們廣泛的注意。絕大部分研究集中于S蛋白，但是，近年來(lái)對(duì)MS和LS蛋白也逐漸引起重視。MS和LS蛋白具有S蛋白所沒(méi)有的抗原決定簇，用它們作成化學(xué)合成疫苗或重組的乙肝疫苗，能使疫苗的效價(jià)提高(Milich，D.R.，etal.，Science228p1195-1199)。
痘苗病毒已被用來(lái)表達(dá)多種病毒的抗原，包括HBV。利用重組DNA技術(shù)，將所需表達(dá)的蛋白基因插入痘苗病毒，用所得到的重組痘苗病毒感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，使該蛋白基因得到表達(dá)。重組病毒本身可以用作活疫苗。另一方面，重組病毒可以在細(xì)胞中復(fù)制、表達(dá)，并可能分泌所需抗原而用作亞單位疫苗。
Cheng等(J.Virol，60，p337-344)描述了一個(gè)重組痘苗病毒的構(gòu)建。該重組病毒含有編碼大分子乙肝表面抗原(LS)的DNA順序，即完整的HBsAg基因，在一個(gè)痘苗病毒啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)。它們用重組痘苗感染CV-1細(xì)胞，雖然在細(xì)胞內(nèi)有LS蛋白的合成，但是，被感染的細(xì)胞顯然并不分泌LS蛋白。更明確的是Moss和Flexner(AnnualReview5p305-324)指出，HBsAg的大分子蛋白不能形成顆粒而分泌，而且，如果同時(shí)用兩個(gè)重組病毒感染細(xì)胞，LS甚至?xí)绊慔BsAg主蛋白的分泌。Paoletli等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.Vol.81，p193-197)對(duì)于使用重組痘苗病毒構(gòu)建預(yù)防乙肝和皰疹的潛在活疫苗進(jìn)行了描述。他們報(bào)導(dǎo)了乙肝表面抗原能夠合成并從感染的細(xì)胞中分泌出來(lái)，但是，沒(méi)有報(bào)導(dǎo)乙肝表面抗原的三種不同組分以及它們的分泌。在他們的工作中，帶有全表面抗原基因的重組痘苗病毒表達(dá)的HBsAg很低，經(jīng)RIA檢測(cè)，僅為只含主蛋白基因的重組病毒的幾千分之一。
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)能有效地阻斷乙肝病毒感染的新型重組疫苗。提供一個(gè)帶有完整的HBsAg基因的重組痘苗病毒。它能夠表達(dá)并分泌乙肝表面抗原顆粒，并含有乙肝表面抗原的所有三種組分，S、MS蛋白和LS蛋白。同時(shí)含有S、MS和LS的HBsAg的抗原性比僅含S的要強(qiáng)得多。它能在體內(nèi)迅速產(chǎn)生防止乙肝病毒感染所需要的全譜抗體，因而為發(fā)展高效、速效的乙肝疫苗提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明所提供的重組痘苗病毒也使人們可能獲得大量的S蛋白、MS蛋白和LS蛋白，制備新型的亞單位疫苗。
本發(fā)明也提供了制備一個(gè)能夠在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)并分泌含有HBsAg所有三種組分，S蛋白、MS蛋白和LS蛋白的乙肝表面抗原顆粒的重組痘苗病毒的方法，它包括1.選定一個(gè)低毒的痘苗病毒株。2.構(gòu)建一個(gè)含HBsAg序列和啟動(dòng)子序列的表達(dá)質(zhì)料。3.用選定的痘苗病毒感染細(xì)胞，并用構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以引起體內(nèi)重組，從而制備帶有某種外源抗原基因，如HBsAg基因的重組痘苗病毒。4.通過(guò)由某種表達(dá)質(zhì)粒引入的篩選標(biāo)記篩選含重組痘苗病毒的細(xì)胞。5.從所篩選到的細(xì)胞中回收重組痘苗病毒。
本發(fā)明的示意圖表簡(jiǎn)單說(shuō)明如下

圖1，通用載體質(zhì)粒pGJP-5構(gòu)建示意圖。
圖2，制備本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒pLS-1的示意圖。
圖3，通過(guò)痘苗病毒和pLS-1的重組，制備本發(fā)明的新型重組痘苗病毒的示意圖。
圖4，HBsAg蛋白電泳圖譜(A)，以及相應(yīng)的免疫印跡(Westernblot)圖譜(B)。
圖5，HBsAg顆粒的電子顯微鏡照片。
本發(fā)明的內(nèi)容具體描述如下。
我們采用已知的低毒痘苗病毒株，天壇株和廣9株。它們可以從中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部北京生物制品所和國(guó)家藥物和生物制品檢定所得到，其優(yōu)點(diǎn)是由此產(chǎn)生的重組痘苗病毒用作活疫苗時(shí)，其毒性非常低。
我們構(gòu)建了一個(gè)合適的表達(dá)質(zhì)粒。該質(zhì)粒除含有HBsAg和啟動(dòng)子序列外，還含有一個(gè)抗菌素抗性基因，如氨芐青霉素(Apr)抗性基因，在大腸桿菌中用含抗菌素的培養(yǎng)基可進(jìn)行該質(zhì)粒的篩選。除此以外，質(zhì)粒上還含有一個(gè)供體內(nèi)重組后篩選重組病毒的選擇標(biāo)記，它是一個(gè)失活的胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK-)，它與天然的TK基因很相似，所不同的是插入了外源基因。通過(guò)TK基因的同源順序與痘苗病毒基因組體內(nèi)重組，表達(dá)質(zhì)粒中HBsAg和啟動(dòng)子順序可以插到一痘苗病毒TK基因中，造成重組病毒中TK基因的插入滅活，于是重組病毒可通過(guò)TK的滅活而進(jìn)行篩選。
如圖1所示，質(zhì)粒pGJ-1是由已知質(zhì)粒載體pWR13和痘苗病毒廣9株DNA經(jīng)HindⅢ酶解后組建而成。pWR13含有氨芐基青霉素抗性基因(Apr)和一個(gè)包括HindⅢ位點(diǎn)在內(nèi)的多用接頭。所得質(zhì)粒pGJ-1含有痘苗病毒的TK基因和從pWR13來(lái)的Apr標(biāo)記。通過(guò)適當(dāng)?shù)拿盖泻瓦B接，去除pGJ-1中多余的順序，產(chǎn)生質(zhì)粒pGJ-2，它仍有TK順序和Apr標(biāo)記。pGJ-2進(jìn)一步改造，引入SalI接頭，形成pGJ-7。
另一部分pWR13通過(guò)SalI酶切并和質(zhì)粒pVC-1連接。質(zhì)粒pVC-1有一個(gè)痘苗P7.5啟動(dòng)子，是用來(lái)調(diào)控HBsAg基因表達(dá)的。P7.5只是用于此目的的一組啟動(dòng)子中的一個(gè)。P7.5順序很容易用SalI從pVC-1中切出并插入pWR13的多用接頭，由此產(chǎn)生質(zhì)粒pWR/VC1-22。
使用pGJ-7和pWR/VC1-22的SalI和EcoRI位點(diǎn)，這兩個(gè)質(zhì)粒連接而成通用載體質(zhì)粒pGJP-5。在pGJP-5中，從pWR/VC1-22來(lái)的P7.5順序插入到pGJ-7的TK順序中，造成TK基因的插入滅活。載體質(zhì)粒pGJP-5仍保持APr標(biāo)記。
如圖2所示，本發(fā)明使用載體質(zhì)粒pGJP-5構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pLS-1。構(gòu)建pLS-1的另一起始材料是已知質(zhì)粒pADR-1，它含有完整的HBsAg順序。圖2中以S、pS2、pS1表示。這一質(zhì)粒也具有各種酶切位點(diǎn)和Apr標(biāo)記。首先，我們?cè)趐ADR-1的HBsAg序列上游引入一個(gè)BamHI酶切位點(diǎn)，把它改造成pADR-2B。然后，將HBsAg序列從pADR-2B中切出并與pGJP-5連接而成pLS-1。如圖2所示，pLS-1有從pGJP-5來(lái)的啟動(dòng)子序列P7.5，它們于HBsAg序列的上游，與HBsAg同方向，并且P7.5和HBsAg序列均插入TK基因內(nèi)。因此，質(zhì)粒pLS-1是TK-的，但是能在細(xì)胞中表達(dá)HBsAg。TK-為與痘苗病毒進(jìn)行體內(nèi)重組提供了有用的篩選標(biāo)記。質(zhì)粒中被阻斷的TK序列與未改造的TK基因有很大的同源性，可以進(jìn)行體內(nèi)重組。
本發(fā)明的這一新型痘苗病毒可以通過(guò)用表達(dá)質(zhì)粒pLS-1轉(zhuǎn)染經(jīng)正常痘苗病毒感染的細(xì)胞，使痘苗病毒和pLS-1進(jìn)行體內(nèi)重組而制備。如前所述，本發(fā)明使用低毒性的痘苗病毒株，廣9株和天壇株。特別需要指出的是我們使用了原代細(xì)胞，如原代雞胚細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。相對(duì)傳代細(xì)胞而言，使用原代細(xì)胞能夠生產(chǎn)更純的活疫苗以及亞單位疫苗。因?yàn)樗苊饬舜嬖谟趥鞔?xì)胞中的雜質(zhì)的污染。
圖3是制備重組痘苗病毒的圖解。將質(zhì)粒pLS-1和痘苗病毒廣9株或天壇株(Ⅰ)引入雞胚細(xì)胞(Ⅱ)。pLS-1的被阻斷的TK順序(Ⅲ)和病毒(Ⅰ)的完整TK順序顯示了相互的親和力而彼此相接觸。在極少數(shù)情況下質(zhì)粒和病毒的TK順序通過(guò)重組過(guò)程發(fā)生交換，由此產(chǎn)生少量的重組痘苗病毒(Ⅳ)，其特點(diǎn)是具有被阻斷的，不工作的TK順序，同時(shí)，它含有完整的HBsAg基因和調(diào)控HBsAg表達(dá)的啟動(dòng)子。重組病毒(Ⅳ)可以通過(guò)TK-的特征進(jìn)行篩選，并且進(jìn)行繁殖以獲得大量的病毒而作為活疫苗使用。HBsAg的所有三種成分，S、MS和LS蛋白均能得到表達(dá)并能形成顆粒從細(xì)胞中分泌，為生產(chǎn)高效的乙肝疫苗提供了新的途徑。
本發(fā)明的內(nèi)容在以下的實(shí)施例具體敘述。
實(shí)施例1，材料與方法a.DNA聚合酶ⅠKlenow片段為Boehringer產(chǎn)品;內(nèi)切酶BstEⅡ?yàn)锽iolabs產(chǎn)品;低熔點(diǎn)瓊脂糖和BamHI接頭是B.R.L產(chǎn)品;其它限制性?xún)?nèi)切酶和T4DNA連接酶由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所酶制劑小組提供。
b.胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因缺陷型細(xì)胞Human TK-143細(xì)胞由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院B.Moss博士提供，在含25ug/ml 5-溴脫氧尿苷(BUdR)和5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng);痘苗病毒天壇株由衛(wèi)生部北京生物制品所提供，痘苗病毒廣9株由中華人民共和國(guó)中國(guó)藥品和生物制品檢定所提供，它們?cè)谠u胚細(xì)胞(CEC)中繁殖。原代雞胚細(xì)胞用10日齡雞胚制備，在含10%小牛血清的DMEM中培養(yǎng)。
c.細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。CEC細(xì)胞用痘苗病毒天壇株感染，兩小時(shí)后用磷酸鈣共沉淀的DNA(含有10ug質(zhì)粒DNA和15ug魚(yú)精DNA)轉(zhuǎn)染。37℃保溫4-6小時(shí)后加入新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后收獲細(xì)胞。
d.DNA的分離純化。痘苗病毒DNA按照Espostto的方法(文獻(xiàn)1)直接從被感染的細(xì)胞中分離;質(zhì)粒DNA用堿變性的方法，經(jīng)Sepharose2B柱純化(文獻(xiàn)5)。
e.質(zhì)粒DNA的構(gòu)建。通用載體質(zhì)粒pGJP-5由痘苗病毒廣9株組建而成(見(jiàn)吳雪等《生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)》(1987)19p397-405)。pADR-1為含有乙肝病毒adr亞型全基因組的克隆(見(jiàn)吳祥甫等《中國(guó)科學(xué)》(B輯)(1983)26p162-167)。為構(gòu)建新的質(zhì)粒pADR-2B和pLS-1，DNA用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶切開(kāi)，并用T4DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。構(gòu)建pADR-2B時(shí)，受體菌選用E.coliHB101。構(gòu)建pLS-1時(shí)，受體菌選用E.coliJM83。
f.重組病毒的篩選。TK-重組病毒按照Weir等的方法(文獻(xiàn)3)，通過(guò)BUdR存在下的選擇性空斑分析篩選。
g.HBsAg的測(cè)定。HBsAg的表達(dá)用AUSRIA藥盒(Abbott公司產(chǎn)品)測(cè)定，并使用西德Paul-Ehrlich-Institut提供的參比標(biāo)準(zhǔn)。
h.多肽組成分析。SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)按照Laemmli的方法進(jìn)行(文獻(xiàn)4)，用銀染法顯色。免疫印跡法(Westernblot)按文獻(xiàn)[5]描述的方法進(jìn)行。
i.用酶聯(lián)免疫分析測(cè)定preS1和preS2。蛋白樣品吸附于用抗preS1(MA18/7)或抗preS2(Q19/10)單克隆抗體包被的微量點(diǎn)滴板上，然后用酶聯(lián)的抗S抗體處理。有關(guān)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。單抗由西德W.H.Gerlich博士提供;多聚人血清白蛋白(pHSA)受體的測(cè)定按文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行。
我們分步描述實(shí)施的具體步驟。
(1)表達(dá)質(zhì)粒pLS-1的制備和構(gòu)建第一步是構(gòu)建通用載體pGJP-5，圖1為其構(gòu)建過(guò)程。第二步是制備表達(dá)質(zhì)粒pLS-1，圖2為其制備過(guò)程。
(a)通用載體質(zhì)粒pGJP-5的制備(圖1)。
將低毒的痘苗病毒廣9株用HindⅢ酶切。HindⅢ-J片段克隆至pWR13質(zhì)粒，產(chǎn)生pGJ-1。pGJ-1有兩個(gè)EcoRⅠ切點(diǎn)，一個(gè)位于pWR13部分，另一個(gè)在廣9的HindⅢ-J片段中。去除pWR13上的EcoRⅠ切點(diǎn)和廣9-DNA上TK基因以外的部分序列，得到pGJ-2。然后，將pGJ-2上與EcoRⅠ切點(diǎn)相鄰的ClaⅠ切點(diǎn)改為SalⅠ切點(diǎn)，得到pGJ-7。將7.5K痘苗蛋白的啟動(dòng)基因P7.5插入pGJ-7中TK基因的EcoRⅠ和SalⅠ切之間，便構(gòu)成pGJP-5.
(b)表達(dá)質(zhì)粒pLS-1的制備(圖2)。
通用載體質(zhì)粒pGJP-5含有痘苗TK基因，啟動(dòng)子p7.5(7.5K痘苗蛋白的啟動(dòng)子)和多用接頭。TK基因順序?yàn)橘|(zhì)粒和痘苗病毒DNA進(jìn)行體內(nèi)重組提供了同源順序和篩選標(biāo)記。HBsAg基因從pADR-1中克隆的HBV基因組(adr亞型)得來(lái)。將pADR-1中preS區(qū)的BstEⅡ酶切位點(diǎn)被轉(zhuǎn)變成BamHⅠ切點(diǎn)。由此產(chǎn)生的pADR-2B有兩個(gè)BamHⅠ酶切位點(diǎn)，一個(gè)在HBsAg的LS蛋白的上游，另一個(gè)在其下游。用BamHⅠ酶切出1.8Kb完整的HBsAg基因片段，將這一片段插入載體質(zhì)粒pGJP-5中多用接頭的BamHⅠ位點(diǎn)，通過(guò)原位雜交篩選，得到含有HBsAgLS蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒pLS-1。
(2)表達(dá)質(zhì)粒pLS-1的分析。
通用載體質(zhì)粒pGJP-5是4.5Kb。表達(dá)質(zhì)粒pLS-1中插入了1.8Kb的HBsAg基因片段而變?yōu)?.3Kb。質(zhì)粒pGJP-5有單一的BamHⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ位點(diǎn)，因此，用這些酶中任意一個(gè)酶切均產(chǎn)生單一的4.5Kb條帶。在插入的HBsAg基因片段中，有單一的BamHⅠ、HindⅢ和XhoⅠ切點(diǎn)，但沒(méi)有EcoRⅠ切點(diǎn)。因此pLS-1經(jīng)EcoRⅠ酶切仍舊給出一個(gè)單一條帶，其長(zhǎng)度為6.3Kb，載體部分貢獻(xiàn)4.5Kb，HBsAg基因插入片段貢獻(xiàn)1.8Kb。
在pGJP-5中，HindⅢ切點(diǎn)位于P7.5上游，它與BamHⅠ位點(diǎn)相距0.9Kb。在HBsAg基因片段中，HindⅢ位點(diǎn)在S區(qū)下游，距preS區(qū)上游的BamHⅠ位點(diǎn)1.5Kb，距下游的BamHⅠ位點(diǎn)0.3Kb。用HindⅢ酶解得到的小片段是2.4Kb，而不是1.2Kb，說(shuō)明插入的HBsAg基因和啟動(dòng)子P7.5方向是一致的。
在pLS-1中XhoⅠ切點(diǎn)位于preS2區(qū)，靠近S區(qū)，而載體質(zhì)粒pGJP-5上無(wú)XhoⅠ切點(diǎn)。pLS-1用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶解，1.8Kb的BamHⅠ酶解片段消失，產(chǎn)生0.5kb和1.3kb兩個(gè)片段。0.5Kb片段含preS區(qū)，1.3kb片段含S區(qū)。
(3)重組痘苗病毒vTLS-1的構(gòu)建和分析。
重組痘苗病毒通過(guò)體內(nèi)重組構(gòu)建。原代雞胚細(xì)胞(CEC)用痘苗病毒天壇株感染2小時(shí)以后，用磷酸鈣沉淀的pLS-1轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后收獲細(xì)胞，篩選重組病毒。在pLS-1中，P7.5和HBsAg基因是插在痘苗病毒TK基因中的，因而，破壞了TK基因的活性，所以重組痘苗病毒是TK-。使用人TK-143細(xì)胞，可以通過(guò)BUdR存在下的空斑篩選將TK-重組病毒篩選出來(lái)。通過(guò)進(jìn)一步的純化和篩選，得到重組痘苗病毒pLS-1。
我們還使用了32P標(biāo)記的，分別含S和preS的DNA片段作為探針，用DNA點(diǎn)雜交的方法對(duì)重組病毒vTLS-1進(jìn)行了分析。
(4)測(cè)定vTLS-1的HBsAg表達(dá)。
我們用放射免疫法測(cè)定了vTLS-1在人TK-143細(xì)胞中HBsAg的表達(dá)。用每個(gè)細(xì)胞0.1PFU(空斑形成單位)病毒感染3X106人TK-143細(xì)胞48小時(shí)，表達(dá)的HBsAg總量為2.1ug，其中1.8ug在培養(yǎng)液中，僅0.3ug在細(xì)胞中。
使用同樣的方法我們測(cè)定了vTLS-1在人TK-143細(xì)胞表達(dá)的時(shí)間關(guān)系。用1X105人TK-143細(xì)胞，2小時(shí)后去除上清液，加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。每隔12小時(shí)收集培養(yǎng)液和細(xì)胞，并測(cè)定HBsAg，得到的時(shí)間曲線顯示在感染后48小時(shí)內(nèi)HBsAg逐漸增加，48小時(shí)后飽和。
(5)vTLS-1表達(dá)的性質(zhì)。
由于在vTLS-1中HBsAg基因的編碼框架中有三個(gè)不同的翻譯起始位點(diǎn)，因此，用RIA測(cè)定的HBsAg表達(dá)產(chǎn)物中可能有不止一種組分。
為了進(jìn)一步分析vTLS-1在人TK-143細(xì)胞中所表達(dá)的HBsAg的多肽組成，我們進(jìn)行了蛋白產(chǎn)物的電泳分析。細(xì)胞用0.1PFU病毒感染，48小時(shí)后收集上清液，1，600rpm離心去除病毒顆粒。上清液中的HBsAg用聯(lián)有抗S的單抗IgG的Sepharose 4B親和層析柱純化。SDS-聚丙烯酰胺電泳，銀染法染色。蛋白電泳給出24K、27K和30-42K三條蛋白條帶(圖4A)。24K為S蛋白，27K為S蛋白的糖苷化產(chǎn)物，30-42K為較大的蛋白。較大的蛋白是彌散性的，它可能是由于不同的糖化程度，可也能是純化過(guò)程中S顆粒有不同程度的降解。
我們進(jìn)一步用Western blot(免疫印跡法)鑒定了這些HBsAg組分。SDS-PAGE電泳后，蛋白條帶被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與抗S抗體反應(yīng)，然后與125Ⅰ標(biāo)記的protein A(A蛋白)雜交，放射自顯影(圖4B)。Western blot的結(jié)果與蛋白電泳的結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明了這三條蛋白條帶是HBsAg的組分。vTLS-1的表達(dá)產(chǎn)物能很好地與抗preS1(MA 18/7)和抗preS2(Q19/10)單克隆抗體反應(yīng)，也說(shuō)明了vTLS-1表達(dá)產(chǎn)物中有較大的蛋白存在，它們能從人TK-143細(xì)胞中分泌出來(lái)。同時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物顯示了pHSA(多聚人清白蛋白)受體活性，這一活性是由產(chǎn)物蛋白的preS2區(qū)提供的，這些結(jié)果列于下面的表1。
表1.vTLS-1表達(dá)的HBsAg性質(zhì)preS1apreS2bpHSA受體vTLS-1 1.96C1.60 ＞2.05vTH-2d0.30 0.31 0.20注HBsAg的vTLS-1感染的人TK-143細(xì)胞的培養(yǎng)液中純化，用ELISA方法研究。
a.使用對(duì)preS1專(zhuān)一的單克隆抗體MA18/7b.使用對(duì)preS2專(zhuān)一的單克隆抗體Q19/10c.ELISA用測(cè)量O.D490測(cè)定，O.D.490＜0.4為負(fù)值d.TH-2是由天壇株構(gòu)建的，只含HBsAg主蛋白的重組痘苗病毒，表中用作對(duì)照。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們已經(jīng)成功地構(gòu)建了含有完整的HBsAg基因的重組痘苗病毒，用它感染人TK-143細(xì)胞后，能夠產(chǎn)生并分泌HBsAg所有三種組分，即S、preS2和preS1蛋白。用抗preS1單克隆抗體所做的免疫分析證明preS1蛋白抗原決定簇能分泌到培養(yǎng)液中，HBsAg產(chǎn)物的preS2組分保持了pHSA受體活性以及與抗preS2單克隆抗體反應(yīng)的能力。
在我們的實(shí)驗(yàn)中，vTLS-1感染人TK-143細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物，包括全組分HBsAg，即S、MS和LS蛋白，并能形成均一的顆粒。
從vTLS-1感染的人TK-143細(xì)胞培養(yǎng)液中收集到的分泌型顆粒能在電子顯微鏡下看到(圖5)，并由以下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)。首先，我們進(jìn)行了CsCl密度梯度超離心，用測(cè)定pHSA受體的方法檢測(cè)顆粒的分布，測(cè)得顆粒的密度為1.26g/ml，比主S顆粒的密度略大。其次，我們用放射免疫法(RIA)檢測(cè)到HBsAg的有效表達(dá)，只有顆粒狀的HBsAg才能被RIA法檢出。同樣用ELISA夾心法檢測(cè)preS1和preS2，也只有顆粒狀的樣品才能被測(cè)出。
HBsAg顆粒的形成對(duì)乙肝亞單位疫苗是十分重要的，因?yàn)?，顆粒狀的HBsAg的免疫原性比HBsAg抗原單體強(qiáng)三個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，分泌型全組分HBsAg顆粒提供了生產(chǎn)新型亞單位疫苗的途徑。這樣的新型疫苗將產(chǎn)生全譜的抗HBsAg抗體，將有更強(qiáng)的免疫性。
HBsAg的LS蛋白的preS區(qū)具有重要的生物學(xué)特性。HBsAg的preS區(qū)比S區(qū)有更強(qiáng)的抗原性，它能更快地刺激免疫原性的產(chǎn)生，而且，在某些急性乙肝病人的血清中有較高比例的LS蛋白，LS蛋白的preS區(qū)還參與病毒對(duì)肝細(xì)胞的侵襲，它還在病毒顆粒的組裝過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。因此，對(duì)LS蛋白的研究不僅能為制備乙肝疫苗服務(wù)，而且為乙肝的診斷及治療提供新的方向。重組痘苗病毒vTLS-1的成功構(gòu)建和表達(dá)使我們能夠獲得大量含有完整的preS區(qū)的HBsAgLS蛋白，為進(jìn)一步研究LS蛋白的生物學(xué)特性提供了材料，同時(shí)，也提供了制備新型乙肝活疫苗和亞單位疫苗的新途徑。
(6)痘苗病毒株的毒性測(cè)定對(duì)各種痘苗病毒在小鼠中的LD50以及達(dá)到LD50的空斑數(shù)用常規(guī)方法進(jìn)行了測(cè)定。Cheng等所用的WR株以及低毒的廣9株的毒性列于表2。
表2、痘苗病毒株的毒性測(cè)定病毒株 PFU/ML LD50 達(dá)到LD50的空斑數(shù)WR 1.4X108＞5.40 ＜17廣9 1.5X1082.90 5692注天壇株的LD50未平行測(cè)定，它與廣9株相似。
參考文獻(xiàn)1.Espostto，J.etal.，“ThePreparationoforthopoxvirusDNA”，J.Virol.Meth.，(1980)，2，175.
2.Birnboim，H.C.andJ.Doly，“ARapidAlkalineExtractionProcedureforScreening.RecombinantPlasmidDNA”，NucleicAcidsResearch，(1979)，7，1513.
3.Weir，J.P.etal.，“MappingoftheVacciniaVirusThymidineKinaseGenebyMarkerRescueandbyCellFreeTraslationofSelectedmRNA”，Proc.Natl.Acd.Sci.U.S.A.，(1982)，79，1210.
4.Laemmli，U.K.etal.，“CleavageofStructuralProteinsduringtheAssemblyoftheHeadofBacteriophageT4”，Nature，(1970)，227，680.
5.汪垣等，“帶有乙型肝炎表面抗原基因的重組痘苗病毒”中國(guó)科學(xué)B輯(1986)29p.6236.Marquardt，O.etal.，“Cell-typeDependentExpressionandSecretionofHepatitisBVirusPreS1SurfaceAntigen”，PostgraduateMedicalJ.(1987)63(supp1.2)，41.
7.陸選永等，“乙型肝炎病毒顆粒與白蛋白受體關(guān)系的研究”上海醫(yī)學(xué)(1986)9，p219-2228.吳雪等，“痘苗病毒通用載體pGJP-5的組建”生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)(1987)19，p.39權(quán)利要求
1.一種能有效地阻斷乙肝病毒感染的疫苗制備方法以及它的制品，其特征在于是通過(guò)重組痘苗病毒來(lái)完成，重組病毒具有完整的HBsAg基因，以顆粒的形式表達(dá)并分泌乙肝表面抗原，產(chǎn)物同時(shí)含有S、MS、和LS三種蛋白組分。因此，可發(fā)展成為新型的活疫苗以及新型的亞單位疫苗的制備方法和制品。
2.權(quán)利要求1中的重組痘苗病毒，其特征在于來(lái)自經(jīng)選擇的低毒性的痘苗病毒株。
3.權(quán)利要求2中構(gòu)建重組痘苗病毒的低毒株，其特征在于廣9株和天壇株。
4.權(quán)利要求3中的重組痘苗病毒的低毒株，其特征在于在活細(xì)胞中構(gòu)建，是痘苗病毒與帶有完整的HBsAg順序和適當(dāng)?shù)膯?dòng)子的表達(dá)質(zhì)粒發(fā)生重組構(gòu)成，HBsAg順序和啟動(dòng)子是插在一段供體內(nèi)重組用的，質(zhì)粒和病毒共有的痘苗DNA順序中，通過(guò)篩選最后得到重組病毒。
5.權(quán)利要求4中的重組痘苗病毒構(gòu)建時(shí)，其特征在于進(jìn)行體內(nèi)重組用的細(xì)胞為原代細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5中構(gòu)建重組痘苗病毒所用的原代細(xì)胞，其特征在于細(xì)胞為原代雞胚細(xì)胞。
7.權(quán)利要求4中的重組痘苗病毒，其特征在于所用的表達(dá)質(zhì)粒含有完整的HBsAg順序和調(diào)控其表達(dá)的啟動(dòng)子，它們插在載體質(zhì)粒的TK順序中，因此，重組痘苗病毒具有TK-的特征，這一特征可用作重組痘苗病毒的篩選標(biāo)記。
8.權(quán)利要求7中的重組痘苗病毒，其特征在于所用的表達(dá)質(zhì)粒為pLS-1。
全文摘要
本發(fā)明是一個(gè)基團(tuán)工程技術(shù)生產(chǎn)新型乙肝疫苗的方法以及它的制品。通過(guò)構(gòu)建一能有效阻斷乙肝感染的重組痘苗病毒，使該病毒帶有完整的HBsAg基團(tuán)，能表達(dá)乙肝表面抗原，產(chǎn)物同時(shí)具有HBsAg三個(gè)組分，即主蛋白、中分子蛋白和大分子蛋白，并能形成可分泌的顆粒。這個(gè)重組病毒技術(shù)可以用于制備新型乙肝活疫苗，也可用于生產(chǎn)分泌型全組分HBsAg顆粒。
文檔編號(hào)C12N15/39GK1042564SQ8810560
公開(kāi)日1990年5月30日 申請(qǐng)日期1988年11月11日 優(yōu)先權(quán)日1988年11月11日
發(fā)明者李載平, 汪垣 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所