專利名稱：酰基氨基酸外消旋酶，其生產(chǎn)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酰基氨基酸外消旋酶，其生產(chǎn)方法及應(yīng)用。
使旋光N-?；?α-氨基羧酸(下文簡(jiǎn)稱Nα-酰基氨基酸)外消旋成為非旋光DL-N-酰基氨基酸的反應(yīng)是用于生產(chǎn)旋光氨基酸的主要反應(yīng)。
經(jīng)旋光Nα-?；被岬耐庀饔蒙a(chǎn)DL-Nα-酰基氨基酸的已知方法限于在嚴(yán)格條件下的物理學(xué)和化學(xué)方法，例如，在乙酸中將原料與較低當(dāng)量數(shù)的乙酐一起加熱的方法[Biochem.Z.，203，280(1929)]、在室溫下將原料加大量乙酐處理的方法[J.Am.Chem.Soc.，54，1630(1932)]、在磷酸三酯或低級(jí)脂肪酸等溶劑中加熱原料的方法[日本已公告專利申請(qǐng)No.18402/1976]、于大約160℃在氮?dú)饬髦兄苯蛹訜嵝釴α-?；被岬姆椒╗日本已公開(kāi)未審查專利申請(qǐng)No.126058/1986]以及在芳香烴存在下將原料連同催化量脫水劑一起加熱到130℃以上的方法[日本已公開(kāi)未審查專利申請(qǐng)No.165354/1986]。
已使用D-Nα-酰基氨基酸的外消旋作用與酰化氨基酸水解酶結(jié)合以生產(chǎn)旋光L-α-氨基酸。因此，借助?；被崴饷傅拇呋饔茫箖r(jià)格便宜的原料DL-Nα-?；被徂D(zhuǎn)化為L(zhǎng)-α-氨基酸和D-Nα-酰基氨基酸，并基于物理性質(zhì)的差異將兩者分離開(kāi)。然后應(yīng)用任何一種物理或化學(xué)消旋方法將D-Nα-?；被徂D(zhuǎn)化成原料DL-Nα-?；被?，并再次用酰化氨基酸水解酶處理之。如此反復(fù)進(jìn)行這一操作，即可使原料DL-Nα-?；被嵬耆D(zhuǎn)化成旋光的L-α-氨基酸。但這一方法具有一個(gè)重要缺點(diǎn)，即使用?；被崴饷柑幚砗箜毥?jīng)一分離程序以使L-α-氨基酸與N-?；被岜舜朔蛛x開(kāi)。另外，在以固態(tài)形式分離后，還必須在嚴(yán)格的物理或化學(xué)條件下完成D-Nα-酰基氨基酸的外消旋過(guò)程。
如果能在一種旋光氨基酸存在下，于?；被崴饷覆槐皇Щ畹臈l件下(如在常壓室溫下，近于中性水溶液中)單單選擇性地使D-Nα-?；被嵬瓿蛇@種消旋作用，這一選擇性消旋作用即可與?；被崴饷竻f(xié)同作用，不經(jīng)分離程序使原料DL-Nα-?；被嵋詥我徊襟E100%轉(zhuǎn)化為預(yù)期產(chǎn)物L(fēng)-α-氨基酸。這樣將有可能省去現(xiàn)有技術(shù)中必不可少的分離和外消旋程序，并可大大提高旋光氨基酸之生產(chǎn)工藝的效率。
然而，在現(xiàn)有技術(shù)的任何工藝條件下均不可能實(shí)現(xiàn)選擇性外消旋作用。一種可能的辦法是得到一種具有選擇性作用酶或外消旋劑，以使之僅對(duì)旋光Nα-?；被崞鹱饔枚鴮?duì)相應(yīng)的旋光α-氨基酸則不起作用，但迄今尚未找到表現(xiàn)有這樣一種催化作用的酶或外消旋劑。已知有一類稱為氨基酸外消旋酶的酶，其對(duì)Nα-?；被岵黄鹱饔?，但可使旋光α-氨基酸產(chǎn)生外消旋作用[如見(jiàn)Biochem.Biophys.Res.Comm.，35，363(1969)]，但有證據(jù)表明這些氨基酸外消旋酶并不適用于這一目的。
本發(fā)明人對(duì)此進(jìn)行了研究，第一次證明有一種天然存在的酶，其對(duì)旋光氨基酸沒(méi)有作用，但可作用于旋光Nα-?；被崾怪D(zhuǎn)化為相應(yīng)的對(duì)映體，已將該酶定名為?；被嵬庀?。本發(fā)明人進(jìn)一步研究并建立了使用?；被嵬庀赣蒁L-Nα-?；被嵘a(chǎn)旋光α-氨基酸的方法。
因此，本發(fā)明涉及一種具有下列性質(zhì)的?；被嵬庀?1)將D-Nα-?；被徂D(zhuǎn)化為相應(yīng)的L-Nα-酰基氨基酸，
(2)將L-Nα-?；被徂D(zhuǎn)化為相應(yīng)的D-Nα-?；被?，(3)不能將D-α-氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的L-α-氨基酸，(4)不能將L-α-氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的D-α-氨基酸;
一種生產(chǎn)?；被嵬庀傅姆椒?，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生上述酶的微生物以在培養(yǎng)液積聚上述的酶并收獲之;以及一種生產(chǎn)旋光D-或L-氨基酸的方法，該方法包括于D或L-?；被崴饷复嬖谙率笵L-Nα-酰基氨基酸與酰基氨基酸外消旋酶接觸。
就上述Nα-?；被岷挺?氨基酸來(lái)說(shuō)，α-氨基酸可以是天然的或非天然的。另外，α-氨基酸可以是中性的、堿性的或酸性的。
例如，上述Nα-?；被峥捎孟铝薪Y(jié)構(gòu)通式來(lái)表示
其中X是羧酸衍生的?；?，其可以是被取代的，R是可被取代的C1-20烷基。
Nα-酰基氨基酸的?；鶊F(tuán)(X)包括羧酸?；缤轷；?、苯甲酰基和芳基烷?；?。這些?；芍辽儆幸粋€(gè)取代基(如囟素、C1-3烷基、C1-3烷氧基、硝基)。烷?；睦影–1-3烷?；缂柞；?、乙?；?、丙酰基和氯代乙?；１郊柞；睦影ū郊柞；蛯?duì)位氯代苯甲?；７蓟轷；睦影ū交?C1-3烷?；绫交阴；捅交；?。
另外，式(Ⅰ)中R可以是直鏈或分枝鏈的C1-6烷基、用羥基、C1-3烷硫基、硫羥基、苯基、羥苯基或吲哚基取代的C1-3烷基，或用氨基、羧基、胍基或咪唑基取代的C1-4烷基。
可按下面討論的方法找到?；被嵬庀干a(chǎn)微生物，用標(biāo)準(zhǔn)方法(必要時(shí)向培養(yǎng)基內(nèi)加入一種可誘導(dǎo)所說(shuō)的酶或促進(jìn)所說(shuō)的酶產(chǎn)生的化合物，如一種適用于該酶的底物或金屬鹽)培養(yǎng)自天然來(lái)源分離的或自保藏機(jī)構(gòu)得到的微生物;由各所得培養(yǎng)物中收獲細(xì)胞;用緩沖液等洗滌細(xì)胞后，必要時(shí)將細(xì)胞懸浮于含有適量N-乙酰基-D-蛋氨酸和硫酸鎂的磷酸鹽緩沖溶液(pH7)中;將懸液于30℃振蕩過(guò)夜以使之反應(yīng)。由反應(yīng)液中除去細(xì)胞后，向上清液中加入給定量的L-?；被崴饷?，且必要時(shí)加入氯化鈷，并使反應(yīng)于37℃進(jìn)行幾小時(shí)，然后對(duì)反應(yīng)混合物作薄層層析(TLC，正丁醇∶乙酸∶水＝3∶1∶1)。選擇經(jīng)茚三酮反應(yīng)顯現(xiàn)蛋氨酸斑點(diǎn)的反應(yīng)溶液，然后通過(guò)茚三酮反應(yīng)和/或高效液相層析法檢測(cè)其中蛋氨酸含量。向呈現(xiàn)蛋氨酸陽(yáng)性反應(yīng)的培養(yǎng)液內(nèi)加入D-氨基酸氧化酶溶液，并使反應(yīng)于30℃進(jìn)行20小時(shí)以分解D-蛋氨酸，然后再次對(duì)各反應(yīng)混合物作茚三酮反應(yīng)、高效液相層析和/或使用乳酸片球菌ATCC8042作生物檢測(cè)[J.Biol.Chem.，177，533(1949)]，以測(cè)定反應(yīng)混合物中殘留的蛋氨酸(即L-蛋氨酸)。這些在反應(yīng)液中有一定量L-蛋氨酸的菌株能夠自N-乙酰基-D-蛋氨酸產(chǎn)生L-蛋氨酸，它們就一定能產(chǎn)生酰基氨基酸外消旋酶和/或氨基酸外消旋酶。
然后使用如上述的同樣條件再次培養(yǎng)L-蛋氨酸陽(yáng)性菌株并制備細(xì)胞懸液。向各懸液內(nèi)加入L-蛋氨酸以代替N-乙?；?D-蛋氨酸，并以上述的同樣方式進(jìn)行反應(yīng)。除去細(xì)胞后，使用D-氨基酸氧化酶、過(guò)氧化物酶、苯酚和4-氨基-氨替比林以比色法[Clin.Chem.，20，470(1974)]檢測(cè)反應(yīng)混合物中D-蛋氨酸量，并選擇D-蛋氨酸陰性菌株。
另外可用D-Nα-?；被岽鍺-乙酰基-D-蛋氨酸。這樣經(jīng)選擇不表現(xiàn)氨基酸外消旋酶活性并可由D-Nα-酰基氨基酸產(chǎn)生相應(yīng)L-α-氨基酸的菌株，即可得到酰基氨基酸外消旋酶生產(chǎn)微生物。
表1中列出了已用這一方法找到的N-?；被嵬庀干a(chǎn)微生物。
雖然表1中列出的?；被嵬庀干a(chǎn)微生物均出乎預(yù)料地屬于放線菌屬，任何微生物，無(wú)論是放線菌、細(xì)菌、真菌、酵母還是磨菇，只要依上述方法檢測(cè)證明其為酰基氨基酸外消旋酶生產(chǎn)微生物，都可用于本發(fā)明。
下面給出了由Arashiyama(Kyoto，Japan)的土壤中分離的?；被嵬庀干a(chǎn)微生物的微生物學(xué)特征。
(a)形態(tài)學(xué)攜帶孢子的菌絲顯示總狀分枝式，并形成鉤、環(huán)或少見(jiàn)的原始螺旋(2或3圈)[Retinaculum-Apertum(RA)]。成熟孢子鏈每個(gè)鏈有10個(gè)以上孢子且孢子均顯示為有平滑表面的圓柱形(0.7至0.9×1.1至1.5μm)。未觀察到游動(dòng)元件、特異器官或結(jié)構(gòu)。該菌株具有LL-二氨基庚二酸作為細(xì)胞壁成分并且沒(méi)有特征性糖(Ⅰ型細(xì)胞壁)。
(b)培養(yǎng)特征表2中顯示了Y-53菌株在各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征。表2中給出的顏色是使之與“ColorHarmonyManual”(4thedition，ContainerCorporationofAmerica)的色片相比較而確定的。
(c)生理學(xué)特征(1)生長(zhǎng)溫度范圍在酵母浸膏-麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，14到37℃(最適生長(zhǎng)溫度20至30℃)(2)明膠液化陽(yáng)性(3)淀粉水解陽(yáng)性(4)脫脂乳凝固作用陰性脫脂乳胨化作用陽(yáng)性(5)類黑素形成陰性(d)碳源的利用陽(yáng)性葡萄糖、木糖、鼠李糖未確定的果糖陰性阿拉伯糖、蔗糖、棉子糖、甘露醇、肌醇根據(jù)上述微生物學(xué)特征，Y-53菌株被鑒定為鏈霉菌屬菌株;本發(fā)明人將其定各為鏈霉屬Y-53菌株。Y-53菌株已寄存于發(fā)酵研究所(Osaka)，寄存登記號(hào)為IFO-14596;并于1987年8月13日寄存于日本國(guó)際貿(mào)易和工業(yè)廳工業(yè)科學(xué)技術(shù)局發(fā)酵研究所，登記號(hào)為FERM-P9518，該寄存物按布達(dá)佩斯條約的規(guī)定同時(shí)寄存于FRI，登記號(hào)為FERMBP-1889，并寄存于CCTCC，登記號(hào)為CCTCCM88066。
應(yīng)提到的是，只要能產(chǎn)生?；被嵬庀福魏谓柚诩?xì)胞融合技術(shù)或?qū)⒕昊蛑徊糠?含有?；被嵬庀妇幋a區(qū))插入適當(dāng)宿主微生物所得到的轉(zhuǎn)化體自上述Y-53菌株或表Ⅰ所列出的其他?；被嵬庀干a(chǎn)微生物衍生的突變株或接合子均可用于本發(fā)明。
用于培養(yǎng)上述微生物的培養(yǎng)基可以是液體的或固體的，只要其含能被相關(guān)菌株利用的營(yíng)養(yǎng)源并促進(jìn)酰基氨基酸外消旋酶產(chǎn)生都是適用的。為進(jìn)行大批量培養(yǎng)，使用液體培養(yǎng)基更為方便。
用于制備培養(yǎng)基的物質(zhì)是一般適用于培養(yǎng)微生物的物質(zhì)，如碳源、氮源和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)素。如葡萄糖、甘油、糊精、淀粉、糖蜜及動(dòng)物和植物油可用作碳源;大豆粉、玉米漿、棉籽粉、肉汁、蛋白胨、酵母浸膏、硫酸銨、硝酸鈉和尿素等可用作氮源。如必要時(shí)可進(jìn)一步加入鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、錳鹽、鐵鹽、鈷鹽、鋅鹽、磷酸鹽將其他鹽。
可用靜止培養(yǎng)法、振蕩培養(yǎng)法或需氧深層培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于大批量處理最好用需氧深層培養(yǎng)法。培養(yǎng)溫度為15-37℃，最好是20至37℃。培養(yǎng)基的pH最好保持在5至9。培養(yǎng)進(jìn)行18小時(shí)到4天，并當(dāng)積聚的酰基氨基酸外消旋酶的量達(dá)到最大時(shí)終止培養(yǎng)。
為了從培養(yǎng)物中收獲酰基氨基酸外消旋酶，首先以離心或其他方法將培養(yǎng)物分離成細(xì)胞和培養(yǎng)濾液兩部分，如細(xì)胞中存在所說(shuō)的酶可單獨(dú)或結(jié)合使用溶解酶處理、超聲處理、French壓濾處理及Dyno-Mill壓榨處理等各種細(xì)胞破碎方法破碎細(xì)胞，以使酶溶出。如所說(shuō)的酶存在于培養(yǎng)物濾液中，則可直接對(duì)培養(yǎng)物濾液進(jìn)行純化處理。
為了純化溶解的或存在于培養(yǎng)物濾液中的所說(shuō)的酶，可結(jié)合使用已知的酶純化方法，如利用硫酸銨等的鹽析法、利用羧甲基纖維素等的陽(yáng)離子交換層析法、利用二乙氨基乙基纖維素等的陰離子交換層析法、利用葡聚糖凝膠等的凝膠過(guò)濾法、利用疏水樹(shù)脂的疏水層析法以及親合層析法，從而可得到具有所要求之純化程度的?；被嵬庀笜?biāo)準(zhǔn)樣品。
按本發(fā)明的方法制得的?；被嵬庀妇哂邢率鑫锢砘瘜W(xué)性質(zhì)(1)作用所說(shuō)的酶作用于L-Nα-?；被崾怪D(zhuǎn)化成相應(yīng)的D-Nα-?；被幔⒆饔糜贒-Nα-?；被崾怪D(zhuǎn)化為相應(yīng)的L-Nα-?；被?。即該酶催化由下式顯示的可逆反應(yīng)
L-Nα-?；被?()/() D-Nα-酰基氨基酸(2)底物特異性如下列表3中所示，該酶可作用于旋光Nα-?；被?，但對(duì)相應(yīng)的旋光α-氨基酸則不起作用。
應(yīng)提到的是，表3中的相對(duì)活性是用Nα-?；被嶙鞯孜?，以(3)中所述的酶活性檢測(cè)法測(cè)定的，其中代表所產(chǎn)生之α-氨基酸量(mM)(相當(dāng)于各底物者)的數(shù)值是基于將所產(chǎn)生的蛋氨酸的量定為100而計(jì)算的。當(dāng)?shù)孜锸荓-Nα-酰基氨基酸時(shí)，用Y-53菌株產(chǎn)生的D-?；被崴饷复鍸-酰化氨基酸水解酶。當(dāng)?shù)孜锸切獍被釙r(shí)，在用D或L-氨基酸氧化酶(均由Sigma公司生產(chǎn))處理后，即可將反應(yīng)液作高效液相層析，以確定是否已形成了底物的光學(xué)對(duì)映體。
(3)酶活性測(cè)定方法?；被嵬庀复呋赡娣磻?yīng)。即是說(shuō)，當(dāng)用D-Nα-酰基氨基酸作底物時(shí)，隨著反應(yīng)進(jìn)行而產(chǎn)生并積聚的L-Nα-酰基氨基酸成為所說(shuō)酶的另一種底物，因此它也受到酶的作用并轉(zhuǎn)化成D-Nα-?；被?，即底物。為了測(cè)定真空反應(yīng)速度，必須將反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化成其他化合物并將其從反應(yīng)系統(tǒng)中除去。
為此目的，當(dāng)產(chǎn)物是L-或D-Nα-?；被釙r(shí)，本發(fā)明人向反應(yīng)系統(tǒng)中加入了過(guò)量的L-或D-?；被崴饷敢詸z測(cè)酶的活性，從而使產(chǎn)物的脫酰反應(yīng)得以同時(shí)進(jìn)行，并檢測(cè)了最終積聚的L-或D-氨基酸的量，該數(shù)值(μM)被看作是相等于已產(chǎn)生的L-或的D-Nα-?；被岬牧?。
使用包含50μl酶溶液、40μl底物溶液、10μlL-?；被崴饷溉芤汉?00μl50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)的混合反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定酶活性。作為酶溶液，使用了將?；被嵬庀笜?biāo)準(zhǔn)樣品以1-0.2單位/ml的濃度溶解于Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中所制成的溶液;作為L(zhǎng)-?；被崴饷溉芤?，則使用了將L-?；被崴饷笜?biāo)準(zhǔn)樣品(如可用由Sigma公司生產(chǎn)的商品酶，但本發(fā)明中使用的是由Y-53菌株提取并純化的L-?；被崴饷?以40-8單位/ml的濃度溶解在Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中所制成的溶液。
按照Tris-HCl緩沖液、底物溶液、L-?；被崴饷溉芤汉兔溉芤旱捻樞蛞来渭尤敫魅芤翰⒒旌现诩尤朊溉芤旱耐瑫r(shí)于30℃開(kāi)始反應(yīng)。如果酶溶液的活性低，可使反應(yīng)持續(xù)120分鐘;如果酶活性高則持續(xù)10分鐘，并于100℃加熱處理3分鐘以終止反應(yīng)。
為測(cè)定酶活性，用高效液相層析法檢測(cè)反應(yīng)系統(tǒng)中所產(chǎn)生的蛋氨酸的量，并將相當(dāng)于產(chǎn)生1μmol/分蛋氨酸的酶活性定為1個(gè)單位。當(dāng)在x分鐘的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)反應(yīng)系統(tǒng)中已產(chǎn)生了ymM濃度的蛋氨酸時(shí)，則可用下列公式計(jì)算50μl溶液中所含酶活性(a單位)a＝ (y)/(2x)(4)酶活性的最適pH和保持酶穩(wěn)定性的pH范圍按上述檢測(cè)酶活性的方法使反應(yīng)進(jìn)行2或4小時(shí)，但分別使用乙酸鈉-HCl緩沖液(pH4.0，5.0)、磷酸二氫鉀-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0、7.0、8.0)、磷酸二氫鉀-硼酸鈉(pH6.3、7.8、8.3、9.0)和碳酸鈉-硼酸鈉(pH9.2、10.0、10.9)代替Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，并根據(jù)所產(chǎn)生之蛋氨酸的量的比例計(jì)算各溶液中酶的相對(duì)活性。


圖1顯示當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行2小時(shí)時(shí)各pH值的溶液中的相對(duì)酶活性;由圖1可知最適pH為大約8。
圖2顯示當(dāng)反應(yīng)時(shí)間由2小時(shí)延長(zhǎng)到4小時(shí)時(shí)，所產(chǎn)生之蛋氨酸的量增加的程度。反應(yīng)進(jìn)行4小時(shí)所產(chǎn)生的蛋氨酸的量為2小時(shí)反應(yīng)所得蛋氨酸量的近2倍，故可以說(shuō)在該反應(yīng)條件下酶是穩(wěn)定的。由圖2可知在pH6至9時(shí)?；被嵬庀甘欠€(wěn)定的。
(5)作用的適宜溫度范圍在25、30、35、40、50、60或70℃等不同反應(yīng)溫度(30℃)用檢測(cè)酶活性的標(biāo)準(zhǔn)方法(見(jiàn)(3)中所述)檢測(cè)由N-?；?D-蛋氨酸產(chǎn)生的L-蛋氨酸的量。所用的酶的量逐漸增加，反應(yīng)時(shí)間為5分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，作用的適宜溫度范圍為30至50℃。
(6)不同溫度對(duì)酶活性的影響于30、35、40、50、60或70℃加熱處理30分鐘后，用檢測(cè)酶活性的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)酶溶液的殘留活性。所得結(jié)果以黑色點(diǎn)線示于圖4中。
由該曲線可以看出，在40℃以下的酶是穩(wěn)定的，但溫度高于50℃則酶失活。另外使用如上所述的同樣條件但向酶溶液內(nèi)加入1mM鈷離子，進(jìn)行加熱處理并測(cè)定殘留活性;如此所得結(jié)果與沒(méi)有Co++離子條件下所得結(jié)果不同。圖4中用白色點(diǎn)線示出了存在所加Co++離子時(shí)得到的結(jié)果;由此可知存在Co++離子的情況下酶在50℃以下是穩(wěn)定的并在60℃時(shí)失活。
(7)金屬離子的影響使用無(wú)金屬鹽溶液作對(duì)照，按(3)中所述的檢測(cè)酶活性的方法進(jìn)行反應(yīng)，但除去加到底物溶液內(nèi)的12.5mM(在反應(yīng)混合物中的終濃度為1mM)氯化鈷，代之以加入12.5mM或125mM(在反應(yīng)混合物中的終濃度分別為1mM或10mM)各種金屬鹽或EDTA，并檢測(cè)金屬離子對(duì)酶活性的影響。應(yīng)提到的是，業(yè)已證明用于本實(shí)驗(yàn)的L-?；被崴饷傅幕钚圆皇苓@些添加物的影響。結(jié)果如表4中所示。表4所示的酶活性是在將無(wú)添加物時(shí)所得到的值定為100的基礎(chǔ)，以相對(duì)活性的形式給出的。
表4金屬離子對(duì)酶活性的影響
如表4所示，在某一限定的濃度范圍的幾種金屬離子存在下，所說(shuō)的酶顯著地被激活了。即，鈷離子在低濃度(約1mM)時(shí)具有顯著的活化作用，但濃度為10mM時(shí)則很難激活該酶。鋅離子和鎳離子具有相似的傾向。鎂離子濃度為10mM時(shí)比1mM時(shí)活化作用大。錳離子和二價(jià)鐵離子具有相似的傾向。被檢測(cè)的幾種金屬離子中，銅離子表現(xiàn)有明顯的抑制作用。鋁離子和鉬離子在濃度為10mM時(shí)也抑制酶活性。EDTA在濃度為10mM時(shí)具有顯著的抑制作用。
(8)分子量約200，000其為按照Davis[Ann.N.Y.Acad.Sci.，121，404(1964)]所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)得的實(shí)施例2中表5第5步驟所制得之酶的分子量;電泳所用的條件是聚丙烯酰胺梯度凝膠，PAG平板4/15(由日本DaiichiPureChemicals公司生產(chǎn));30mA(恒定電流)2小時(shí)。酶的分子量是根據(jù)比較樣品酶與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率來(lái)估計(jì)的。
使用SDS-PAG平板4/20(日本DaiichiPureChemicals公司)，在十二烷基硫酸鈉(SDS)存在下以同樣方法并在同樣條件下檢測(cè)該酶之亞單位的分子量。估計(jì)亞單位的分子量為大約40，000道爾頓。
(9)等電點(diǎn)使用載體兩性電解質(zhì)以瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)得等電點(diǎn)為4.8。電泳使用電泳裝置(2117型MultiphorⅡ，LKB)和Pharmalyte，pH3到10(Pharmacia，瑞典)以恒定電泳(2W)進(jìn)行2.5小時(shí)。
本發(fā)明的酰基氨基酸外消旋酶，當(dāng)與L-?；被崴饷富駾-酰化氨基酸水解酶結(jié)合使用時(shí)，能夠以一步驟由廉價(jià)的DL-Nα-酰基氨基酸生產(chǎn)旋光L-α-氨基酸或旋光D-α-氨基酸。
用已知方法很容易制得L酰化氨基酸水解酶，但亦可使用市售產(chǎn)品。據(jù)報(bào)導(dǎo)，可由鏈霉菌屬[日本已公開(kāi)未審查專利申請(qǐng)No.126969/1987和126976/1987]、假單胞菌屬[Nature，170，888(1952);日本已公告專利申請(qǐng)No.31477/1985]和產(chǎn)堿桿菌屬[ProceedingsoftheannualmeetingoftheAgriculturalChemicalSocietyofJapan，1987，pp.659]的細(xì)菌產(chǎn)生D-?；被崴饷?。此外，本發(fā)明中作為?；被嵬庀干a(chǎn)微生物分離的大多數(shù)菌株不僅可產(chǎn)生酰基氨基酸外消旋酶，且可產(chǎn)生D-?；被崴饷负?或L-酰化氨基酸水解酶。
因此，為了由作為原料的DL-Nα-?；被嵘a(chǎn)旋光α-氨基酸，須由以本發(fā)明之方法生產(chǎn)的具有不同純化程度的?；被嵬庀笜?biāo)準(zhǔn)樣品中選擇一種適用于這一目的和使用方式的標(biāo)準(zhǔn)樣品。例如欲生產(chǎn)L-α-氨基酸時(shí)，所選擇的標(biāo)準(zhǔn)酶樣品和L-酰化氨基酸水解酶(其為由市場(chǎng)上購(gòu)得的或自某種適當(dāng)L-?；被嵘a(chǎn)微生物中分離的)是結(jié)合形式的或另外用DL-Nα-酰基氨基酸處理過(guò)的。當(dāng)原料已最后100%轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-α-氨基酸時(shí)，終止反應(yīng)并由反應(yīng)混合物中回收所需的L-α-氨基酸。
這里，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣品的使用目的是生產(chǎn)L-氨基酸時(shí)，它必須符合這樣的要求，即標(biāo)準(zhǔn)樣品中不含有L-酰化氨基酸水解酶。如將酶固定作為生物反應(yīng)器使用，標(biāo)準(zhǔn)樣品可以是含酶的細(xì)胞，且在使用俘獲固定法中其可以是無(wú)細(xì)胞提取物，而標(biāo)準(zhǔn)樣品的純化程度必須稍高于使用離子交換樹(shù)脂吸附法或不溶性載體共價(jià)結(jié)合法時(shí)的純化程度。
如果?；被嵬庀干a(chǎn)微生物即不產(chǎn)生L-酰化氨基酸水解酶也不產(chǎn)生D-?；被崴饷福瑒t用于本發(fā)明之旋光氨基酸生產(chǎn)方法的?；被嵬庀笜?biāo)準(zhǔn)樣品可包括培養(yǎng)的微生物細(xì)胞、其加工產(chǎn)品以及自細(xì)胞中提取和純化至不同純度的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
如果?；被嵬庀干a(chǎn)微生物還產(chǎn)生L-?；被崴饷富駾-?；被崴饷?，則可按使用上述微生物的同樣方法將其用于生產(chǎn)L-α-氨基酸或D-α-氨基酸。在這種情況下，如果所產(chǎn)生的L-?；被崴饷富駾-酰化氨基酸水解酶的活性遠(yuǎn)比?；被嵬庀傅幕钚詮?qiáng)，則不必另外再加L-或D-酰化氨基酸水解酶。
如果?；被嵬庀干a(chǎn)微生物還產(chǎn)生L-?；被崴饷富駾-?；被崴饷福捎贸Ｒ?guī)方法突變誘導(dǎo)缺乏D-或L-?；被崴饷傅木辏苑謩e產(chǎn)生L-氨基酸或D-氨基酸。根據(jù)需要還可使用包括培養(yǎng)的細(xì)胞和標(biāo)準(zhǔn)酶樣品在內(nèi)的各種處于不同純化水平的加工產(chǎn)物。
應(yīng)注意的是，如加工產(chǎn)物是培養(yǎng)的細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞提取物，則可含有一種分解所需氨基酸的酶;在這種情況下，必須去掉該氨基酸分解活性。如果微生物不是缺乏?；被崴饷傅木?，便難于用它在細(xì)胞水平上直接生產(chǎn)旋光α-氨基酸，但可以在不影響?；被嵬庀傅那闆r下用加熱處理或加入抑制劑等方法使一種或兩種酰化氨基酸水解酶失活之后使用之。為了由共產(chǎn)生L-和D-酰化氨基酸水解酶的菌株中制備?；被嵬庀傅臉?biāo)準(zhǔn)樣品，可先由培養(yǎng)的細(xì)胞中提取?；被嵬庀?，然后分離并除去影響生產(chǎn)預(yù)期氨基酸的?；被崴饷?，且必要時(shí)可再增加某種純化步驟，從而制得標(biāo)準(zhǔn)樣品。
用酰基氨基酸外消旋酶和L-或D-?；被崴饷干a(chǎn)L-或D-α-氨基酸時(shí)，通?？墒褂眠@樣一些方法如(1)將?；被嵬庀傅臉?biāo)準(zhǔn)樣品及L-或D-?；被崴饷溉芙庥趐H為6-9含有適當(dāng)量原料DL-Nα-?；被峒癈o++或其他金屬離子的緩沖液中，將該溶液放置于適當(dāng)溫度下直到反應(yīng)完成;(2)用已知方法一起或分別固定?；被嵬庀傅臉?biāo)準(zhǔn)樣品和L-或D-?；被崴饷?，然后以一或多階段將其裝入反應(yīng)容器中，以制成生物反應(yīng)器，使pH為6至9含有DL-Nα-?；被岷虲o++或其他金屬離子的緩沖液通過(guò)該反應(yīng)器以引起反應(yīng);(3)將兩種溶解于被超濾膜分成2個(gè)室之反應(yīng)器的一個(gè)室中，加入原料溶液以引起反應(yīng)，并回收已通過(guò)超濾膜的產(chǎn)物。無(wú)論使用哪種方法，反應(yīng)混合物都要滅菌并盡可能地?zé)o菌操作。
因?yàn)槿绱酥频玫淖罱K反應(yīng)混合物只含有由所需之旋光氨基酸的水解作用而產(chǎn)生的有機(jī)酸和?；鶊F(tuán)，所以很容易用常規(guī)方法回收所要的氨基酸。
圖1顯示?；被嵬庀傅膒H依賴性。
圖2顯示在不同pH值條件下借助?；被嵬庀杆a(chǎn)生的蛋氨酸的量;這些量是以基于將2小時(shí)反應(yīng)(
)的量定為1而計(jì)算的4小時(shí)反應(yīng)(
)的量的相對(duì)值表示的。
圖3顯示反應(yīng)溫度與?；被嵬庀钢富钚灾g的關(guān)系。
圖4顯示酰基氨基酸外消旋酶的熱穩(wěn)定性。
實(shí)施例1向200ml錐形瓶?jī)?nèi)各加入20ml含BBL胰酶解酪蛋白一大豆培養(yǎng)液(購(gòu)自BectonDickinson公司)和0.1%N-乙酰基-D-蛋氨酸的培養(yǎng)基(pH7.0)并于120℃消毒20分鐘。另外，經(jīng)液體培養(yǎng)后，將鏈霉菌屬Y-53菌株儲(chǔ)存于冷卻條件(-80℃)下，以備需要時(shí)用作種菌接種物溶液。
向30個(gè)含上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)以每瓶0.7ml的量無(wú)菌接種冷凍的微生物(在溶液中)于28℃振蕩培養(yǎng)2天以產(chǎn)生種子菌培養(yǎng)物。然后將各種子菌培養(yǎng)物以每瓶1ml的量移入含同樣培養(yǎng)基的500個(gè)培養(yǎng)瓶中，并于28℃振蕩培養(yǎng)42小時(shí)。收集培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)容物并經(jīng)離心(4℃，10，000rpm、15分鐘)收集細(xì)胞。用生理鹽水洗細(xì)胞并得到216g濕細(xì)胞。以下程序均在4℃以下完成。
將216g濕細(xì)胞懸浮于1升50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中并加于Dyno-Mill細(xì)胞破碎器(MillyA.BachofenAG生產(chǎn))中以破碎細(xì)胞。所用玻璃珠直徑為0.1至0.2mm，流速為60ml/分。于4℃將處理的細(xì)胞液以10，000rpm離心20分鐘，得到1700ml無(wú)細(xì)胞提取物。該提取物的?；被嵬庀富钚詾?.9單位，比活性為0.52毫單位/mg蛋白。用Bio-Rad蛋白分析法測(cè)定總蛋白量。
實(shí)施例2于冷卻和攪拌下向1700ml實(shí)施例1中制得的無(wú)細(xì)胞提取物內(nèi)緩慢加入300g硫酸銨。全部加完后，繼續(xù)攪拌30分鐘以上，于4℃以10，000rpm將混合物離心30分鐘，得到1660ml澄清的上清液。
將1660ml上清液吸附于用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含30%飽和硫酸銨)平衡過(guò)的TSKHW65C柱(4.8cm×30cm)(日本Tosoh公司，)上，用1000ml上述磷酸鹽緩沖液洗柱，然后用不含硫酸銨的磷酸鹽緩沖液洗脫蛋白組分，并收集顯示有預(yù)期之酶活性的洗脫部分。于冷卻和攪拌下向所得330ml活性部分中緩慢加128g硫酸銨。以10，000rpm離心30分鐘以收集所得沉淀。將沉淀物溶解于50ml50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中并過(guò)SephadexG25柱(Phamacia，瑞典)除鹽。將如此制得的粗酶溶液吸附于用50mM磷酸鹽緩沖液平衡過(guò)的DEAEToyopearl650M柱(Tosoh公司，日本)上。用1000ml同樣緩沖液洗柱，然后用含有0.2MNaCl的同樣緩沖液洗脫得到340ml活性部分。用常規(guī)方法向該活性部分中加入133g硫酸銨。離心(4℃、10，000rpm、30分鐘)收集所得沉淀并溶解于30ml同樣的緩沖液。使該溶液通過(guò)一個(gè)SephadexG5柱脫鹽，并得到59ml粗酶溶液。使該粗酶溶液吸附于用同樣緩沖液平衡過(guò)的DEAE-5PW柱(日本Tosoh公司，2.15cm×15cm)上進(jìn)行制備高效液相層析(HLC-837型，日本Tosoh公司)，并用0至0.5M線性濃度梯度NaCl洗脫。洗脫速度為每分鐘4ml?；厥赵?2至36分鐘時(shí)洗脫的部分，得到16ml活性部分。該部分中的?；被嵬庀富钚詾榇蠹s7.2單位，且比活性為大約63毫單位/mg蛋白。比活性增加到無(wú)細(xì)胞提取物之比活性的約122倍。
將該活性部分進(jìn)一步加到用50mM磷酸鹽緩沖液平衡過(guò)的TSK-G3000SW柱(日本Tosoh公司，5.5cm×60cm)上，以1ml/分的流速進(jìn)行凝膠過(guò)濾，并分別得到活性部分。因該部分在聚丙烯酰胺凝膠電泳中呈現(xiàn)出單一的帶，故可推斷酰基氨基酸外消旋酶已得到純化。該部分中?；被嵬庀富钚詾?.2單位，比活性為2.8單位/mg蛋白。
表5中給出了各個(gè)純化步驟中所得部分的?；被嵬庀缚偦钚?、總蛋白含量和比活性以及各樣品溶液的體積。
實(shí)施例3在10升培養(yǎng)基中按實(shí)施例1的同樣方法培養(yǎng)鏈霉菌屬Y-53菌株。培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞并用0.8%NaCl溶液洗一次。得到300g濕細(xì)胞。
按實(shí)施例1中所述同樣方法用Dyno-Mill(一種細(xì)胞破碎器)破碎濕細(xì)胞并離心(10，000rpm，20分鐘)得到1680ml上清液。該上清液中含21單位?；被嵬庀?、315單位L-酰化氨基酸水解酶和75單位D-?；被崴饷?。向該上清中加入硫酸銨達(dá)到30%飽和度，并離心除去沉淀物。再向離心的上清中加入硫酸銨達(dá)到60%飽和度并離心除去所得沉淀物。將得到的沉淀物溶解于50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中并使用已經(jīng)過(guò)同樣緩沖液平衡過(guò)的SephadexG25柱凝膠過(guò)濾脫鹽。對(duì)所得溶液進(jìn)行離子交換層析。
將上述已除鹽的溶液(490ml)加至用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡過(guò)的DEAEToyopearl650M柱(樹(shù)脂體積700ml)上并用2升同樣磷酸鹽緩沖液洗柱，從而洗出非吸附的組分。由洗出液中回收到114單位D-?；被崴饷?。該DEAEToyopearl650M柱上相當(dāng)強(qiáng)地吸附了酰基氨基酸外消旋酶(約20單位)和L-?；被崴饷?約900單位)，除非使用大于0.2摩爾的鹽溶液否則便不能將它們洗脫下來(lái)。
將上述柱置于30℃下，使含有0.5%N-乙?；?DL-蛋氨酸和1mM氯化鈷的20mM磷酸鹽緩沖液以每小時(shí)30ml的流速通過(guò)柱。收集3升洗脫液并過(guò)IR120陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，然后在減壓下濃縮使之干燥成為固態(tài)。用10ml冷的無(wú)水乙醇洗兩次后將所得殘留物溶解于約100ml熱水中，并過(guò)濾收集冷卻后析出的結(jié)晶。此外，向?yàn)V液內(nèi)逐滴加入乙醇并將所得混合物放置過(guò)夜。收集析出的結(jié)晶并干燥之，得到9.6g L-蛋氨酸。其熔點(diǎn)為280至281℃，[α]25D-8.2°(C＝1%)。該產(chǎn)物在高效液相層析及薄層層析中顯示有與L-蛋氨酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品同樣的行為。另外，當(dāng)該產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)樣品一起熔融時(shí)，未顯示熔點(diǎn)下降。
實(shí)施例4向置于200ml錐形瓶中之20ml含1.5%甘油、1.0%蛋白胨、1.0%酵母浸膏、0.5%Na Cl、0.25%K2HPO4、0.25%MgSO4·7H2O和0.05%N-乙酰基-DL-蛋氨酸的種子菌培養(yǎng)基(pH7.0)中接種0.7ml實(shí)施例1中制備的原培養(yǎng)物并在旋轉(zhuǎn)振蕩器上(200rpm)28℃培養(yǎng)18小時(shí)。將1ml所得培養(yǎng)物移入200ml錐形瓶中之25ml含0.5%甘油、1.0%蛋白胨、0.5% Na Cl、0.25%K2HPO4和0.05%N-乙?；?DL-蛋氨酸的生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH7.0)中。于上述的同樣條件下進(jìn)行培養(yǎng)。于0至4℃下完成以下程序。
離心(10，000rpm，15分鐘)收獲5升培養(yǎng)液中的細(xì)胞并用0.85%Na Cl水溶液洗滌。將洗過(guò)的細(xì)胞(385g，濕重)懸浮于1升50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中并用Dyno-Mill(Willy A.Bachofen AG)于下述條件下破碎之玻璃珠直徑0.1至0.2mm;細(xì)胞懸浮液流速60ml/分;轉(zhuǎn)速3，000rpm。離心(10，000rpm，20分鐘)除去已破碎的細(xì)胞。所得上清液(1280ml)含75單位?；被嵬庀富钚院?，500單位L-酰化氨基酸水解酶活性。按實(shí)施例2中所述的方法向該無(wú)細(xì)胞提取液(1280ml)中加入500g(NH4)2SO4達(dá)到60%飽和度。離心(10，000rpm，30分鐘)收集所得沉淀并溶解于600ml之50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。用纖維素袋對(duì)同樣緩沖液將酶溶液透析18小時(shí)。將除鹽后的酶溶液加于用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡過(guò)的DEAE-Toyopearl 650M柱(3cm×30cm)(日本Tosoh公司)上。用1，000ml同樣緩沖液并進(jìn)一步用1，000ml含1mM Co Cl2的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗柱。
吸附于該柱上的酰基氨基酸外消旋酶和L-?；被崴饷傅目偦钚苑謩e為43和800單位。將上述柱置于28℃下，使2，000ml含0.5% N-氯乙?；?D-纈氨酸、1mM Co Cl2和1μg/ml硫酸雙氫鏈霉素的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)以60ml/小時(shí)的流速通過(guò)柱。反應(yīng)終止后，用500ml含有1mM Co Cl2的20mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗柱。收集洗脫物并用高效液相層析法分析之，但在該溶液中并沒(méi)有測(cè)到N-氯乙?；?D-纈氨酸。洗脫物于真空中濃縮后，向其中加入冷乙醇。過(guò)濾收集所得沉淀的白色固體物，用冷乙醇洗滌并溶解于小量水-乙醇中。將其放置于4℃下得到無(wú)色小葉狀結(jié)晶物。過(guò)濾收集結(jié)晶并干燥之。產(chǎn)量為4.5g。熔點(diǎn)為315℃(分解)，[α]25D+64°(C＝1，H2O)。該結(jié)晶的樣品溶液在高效液相層析和薄層層析中分別顯示有與L-纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品同樣的滯留時(shí)間和Rf值。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)具有下列特性之酰基氨基酸外消旋酶的方法(1)使D-N-?；?α-氨基羧酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的L-N-?；?α-氨基羧酸，(2)使L-N-?；?α-氨基羧酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的D-N-酰基-α-氨基羧酸，(3)不能使D-α-氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的L-α-氨基酸，(4)不能使L-α-氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的D-α-氨基酸，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生所說(shuō)的酶的微生物，以在培養(yǎng)液中積聚所說(shuō)的酶并收獲所說(shuō)的酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中作為底物的N-?；?α-氨基羧酸具有下列結(jié)構(gòu)通式
其中X是可被取代的羧酸衍生的酰基，R是可被取代的C1-20烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中X是可被囟素、C1-3烷基、C1-3烷氧基和/或硝基取代的C1-3烷?；虮郊柞；?。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中R是直鏈或分枝鏈C1-6烷基。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中R是被羥基、C1-3烷基硫代、硫羥、苯基、羥苯基或吲哚基取代的C1-3烷基。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中R是被氨基、羥基、胍基或咪唑基取代的C1-4烷基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其為由能產(chǎn)生酶的微生物產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中酰基氨基酸外消旋酶還含有?；被崴饷?。
9.生產(chǎn)旋光D-或L-氨基酸的方法，其包括使依據(jù)權(quán)利要求1的?；被嵬庀冈贒-或L-酰化氨基酸水解酶存在下與DL-N-?；?α-氨基羧酸接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及?；被嵬庀?，其生產(chǎn)方法及應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/90GK1035320SQ88106108
公開(kāi)日1989年9月6日 申請(qǐng)日期1988年8月19日 優(yōu)先權(quán)日1987年8月21日
發(fā)明者高橋健, 波多野和德 申請(qǐng)人:武田藥品工業(yè)株式會(huì)社