專利名稱：用同源重組技術(shù)生產(chǎn)嵌合抗體的制作方法
本申請(qǐng)是1987年10月27日提交的，編號(hào)為113，800的共同未決申請(qǐng)的部分繼續(xù)申請(qǐng)，113，800列為本文參考文獻(xiàn)。
本發(fā)明涉及使用重組DNA載體和同源原位重組技術(shù)生產(chǎn)嵌合抗體的方法?？捎帽景l(fā)明的重組DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染抗體生成細(xì)胞，從而在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)發(fā)生預(yù)期的同源重組，致使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能夠產(chǎn)生嵌合抗體分子。
本發(fā)明借助所描述的實(shí)施例證明小鼠免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)被人IgG1恒定區(qū)所置換，而且嵌合的重鏈?zhǔn)怯尚∈蠹?xì)胞系產(chǎn)生的。
自從建立了生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞融合技術(shù)(Kohler和Milstein，1975，Nature(London)256∶495)以來(lái)，眾多的研究人員已生產(chǎn)出了大量的單克隆抗體，且其中有許多是限定于迄今未知的抗原。不幸的是，迄今所生產(chǎn)的大多數(shù)單克隆抗體都是在小鼠系統(tǒng)中產(chǎn)生的，因此在作為人類治療劑使用時(shí)便受到很多限制，而必須以某種方法進(jìn)行修飾，以使小鼠單克隆抗體不能作為外來(lái)抗原決定基被“識(shí)別”，和被人的免疫系統(tǒng)所“中和”。為此，有許多研究人員都在試圖開發(fā)不易作為外來(lái)抗原決定基被“識(shí)別”并且可能克服與在人體內(nèi)使用單克隆抗體有關(guān)之問(wèn)題的人類單克隆抗體。很顯然，由Kohler和Milstein建立的、包括處死免疫的小鼠并使用其脾臟作繼后與持續(xù)傳代之抗體生成細(xì)胞系進(jìn)行融合的淋巴細(xì)胞來(lái)源的雜交瘤技術(shù)，在人體是不可能實(shí)踐的。因此，許多研究人員已將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向分子生物學(xué)領(lǐng)域的某些最新進(jìn)展，即將DNA分子引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)以獲得免疫球蛋白基因的表達(dá)(Oi等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80∶825;Potter等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81∶7161)，并且已經(jīng)使用這些技術(shù)生產(chǎn)出了嵌合抗體(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81∶6581;Sahagan等，1986，J.Immunol.137∶1066;Sun等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84∶214)。
嵌合抗體是包含人和非人部分的免疫球蛋白分子。更具體地說(shuō)，即嵌合抗體的抗原結(jié)合區(qū)(或可變區(qū))是得自于非人類來(lái)源(如小鼠)，而嵌合抗體的恒定區(qū)(其為免疫球蛋白提供生物學(xué)效應(yīng)物功能)是由人類來(lái)源得到的。嵌合抗體應(yīng)具有非人抗體分子的抗原結(jié)合特異性以及由人抗體分子提供的效應(yīng)物功能。
概括說(shuō)來(lái)，用以生產(chǎn)這些嵌合抗體的方法包括下述步驟(某些步驟的次序是可以互換的)(a)鑒定并克隆編碼抗體分子之抗原結(jié)合部分的正確的基因片段;該基因片段(即所謂重鏈的可變的、多樣的和連接的區(qū)域(VDJ)或輕鏈的可變的，連接的區(qū)域(VJ)，或可簡(jiǎn)單地稱為V或可變區(qū))可以是CDNA或基因組形式的;
(b)克隆編碼恒定區(qū)或其所需部分的基因片段;
(c)連接可變區(qū)與恒定區(qū)，從而以可轉(zhuǎn)錄和可轉(zhuǎn)譯的形式編碼完整的嵌合抗體;
(d)將該構(gòu)建物連接到含有可選擇標(biāo)志和基因調(diào)控區(qū)如啟動(dòng)子、促進(jìn)子(enhancers)及Poly(A)附加信號(hào)的載體中;
(e)在細(xì)菌中擴(kuò)增該構(gòu)建物;
(f)將DNA引入真核細(xì)胞內(nèi)(轉(zhuǎn)染)，最常用的是哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞;
(g)選擇出表達(dá)可選擇標(biāo)志物的細(xì)胞;
(h)篩選可表達(dá)所需嵌合抗體的細(xì)胞;以及(i)檢測(cè)抗體的適當(dāng)結(jié)合特異性及效應(yīng)物功能。
已使用這些生產(chǎn)嵌合蛋白的程序處理了幾種有不同抗原結(jié)合特異性的抗體(如抗TNPBoulianne等，1984，NatureVol.312，P643;抗腫瘤抗原Sahagan等，1986，J.Immunol.Vol.137∶1066)。另外，也已通過(guò)將新的順序與編碼其抗原結(jié)合區(qū)的順序相連接而獲得了幾種不同的效應(yīng)物功能。其中包括酶(Neuberger等，1984，Nature312∶604)、來(lái)自另一個(gè)種的免疫球蛋白恒定區(qū)以及另一免疫球蛋白鏈的恒定區(qū)(Sharon等，1984，Nature309∶364;Tan等，1985，J.Immunol.Vol.135∶3365-3567)。
分子生物學(xué)領(lǐng)域里的另一項(xiàng)進(jìn)展是發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，可使外源質(zhì)粒DNA在含有與質(zhì)粒順序同源之順序的染色體區(qū)定位處整合到染色體DNA中。這一過(guò)程稱為同源重組(Folger等，1982，Mol.Cell.Biol.2，1372-1387;Folger等，1984，Symp.Quant.Biol.49，123-138;Kucherlapati等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，3153-3157;Liu等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，1391-1395;RobertdeSaintVincent等，1983，Proc.Natl.Acad，Sci.USA80，2002-2006;Shaul等，1985，Proc.Natl.Acad，Sci.USA82，3781-3784)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞還含有在隨機(jī)的染色體位點(diǎn)整合質(zhì)粒DNA的酶催機(jī)制，此即所謂非同源重組。據(jù)報(bào)導(dǎo)，同源重組的頻率高達(dá)重組過(guò)程的1/100至1/1000，而大多數(shù)重組來(lái)自于非同源相互作用(Thomas等，1986，Cell44∶419-428;Smithies等，1985，Nature317∶230-234;Shaul等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82∶3781-3784;Smith等，1984，Symp.Quant，Biol.49∶171-181;Subramani等，1983，Mol.CellBiol.3∶1040-1052)。細(xì)胞同源重組機(jī)制的存在使得在原位修飾內(nèi)源性基因成為可能。已發(fā)現(xiàn)在某些條件下，可通過(guò)向細(xì)胞內(nèi)引入含有同靶位點(diǎn)同源之DNA片段及帶有預(yù)期修飾之新順序的片段的質(zhì)粒DNA，而修飾染色體順序(Thomas等，1986，Cell44∶419-428;Smithies等，1985，Nature317∶230-234;Smith等，1984，Symp.Quant.Biol.49∶171-181)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體DNA和外源性質(zhì)粒DNA之間的同源重組可導(dǎo)致質(zhì)粒的整合或某些染色體順序被同源質(zhì)粒順序所置換。置換同源DNA順序的過(guò)程稱為基因轉(zhuǎn)化。整合和轉(zhuǎn)化過(guò)程均會(huì)致使預(yù)期的新順序在內(nèi)源性靶位點(diǎn)上定位。
然而，有關(guān)同源重組過(guò)程的研究，大多是使用賦予優(yōu)勢(shì)選擇如NEO和HPRT的基因，并且只在很少幾種類型的細(xì)胞進(jìn)行(Song等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶6820-6824;Rubinitz和Subramani，1986，Mol.CellBiol.6∶1608-1614;Liskay，1983，Cell35∶157-164)。尚未確定淋巴細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞能否介導(dǎo)這些過(guò)程或是否能通過(guò)這一過(guò)程對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行修飾或重新構(gòu)建。
本發(fā)明涉及修飾抗體分子及創(chuàng)造和生產(chǎn)嵌合抗體分子的方法，在這些分子中抗原結(jié)合區(qū)被連接到(a)免疫球蛋白恒定區(qū)或其某個(gè)部位上，從而提供如效應(yīng)物功能、類別(如IgG、IgA、IgM、IgD或IgE)、來(lái)源(如人或其他種動(dòng)物)等預(yù)期特性;或連接到(b)可為嵌合抗原分子貢獻(xiàn)某種某他功能的另一類型的分子上(如酶、毒素、生物活性肽、生長(zhǎng)因子、抑制劑、或有利于連接藥物、毒素或其他分子的銜接肽等)。
本發(fā)明使用新的重組DNA載體，通過(guò)同源重組對(duì)目的基因進(jìn)行工程修飾，該修飾作用可在(a)產(chǎn)生具有預(yù)期抗原特異性之抗體的細(xì)胞系中進(jìn)行，從而使抗體分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)保持不變，但抗體分子的恒定區(qū)或其部分被置換或改變，或(b)在產(chǎn)生證明有預(yù)期效應(yīng)物功能之所需類別抗體的細(xì)胞系中進(jìn)行，從而使抗體分子的恒定區(qū)保持不變，而使抗體分子的可變區(qū)或其部分被置換或改變。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，本發(fā)明使用了一個(gè)新的重組DNA載體，用以轉(zhuǎn)染可產(chǎn)生具有預(yù)期抗原特異性之抗體的細(xì)胞系。此新的重組DNA載體含有一個(gè)用以置換編碼細(xì)胞系中全部或部分免疫球蛋白恒定區(qū)之基因的“置換基因”(即置換基因可編碼人免疫球蛋白的全部或部分恒定區(qū)、特定類別的免疫球蛋白、或一種酶、毒素、生物活性肽、生長(zhǎng)因子、抑制劑、或有利于與藥物、毒素或其他分子結(jié)合的銜接肽等)、以及一個(gè)得以在抗體生成細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組和針對(duì)性基因轉(zhuǎn)化的“靶順序”。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，使用一新的DNA載體轉(zhuǎn)染可產(chǎn)生具有預(yù)期效應(yīng)物功能之抗體的細(xì)胞系，在這種情況下，該新的重組載體中所含有的置換基因可編碼具有預(yù)期抗原特異性之抗體分子的全部或部分區(qū)域，并可利用重組載體中含有的靶順序在抗體生成細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組和有針對(duì)性的基因修飾。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)只有一部分可變或恒定區(qū)被置換時(shí)，所得到的嵌合抗體可能限定同樣抗原和/或具有已被改變或改善了的同樣效應(yīng)物功能，從而嵌合抗體可顯示出更好的抗原特異性、更大的親和結(jié)合常數(shù)、提高了的效應(yīng)物功能，或增加了由被轉(zhuǎn)染之抗體生成細(xì)胞系分泌和產(chǎn)生的量等。不管實(shí)施何種方案，均可使用選擇已整合之DNA(通過(guò)可選擇標(biāo)志)、篩選嵌合抗體以及細(xì)胞克隆的方法獲得產(chǎn)生嵌合抗體之細(xì)胞的克隆。
因此，編碼單克隆抗體之修飾作用的DNA片段可直接以B細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞系內(nèi)被表達(dá)之免疫球蛋白基因的位點(diǎn)為置換目標(biāo)?？梢允褂眠m于進(jìn)行任何特定修飾作用的DNA構(gòu)建物去改變?nèi)魏螁慰寺〖?xì)胞系或雜交瘤的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。這一方法免除了花費(fèi)很多財(cái)力和時(shí)間去從表達(dá)有用抗原特異性的B細(xì)胞克隆中克隆重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的工作。除了可避開克隆可變區(qū)基因的方法外，當(dāng)基因處于其天然染色體定位時(shí)，嵌合抗體的表達(dá)水平還將比在隨機(jī)位置時(shí)要高。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)，不管是一次或多次使用，均具有下述的意義
嵌合抗體為一抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、置換或交換，從而使抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))連接到一不同或改變了類型、效應(yīng)物功能和/或種屬來(lái)源之抗體恒定區(qū)上，或連到為嵌合抗體提供新性質(zhì)的完全不同的分子(如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物等)上;或者(b)用一具有不同的或改變了抗原特異性的可變區(qū)來(lái)改變、置換或交換可變區(qū)或其部分。
置換基因?yàn)橐痪幋a某種產(chǎn)物的基因，其置換抗體分子的全部或部分恒定區(qū)或可變區(qū)以形成嵌合抗體分子。置換基因被構(gòu)建成本發(fā)明的新的重組DNA靶載體，用以轉(zhuǎn)染抗體生成細(xì)胞系。為了修飾全部或部分恒定區(qū)，本發(fā)明的置換基因可包括但不只限于具有特定效應(yīng)物功能、類型和/或來(lái)源的免疫球蛋白恒定區(qū)(如人免疫球蛋白或任何其他種免疫球蛋白的IgG、IgA、IgM、IgD或IgE恒定區(qū))或其修飾免疫球蛋白恒定區(qū)之活性或性質(zhì)的恒定區(qū)的部分;以及編碼其他可賦予嵌合抗體分子以某些新功能的分子(如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、可連接的銜接子等)的基因。為了修飾全部或部分可變區(qū)，本發(fā)明的置換基因可包括但不只限于編碼具有不同抗原親和力或特異性之不同可變區(qū)的免疫球蛋白可變區(qū)，或可修飾免疫球蛋白可變區(qū)之活性或性質(zhì)的可變區(qū)的一部分，從而使所得到的嵌合抗體對(duì)抗原有更大的親和力或更高的特異性。
靶順序?yàn)榭贵w生成細(xì)胞之染色體中的一個(gè)順序，它與抗體分子將被轉(zhuǎn)化的區(qū)域相鄰接的DNA順序同源。靶順序被構(gòu)建到本發(fā)明的新的重組DNA載體中，然后用于轉(zhuǎn)染抗體生成細(xì)胞系。
直接置換或插入全部或部分恒定區(qū)內(nèi)的、用于重鏈重組的靶順序可包括但不只限于全部或部分V、D、J及開關(guān)區(qū)(包括稱為內(nèi)含子的干擾順序)，以及與將被轉(zhuǎn)染的抗體生成細(xì)胞系表達(dá)的特定重鏈恒定區(qū)基因相關(guān)聯(lián)或相鄰接的側(cè)翼順序，而且還可包括定位于恒定區(qū)之內(nèi)或其下游的區(qū)域(包括內(nèi)含子)。直接置換或插入全部或部分恒定區(qū)內(nèi)以進(jìn)行輕鏈重組的靶順序可包括但不只限于V和J區(qū)，它們的上游側(cè)接順序以及干擾順序(內(nèi)含子)，可與將被轉(zhuǎn)染之抗體生成細(xì)胞系表達(dá)的輕鏈恒定區(qū)基因相關(guān)聯(lián)或鄰接，并可包括位于恒定區(qū)(包括內(nèi)含子)之內(nèi)或其下游的區(qū)域。
經(jīng)直接置換或插入全部或部分可變區(qū)內(nèi)以進(jìn)行重鏈重組的靶順序可包括但不只限于全部或部分V、D和J區(qū)(包括內(nèi)含子)，以及與將被轉(zhuǎn)染之抗體生成細(xì)胞系所表達(dá)的特定可變區(qū)基因相關(guān)聯(lián)或相鄰接的側(cè)翼順序。經(jīng)直接置換或插入全部或部分可變區(qū)內(nèi)用以進(jìn)行輕鏈重組的靶順序可包括但不只限于V和J區(qū)(包括內(nèi)含子)，以及與將被轉(zhuǎn)染之抗體生成細(xì)胞所表達(dá)的輕鏈可變區(qū)基因相關(guān)聯(lián)或相鄰接的側(cè)翼順序。
靶載體為一包括靶順序和置換基因的重組核苷酸載體，其可用于通過(guò)基因工程由被靶載體轉(zhuǎn)化的抗體生成細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)嵌合抗體。用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的靶載體包含與載體的靶順序同源并可產(chǎn)生具有(1)預(yù)期抗原特異性、(2)預(yù)期恒定區(qū)，或(3)另一預(yù)期性質(zhì)如高分泌水平、大規(guī)模培養(yǎng)適用性等性質(zhì)之抗體的順序。
本文所用縮寫字的意義列示如下FITC異硫氰酸熒光素HRP辣根過(guò)氧化物酶hu人類huCr1人γ免疫球蛋白1的愣ㄇ庀宰 huIgG人γ免疫球蛋白m小鼠
mAB單克隆抗體mIgG小鼠γ免疫球蛋白
圖1中圖解顯示了使用本發(fā)明的靶載體，通過(guò)同源重組進(jìn)行基因置換的總的流程。圖中標(biāo)示出了可變區(qū)(V)、多樣性區(qū)(D)、連接區(qū)(J)、開關(guān)區(qū)(S)和恒定區(qū)(C)。A中圖解顯示使用與圍繞V、D、J、S和C區(qū)之任何部分同源的靶順序置換重鏈基因的全部或部分恒定或可變區(qū)。B中圖解顯示使用與V、J和C區(qū)附近任何部分同源的靶順序置換輕鏈基因的全部或部分恒定或可變區(qū)。C中則圖解顯示使用與將被置換的基因相側(cè)接的順序置換輕鏈或重鏈基因中的全部或部分恒定或可變區(qū)。
圖2中圖解顯示靶(目的)質(zhì)粒pRSV-140-neo/Huc-γ1/MuT4/e的構(gòu)建。該靶順序包括得自小鼠免疫球蛋白重鏈(IgH)座位的2.2KbHindⅢ片段，其含有第四連接區(qū)(J4)、IgH促進(jìn)子(IgHenhancer)(e)以及5′至開關(guān)區(qū)的內(nèi)含子順序。定位于5′至置換基因的靶順序包括一含有人γ1恒定區(qū)之人IgG1重鏈座位的7.0KbHindⅢ-BamHI片段。
圖3為人IgG1重組載體的構(gòu)建圖。該載體是由一個(gè)含有已被修飾而除去XbaⅠ位點(diǎn)之小鼠重鏈促進(jìn)子的2.2KbHindⅢ片段、一個(gè)含有人γ1(huCγ1)之恒定區(qū)外顯子的3.0KbHindⅢ/PvuⅡ片段、得自編碼neo的pSV2/neo的2.0KbBglⅡ/BamHI片段、一個(gè)攜帶人CMV促進(jìn)子及啟動(dòng)子的667bpBalⅠ/SstⅠ片段，以及一個(gè)由包括復(fù)制原點(diǎn)及氨芐青霉素抗性基因之pBR322得到的2.3KbPvuⅡ/HindⅢ片段所組成。將含有CMV的BalⅠ/SstⅠ片段轉(zhuǎn)移到pEMBL18的SstⅠ/HincⅢ位點(diǎn)中，作為-HindⅢ/SstⅠ片段除去之并克隆到Ric19R的相同位點(diǎn)之間，然后作為SmaⅠ/BglⅡ片段分離以加到構(gòu)建物的PvuⅡ和BglⅡ位點(diǎn)之間。相似地，將攜帶人Cγ1外顯子的HindⅢ/PvuⅡ片段克隆到Puc9的到HindⅢ和HincⅢ位點(diǎn)中，然后作為HindⅢ/BamHI片段轉(zhuǎn)移之。
圖4顯示用于針對(duì)人Cγ1順序的另一附加質(zhì)粒。圖4A和4B中所示的質(zhì)粒與圖3中所示者大致相同，所不同的是圖4A和4B中所示的兩個(gè)質(zhì)粒具有一包含來(lái)自pSV2neo(T.Molec.Appl.Genet.1∶327-341，1982)之SV40促進(jìn)子和啟動(dòng)子的500bpBglⅡ/PvuⅡ，以取代CMV啟動(dòng)子和促進(jìn)子，而且質(zhì)粒4B具有編碼人Cγ1的7KbHindⅢ/BamHI片段，并恒定區(qū)外顯子下游有更長(zhǎng)的順序。
本發(fā)明涉及通過(guò)體內(nèi)同源重組，使用新的重組DNA載體致使所需順序改變到基因組內(nèi)一特殊定位上，以生產(chǎn)嵌合抗體的方法。使用本發(fā)明的方法，可用一適當(dāng)“靶載體”轉(zhuǎn)染抗體生成細(xì)胞系，對(duì)抗體分子的蛋白質(zhì)順序進(jìn)行修飾。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用本發(fā)明的包含編碼“置換基因”及“靶順序”之重組DNA分子的靶載體轉(zhuǎn)染可產(chǎn)生具有預(yù)期抗原特異性之抗體分子的細(xì)胞系。用編碼所需分子的置換基因去取代由細(xì)胞系表達(dá)的抗體分子的全部或部分恒定區(qū)。例如，置換基因可編碼具有特定效應(yīng)物功能、類型和/或來(lái)源之全部或部分的免疫球蛋白恒定區(qū)，其包括但不只限于人或其他種動(dòng)物的IgG、IgA、IgM、IgD和IgE恒定區(qū);另外，置換基因可編碼能賦予所得嵌合抗體以某種其他功能的另一類型的分子，如酶、毒素、生物活性肽、生長(zhǎng)因子、抑制劑、可連接的肽銜接子等。靶載體的靶順序與見于染色體內(nèi)的DNA順序同源，后者則處于由被轉(zhuǎn)染之細(xì)胞系產(chǎn)生的免疫球蛋白的恒定區(qū)的成熟基因編碼順序或恒定區(qū)成熟編碼順序的適當(dāng)部分之內(nèi)或與之相鄰接。轉(zhuǎn)染后，將在抗體生成細(xì)胞系內(nèi)產(chǎn)生同源重組;某些重組過(guò)程將導(dǎo)致免疫球蛋白之全部或部分恒定區(qū)被置換基因所取代，并因此而導(dǎo)致由被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)嵌合抗體分子。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，用含有置換基因的靶載體來(lái)轉(zhuǎn)染可產(chǎn)生具有預(yù)期恒定區(qū)之抗體分子的細(xì)胞系，所說(shuō)的置換基因可編碼具有預(yù)期之抗原特異性的全部或部分可變區(qū)，且所說(shuō)的靶載體還含有指導(dǎo)宿主細(xì)胞染色體中全部或部分可變編碼區(qū)之基因修飾的靶順序。轉(zhuǎn)染后，在抗體生成細(xì)胞系內(nèi)將發(fā)生同源重組;其中某些重組過(guò)程將導(dǎo)致免疫球蛋白基因的全部或部分可變區(qū)被置換蛉〈傭靡栽詒蛔鞠赴斜澩鍇逗峽固宸腫印 在鑒定出表達(dá)嵌合抗體的轉(zhuǎn)染體后，本發(fā)明的實(shí)踐即包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)染體并使用已知的分離單克隆抗體的技術(shù)由細(xì)胞培養(yǎng)物上清中分離出嵌合抗體分子。此外，亦可在動(dòng)物的腹水液中培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并使用已知的分離單克隆抗體技術(shù)收獲之。
下面將更詳細(xì)地描述并用實(shí)施例來(lái)證明本發(fā)明的各個(gè)方面，實(shí)施例中涉及生產(chǎn)小鼠/人嵌合免疫球蛋白重鏈。為了討論得更清楚，將依下列次序描述(a)靶載體;(b)轉(zhuǎn)染以及(c)產(chǎn)生嵌合抗體分子之轉(zhuǎn)染體的篩選和選擇。
靶載體如前面已解釋過(guò)的，本發(fā)明的靶載體為包括但不只限于質(zhì)粒、噬菌體、噬菌體質(zhì)粒(Phagemids)、裝配型質(zhì)粒和病毒等重組DNA載體，其包含有置換基因和靶順序。如下面將詳細(xì)述及的，置換基因可包括任何編碼預(yù)期結(jié)構(gòu)產(chǎn)物的基因，而靶順序則可依據(jù)被轉(zhuǎn)化之抗體分子類型及被轉(zhuǎn)染之動(dòng)物細(xì)胞類型而有所不同。靶順序和置換基因定位于靶載體中，使適當(dāng)?shù)目贵w生成細(xì)胞系被靶載體轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生有針對(duì)性的同源重組，致使因置換基因位點(diǎn)特異性地插入抗體基因中而完成基因轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的靶載體可包含一編碼可選擇標(biāo)志(如藥物抗性、酶)的附加基因，以有助于篩選或選擇轉(zhuǎn)染體或可被這樣的標(biāo)志共轉(zhuǎn)染。另外還可包括有利于提高重組過(guò)程發(fā)生的其他順序。這樣的基因可包括但不只限于原核或真核生物重組酶如RECA、拓?fù)洚悩?gòu)酶、REC1或其他可提高重組頻率的DNA順序如CHI。各種蛋白質(zhì)，如由前述基因編碼的蛋白質(zhì)也可被轉(zhuǎn)染，以提高重組頻率。下面將描述可用于本發(fā)明之方法的各種靶順序、置換基因及可選擇標(biāo)志。
靶順序靶順序的組分可依據(jù)于是否靶質(zhì)粒被用于取代輕鏈或重鏈的全部或部分可變或恒定區(qū)基因而定，另外還取決于抗體生成宿主細(xì)胞的動(dòng)物種屬。更具體地說(shuō)，靶順序應(yīng)與相鄰或側(cè)接于將被置換或改變之恒定或可變區(qū)的編碼區(qū)或其部分的順序同源。
例如在染色體內(nèi)，在成熟重鏈基因的5′未端可包括VDJ區(qū)，即可變區(qū)(V)、多樣區(qū)(D)和連接區(qū)(J)，之后是不被表達(dá)的余留J區(qū)(J區(qū)的數(shù)目隨動(dòng)物種而異)以及內(nèi)含子順序?；虻闹行暮?′部分由恒定區(qū)外顯子(與內(nèi)含子及非翻譯順序側(cè)接的和分散的)所組成，其可為任何類型(如mu、δ、γ、ε、α)的并各與其自身相鄰的開關(guān)區(qū)相關(guān)聯(lián)。因此，用于抗體生成宿主細(xì)胞之重鏈基因中目的同源重組的靶順序可包括一與抗體基因之任何部分(取決于預(yù)期的改變)同源的區(qū)域。例如，涉及重鏈恒定區(qū)置換的靶順序可包括與跨越任何區(qū)域并包含或不包含從V、D或J區(qū)開始之開關(guān)區(qū)的順序同源的順序，并應(yīng)適當(dāng)?shù)囟ㄎ挥诎休d體的結(jié)構(gòu)中;即定位于5′端至置換基因的編碼區(qū)。實(shí)際使用的靶順序可隨著目的宿主細(xì)胞的動(dòng)物種屬及被目的宿主細(xì)胞表達(dá)的抗體類別而異。
與重鏈基因在染色體內(nèi)的排布相反，成熟的輕鏈基因則包含位于其5′端的VJ區(qū)、內(nèi)含子順序及單一的恒定區(qū)外顯子。因此，用于抗體生成宿主細(xì)胞內(nèi)輕鏈基因中目的同源重組的靶順序可包括與基因的任何部分同源的區(qū)域(依據(jù)預(yù)期的改變而有所不同)。例如，用于置換輕鏈恒定區(qū)的靶順序可與通過(guò)內(nèi)含子順序跨越全部或部分適當(dāng)V和J導(dǎo)向輕鏈恒定區(qū)之編碼區(qū)域的順序同源。這樣的靶順序應(yīng)適當(dāng)?shù)囟ㄎ挥诎匈|(zhì)粒中;如5′端至置換基因的編碼順序處。同樣地，靶順序的實(shí)用核苷酸順序可隨著目的宿主抗體生成細(xì)胞的動(dòng)物種屬而異。
除了上述的順序外，靶順序還可包括與恒定的重或輕鏈編碼區(qū)之5′和/或3′末端相鄰的區(qū)域同源的順序，并因而應(yīng)定位于靶載體的結(jié)構(gòu)中，即分別定位于5′和/或3′端至置換基因的編碼區(qū)。相似地，用于置換重或輕鏈可變區(qū)的靶順序可包括與側(cè)接于可變區(qū)之全部或部分適當(dāng)區(qū)域同源的順序。在任何情況下，靶順序還可包括側(cè)接于外顯子內(nèi)之區(qū)域的編碼區(qū)順序，在這里(外顯子內(nèi))只有可變或恒定區(qū)的一部分將被置換，從而使被表達(dá)的蛋白質(zhì)以一種預(yù)期的方式得以改變。
置換基因如前面已解釋過(guò)的，用于轉(zhuǎn)化抗體恒定區(qū)的置換基因可包括人或動(dòng)物不同類型免疫球蛋白之全部或部分恒定區(qū)的編碼順序。因此，在表達(dá)重鏈時(shí)，置換基因可包括編碼人IgG、IgD、IgM、IgE和IgA或其任何亞類之恒定區(qū)的全部或部分基因。另外，置換基因可編碼能為被表達(dá)的嵌合分子提供某些不同的效應(yīng)物功能的產(chǎn)物，例如酶、毒素、生長(zhǎng)因子、生物活性肽、銜接子等。置換基因亦可由任何結(jié)合方式的上述順序組成，如連接到新的蛋白質(zhì)順序上的全部或部分抗體恒定區(qū)。
對(duì)置換基因的選擇，部分取決于被表達(dá)的嵌合抗體分子的使用目的。例如，如果準(zhǔn)備用于人體治療目的，則置換基因可編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)，最好是一類有意欲用于人體治療目的之預(yù)期效應(yīng)物功能的蛋白產(chǎn)物。如果想要改善或改變抗體已有的效應(yīng)物功能，則可用能賦予所得嵌合抗體分子以這種改善或改變了的效應(yīng)物功能的順序置換一部分恒定區(qū)。如果希望在體內(nèi)有針對(duì)性地釋放一種酶、毒素、藥物、激素或生長(zhǎng)因子，則應(yīng)使用編碼該酶、毒素、藥物，激素或生長(zhǎng)因子或進(jìn)行這種連接所需之銜連子的置換基因。如果是將嵌合抗體用于診斷檢測(cè)，例如利用標(biāo)記的抗體時(shí)，即可使用編碼一種酶或其底物的置換基因。這種酶/底物系統(tǒng)包括但不只限于當(dāng)反應(yīng)時(shí)可產(chǎn)生呈色產(chǎn)物的物質(zhì)。例如，β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶等。所得到的嵌合抗體可在有或沒有進(jìn)一步修飾的、意欲與酶、藥物、毒素、激素、生長(zhǎng)因子等進(jìn)行化學(xué)連接的方法中用作標(biāo)記抗體。
用以轉(zhuǎn)化抗體可變區(qū)的置換基因可包括限定預(yù)期抗原之抗體分子可變區(qū)的全部或部分編碼順序。它們可編碼限定相關(guān)或完全無(wú)關(guān)抗原的抗原結(jié)合區(qū)。如果希望改善或改變抗原結(jié)合或特異性，可用賦予所得嵌合抗體分子以這種改善或改變了的結(jié)合或特異性的順序置換一部分可變區(qū)。
選擇標(biāo)志和其他構(gòu)件除了靶順序和置換基因外，本發(fā)明的靶載體可編碼一有助于篩選或選擇已被成功地轉(zhuǎn)化之抗體生成細(xì)胞的可選擇標(biāo)志。這樣的標(biāo)志包括藥物抗性基因如gpt、neo、his等及其類似物。
靶載體中還可包括提高重組機(jī)會(huì)(數(shù)目)的附加構(gòu)件，例如構(gòu)建物中可包括溫度敏感性復(fù)制原點(diǎn)(ori)(如多瘤tsAori系統(tǒng))，以使轉(zhuǎn)染體能在導(dǎo)致載體復(fù)制的允許溫度下生長(zhǎng)，從而增加靶順序和置換基因的拷貝數(shù)，并可繼而增加重組的數(shù)目。亦可利用其他ori系統(tǒng)來(lái)增加拷貝數(shù)(如EBVori遞增因子、BPVori遞增因子或SV40ori及T抗原)。
用靶載體轉(zhuǎn)染抗體生成細(xì)胞系根據(jù)本發(fā)明的方法，用適宜的靶載體轉(zhuǎn)染可產(chǎn)生預(yù)期抗體(即具有預(yù)期抗原特異性或預(yù)期恒定區(qū)的抗體)的細(xì)胞系，以產(chǎn)生能夠進(jìn)行位點(diǎn)針對(duì)性同源重組的轉(zhuǎn)染體。可用輕鏈和重鏈靶載體轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)目贵w生成細(xì)胞系;然而在許多情況下，用重鏈靶載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染可能不足以獲得嵌合抗體分子的表達(dá)。
可用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已知的方法完成轉(zhuǎn)染，包括但不只限于磷酸鈣沉淀法、電擊法、微量注射法、脂質(zhì)體融合法、RBC影細(xì)胞融合法及原生質(zhì)體融合法等。在轉(zhuǎn)染之前可用限制性酶在靶順序內(nèi)將靶載體切成線形，以增加已轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)同源重組的可能性。
重組體的篩選和選擇進(jìn)行成功地轉(zhuǎn)化、同源重組及針對(duì)靶基因的修飾的最終試驗(yàn)即是由抗體生成細(xì)胞系生產(chǎn)嵌合抗體?？筛鶕?jù)置換基因產(chǎn)物的性質(zhì)，用多種方法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生嵌合抗體的轉(zhuǎn)染體。
如果靶載體含有一可選擇標(biāo)志，對(duì)已轉(zhuǎn)染之細(xì)胞最初的篩選應(yīng)是選擇表達(dá)該標(biāo)志的細(xì)胞。例如，當(dāng)使用藥物抗性基因時(shí)，可在初步篩選過(guò)程中鑒定出能生長(zhǎng)在含有其致死性藥物之選擇培養(yǎng)基中的那些轉(zhuǎn)染體。第二次篩選就需要鑒定那些能表達(dá)嵌合抗體的轉(zhuǎn)染體。
第二次篩選的操作方法取決于置換基因的性質(zhì)。例如，可使用對(duì)特殊類型和/或種屬來(lái)源的免疫球蛋白特異的抗體，以免疫檢測(cè)法檢測(cè)編碼不同類型或來(lái)源之抗體恒定區(qū)的置換基因的表達(dá);另外，可用生物分析法檢驗(yàn)由置換基因賦予的特定效應(yīng)物功能。可通過(guò)分析特定的生物學(xué)活性來(lái)檢測(cè)編碼酶、毒素、生長(zhǎng)因子或其他肽等生物活性分子之置換基因的表達(dá);例如，可使用適當(dāng)?shù)拿傅孜?、或毒素、生長(zhǎng)因子、激素等的靶材料來(lái)檢測(cè)已轉(zhuǎn)染細(xì)胞的產(chǎn)物;另外亦可使用對(duì)置換基因產(chǎn)物特異的抗體對(duì)這些置換基因產(chǎn)物進(jìn)行免疫學(xué)檢驗(yàn)。
還應(yīng)檢測(cè)表達(dá)置換基因的轉(zhuǎn)染體的適當(dāng)抗原識(shí)別能力。為此可使用原始和嵌合抗體以適當(dāng)?shù)拿庖叻治龇?包括競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析)來(lái)完成這一檢測(cè)。這些篩選試驗(yàn)不需要相繼進(jìn)行，而事實(shí)上可使用“夾心法”同時(shí)進(jìn)行，其中使用限定置換基因產(chǎn)物(即恒定區(qū)或可變區(qū))的俘獲抗體來(lái)固定嵌合抗體并檢測(cè)(即分別使用標(biāo)記的抗原或標(biāo)記的抗體)是否存在未改變的部分(即分別檢測(cè)未改變的可變區(qū)或未改變的恒定區(qū))。例如，可使用抗原俘獲嵌合抗體并可使用限定置換基因產(chǎn)物的標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)恒定區(qū)置換基因產(chǎn)物，或通過(guò)分析被俘獲的嵌合抗體來(lái)檢測(cè)置換基因產(chǎn)物(如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子等)的生物學(xué)活性。另外，可將嵌合抗體固定于恒定區(qū)(如使用對(duì)該區(qū)域特異的抗體或葡萄球菌A蛋白等)并可使用標(biāo)記的抗原或抗個(gè)體基因型抗體檢測(cè)可變區(qū)基因產(chǎn)物。
實(shí)施例Ⅰ.用人γ1免疫球蛋白的恒定區(qū)置換小鼠免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)下述實(shí)施例涉及含有小鼠靶順序(編碼第4連接區(qū)和重鏈基因的促進(jìn)子)之靶質(zhì)粒的構(gòu)造，其中所說(shuō)的靶順序與編碼人γ1免疫球蛋白(hulgG1)恒定區(qū)的置換基因相連。該靶質(zhì)粒與含有編碼小鼠重鏈之整個(gè)成熟基因(整個(gè)可變區(qū)和恒定區(qū))的噬菌體一起使用，以共轉(zhuǎn)染為重鏈突變體(原來(lái)只表達(dá)輕鏈)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞。篩選已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并
定表達(dá)人IgG1重鏈的克隆。這些實(shí)驗(yàn)證明了成功的同源重組過(guò)程、在宿主細(xì)胞染色體內(nèi)的整合、以及人γ1基因在小鼠細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)。
1.材料和方法除特別指出者外，下述實(shí)施例中均使用下列材料和方法。
(1)轉(zhuǎn)染用2mMMgCl2和2mMCaCl2于4℃洗滌并重懸在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)中的約107個(gè)細(xì)胞，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)用鋁箔襯里的無(wú)菌塑料試管(Bio Rad，CA)中。加入線形化的DNA并混合之，達(dá)到終濃度10-100μg/ml，然后用適當(dāng)電源提供電荷(如用Gene Pulsar，Bio Rad，CA)。輕輕敲打試管以確保充分混合。室溫處理2分鐘后，將細(xì)胞移入37℃含10%FBS的9ml RPMI培養(yǎng)基(GIBCO)中。保溫48小時(shí)后，離心收集存活的細(xì)胞，計(jì)數(shù)并以每小井103個(gè)細(xì)胞的密度在96井平板中鋪敷，或者以每小井104細(xì)胞在含有10%FBS、青霉素(60mg/ml)/鏈霉素(100mg/ml)、丙酮酸鈉(1mM)、L-谷氨酰胺(292mg/ml)和0.1-2μg/ml霉酚酸或1-2mg/mlG418的RPMI培養(yǎng)基內(nèi)加于24小井平板中。每2至3天補(bǔ)充或更換一次同樣培養(yǎng)基。2-3周后計(jì)數(shù)各小井內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)。然后用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)物上清中是否存在人γ1，并克隆和再次篩選陽(yáng)性小井內(nèi)的細(xì)胞。
(2)篩選成功地形成重組體的轉(zhuǎn)染體使用以100μl羊抗人IgG(Antibodies Inc，Davis，CA)(在包被緩沖液(0.1M NaHCO3，pH9.6)中以1∶1000稀釋)或羊抗小鼠IgA(Cappel)(在上述包被緩沖液中以1∶5000稀釋)于4℃過(guò)夜包被的immulon2平板(Dynatec Labs，Chantilly，VA)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。然后用樣品稀釋液(Genetic Systems)充滿平板于室溫下阻斷1小時(shí)，然后取出，封口并于4℃儲(chǔ)存不超過(guò)3周。將平板用洗滌緩沖液(0.15M NaCl、0.05%V/V Tween20)洗三次，然后加入100μl標(biāo)準(zhǔn)樣品(在適當(dāng)培養(yǎng)基中稀釋的)或培養(yǎng)物上清液并于37℃保溫1小時(shí)，準(zhǔn)備進(jìn)行檢測(cè)分析。將平板用洗滌緩沖液洗3次后即用100μl辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合的羊抗人IgG(American Qualex)(1∶6000稀釋)、HRP-羊抗小鼠IgA(Cappel)(1∶5000稀釋)或HRP-羊抗小鼠λ(Southern Biotech.Ass.Inc.，Birmingham，AL)(1∶3000稀釋)于37℃保溫1小時(shí)以檢測(cè)結(jié)合的抗體。然后用洗滌緩沖液將平板洗3次并在室溫下與在緩沖之底物中以1∶100稀釋的TMB鉻精(Genetic Systems)保溫15分鐘，用100μl/小井的3MH2SO4終止反應(yīng)，直接在微滴定平板讀數(shù)器(Genetic Systems)上于450/630nm處得到讀數(shù)。同樣可使用HRP-羊抗小鼠卡巴試劑(Southern Biotech.Ass.Inc)篩選卡巴生成細(xì)胞系。經(jīng)有限稀釋或在軟瓊脂糖膠中分離表達(dá)克隆以再克隆人IgG和/或小鼠IgA陽(yáng)性的細(xì)胞系。為了在軟瓊脂糖中克隆，將得自陽(yáng)性小井的大約1000個(gè)細(xì)胞重新懸浮于0.4%瓊脂糖中并在小鼠腹腔滲出液飼養(yǎng)細(xì)胞的瓊脂層上鋪層。使含有對(duì)人IgG1特異之抗血清的第三層附蓋1-2天，然后根據(jù)有無(wú)免疫沉淀來(lái)
定陽(yáng)性克隆。
(3)Southern和Vwestern吸印分析基本上按照最初由Blin和Stafford(Blin，N.和Stafford，D.W.，1976，NucleicAcidsRes.3∶2303)描述并且繼后由Maniatis、Fritsch和Sambrook(Maniatis等，1982，MolecularCloning-ALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，NY，P.280)述及的方法由細(xì)胞中分離高分子量DNA，所不同的是首先用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽緩沖鹽水(相對(duì)于使用Tris)洗細(xì)胞，并在用蛋白酶K處理(55℃)的同時(shí)進(jìn)行RNA酶處理。
按照原來(lái)由Southern(Southern，1975，J.Mol.Biol.98∶503)描述及最近由Maniatis、Fritsch和Sambrook(Maniatis等，1982，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，P.383-389)詳細(xì)討論的方法進(jìn)行Southern吸印和雜交分析。用于雜交的探針是含有人IgG1基因之第一恒定區(qū)的1.0Kb HindⅢ-PstⅠ片段，或編碼小鼠JH2和JH3基因片段的0.7kbHindⅢ-HindⅢ片段。按生產(chǎn)廠商推薦的方法使用切口轉(zhuǎn)譯試劑盒(BethesdaResearchLaboratories)標(biāo)記探針。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自BoehringerMannheimBiochemicals公司。
按照Towbin等人(Towbin等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76∶4350)所述的方法進(jìn)行Western印跡分析，所用顯色劑與用于ELISA法檢測(cè)者相同。
2.編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)之靶質(zhì)粒的構(gòu)建構(gòu)建包含細(xì)菌質(zhì)粒載體pRSV-140-neo的靶質(zhì)粒，向其中克隆一作為置換基因的含人r1恒定區(qū)基因的8.0kbHindⅢ-BamHI片段(圖2)。將靶基因，一個(gè)得自小鼠免疫球蛋白重鏈(IgH)座位的2.2kbHindⅢ片段(其含有第四連接區(qū)(J4)、IgH促進(jìn)子(e)和5′至開關(guān)區(qū)的內(nèi)含子順序)，插入至定位于5′至人γ1基因的HindⅢ位點(diǎn)中(圖2)。然后在小鼠靶順序內(nèi)的唯一XhaⅠ位點(diǎn)將該構(gòu)建物切成線形并用以前描述過(guò)的電擊方法轉(zhuǎn)染到下述小鼠骨髓瘤細(xì)胞系中。
3.轉(zhuǎn)染和同源重組下述的實(shí)驗(yàn)和結(jié)果證明，在靶質(zhì)粒和用于共轉(zhuǎn)染小鼠骨髓瘤宿主細(xì)胞的噬菌體內(nèi)含有的小鼠重鏈基因之間成功地進(jìn)行了同源重組。同源重組和向小鼠骨髓瘤宿主細(xì)胞染色體內(nèi)的整合，導(dǎo)致了人免疫球蛋白重鏈(IgG1)的表達(dá)。
(1)共轉(zhuǎn)染小鼠骨髓瘤細(xì)胞在靶順序的區(qū)域中將含有(a)編碼第四連接區(qū)(J4)、IgH促進(jìn)子和5′至開關(guān)區(qū)內(nèi)含子順序之小鼠靶順序，以及(b)編碼人IgG1恒定區(qū)之置換基因的靶質(zhì)粒切成線形，并與等摩爾比例的含功能性J558小鼠重鏈基因的噬菌體DNA克隆一起共轉(zhuǎn)染到重鏈突變的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(即J558L，其只表達(dá)輕鏈)中。然后根據(jù)人IgG蛋白的存在篩選已轉(zhuǎn)染的抗G418(由靶質(zhì)粒構(gòu)建物編碼的可選擇標(biāo)志)細(xì)胞系。因?yàn)樯鲜鲆褬?gòu)建的靶質(zhì)粒中所含有的人γ1恒定區(qū)缺乏免疫球蛋白啟動(dòng)子順序，所以檢測(cè)到由轉(zhuǎn)染的小鼠細(xì)胞系表達(dá)的人IgG蛋白即應(yīng)是轉(zhuǎn)染的DNA分子和宿主細(xì)胞染色體內(nèi)整合作用之間同源重組的結(jié)果。
(2)鑒定分泌嵌合免疫球蛋白的細(xì)胞再克隆分泌人IgG和/或小鼠IgA蛋白的轉(zhuǎn)染體。通過(guò)DNA印跡轉(zhuǎn)移分析進(jìn)一步肯定同源重組過(guò)程的存在，其中鑒定了一個(gè)新的重排限制性片段;該片段具有預(yù)期大小(10.5kb BamHI片段)并含有人γ1和小鼠JH2-JH3順序。另外可通過(guò)上清液蛋白質(zhì)的Western印跡分析獲得進(jìn)一步的證據(jù)，其證明了轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞(transfectoma)培養(yǎng)物上清液中存在有攜帶人IgG血清學(xué)決定基的約50千道爾頓(50kd)的蛋白鏈。還可根據(jù)較慢的電泳遷移率證明抗人IgG試劑并不與小鼠IgA反應(yīng)。
ELISA試驗(yàn)結(jié)果還顯示許多轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞上清液中存在小鼠IgA。這是由于功能性J558重鏈基因整合未被破壞的結(jié)果(即沒有經(jīng)受同源重組)?；趯?shí)驗(yàn)，比較表達(dá)和產(chǎn)生人IgG及小鼠IgA的水平，估計(jì)同源對(duì)非同源重組的頻率之比為30-80%。
根據(jù)上述結(jié)果可以肯定地證明(a)靶質(zhì)粒是如預(yù)想地那樣工作的;(b)骨髓瘤細(xì)胞介導(dǎo)同源重組的能力是很強(qiáng)的。
可使用與可變區(qū)基因片段之上游和/或下游區(qū)同源的順序，結(jié)合可變區(qū)基因片段或其部分以改變抗原親和力和/或特異性。再者，可使用本文所述的J558系統(tǒng)作為一篩選程序來(lái)鑒定重組促進(jìn)蛋白。
實(shí)施例Ⅱ生產(chǎn)對(duì)L20人腫瘤相關(guān)抗原有特異性的嵌合免疫球蛋白重鏈下述實(shí)驗(yàn)證明小鼠雜交瘤細(xì)胞可有效地介導(dǎo)同源重組，而且這種能力可以解釋為指導(dǎo)內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈座位的主要重組。構(gòu)建一含有人IgG1恒定區(qū)外顯子而且外顯子還側(cè)接有小鼠重鏈促進(jìn)子和抗新霉素基因的質(zhì)粒。通過(guò)對(duì)雜交瘤細(xì)胞系L20(其可產(chǎn)生對(duì)人腫瘤相關(guān)抗原特異的單克隆抗體，見1986年2月26日提交的專利申請(qǐng)834，172號(hào)，其列為本文參考文獻(xiàn))的內(nèi)源性重鏈座位的位點(diǎn)特異性修變，而將該構(gòu)建物用于指導(dǎo)抗原特異性嵌合重鏈Ig的產(chǎn)生。在已整合了該質(zhì)粒的雜交瘤細(xì)胞中，可見這種針對(duì)性修變的發(fā)生頻率為0.5%(200個(gè)中有1個(gè))。
1.構(gòu)建靶載體并轉(zhuǎn)染雜交瘤L20構(gòu)建一含有人IgG1之恒定區(qū)外顯子(Cg1)且該外顯子側(cè)接有小鼠重鏈促進(jìn)子(MHE)及新霉素抗性基因(NEO)的質(zhì)粒載體(圖3)。在位于與小鼠IgH座位共有之序列的2.2kb區(qū)內(nèi)的唯一XbaⅠ位點(diǎn)處將質(zhì)粒切成線形，按下述方法將該質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到雜交瘤細(xì)胞L20中(該細(xì)胞系產(chǎn)生對(duì)主要在人瘤細(xì)胞上表達(dá)之抗原特異的小鼠IgG1抗體)在唯一的XhaⅠ位點(diǎn)處將圖3所示的載體切成線形，并以電擊法用50μg轉(zhuǎn)染8×106個(gè)L20雜交瘤細(xì)胞(如材料和方法中所述)。將活細(xì)胞在含有2.5mg/ml G418之IMDM 10% FBS培養(yǎng)基中，以每小井1×104個(gè)(或用1×103個(gè)作頻率計(jì)算)細(xì)胞的密度在98小井平板中鋪板。每2-3天換一次培養(yǎng)基，2周后用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA技術(shù)檢測(cè)各小井內(nèi)有無(wú)人IgG1產(chǎn)生。用以1∶10，000稀釋的羊抗人IgG(Cat.＃4132AntibodiesInc.，DavisCA)作為俘獲試劑，并用以1∶6000稀釋的羊抗人IgG/HRP(Cat.＃HAP009AmericanQualex，LaMirada，CA)進(jìn)行檢測(cè)。還經(jīng)繼后的ELISA試驗(yàn)驗(yàn)證了所有陽(yáng)性上清液。
因?yàn)槿薎gG1外顯子與可變區(qū)基因片段無(wú)關(guān)，所以只能依靠質(zhì)粒與功能性啟動(dòng)子、起始密碼子和裂接順序的重組來(lái)生產(chǎn)人IgG1重鏈蛋白。為此可通過(guò)在含有G418之培養(yǎng)基中的細(xì)胞存活選擇(即選擇所有滿意地整合了質(zhì)粒的細(xì)胞)，而以ELISA法檢測(cè)人IgG1的產(chǎn)生(表1)表1導(dǎo)致人IgG1產(chǎn)生之整合的頻率每小井整合檢測(cè)的小井?dāng)?shù)總發(fā)生數(shù)小井W/HUIgG1頻率2.2480105680.75%通過(guò)以低密度鋪板來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染的頻率，從而觀察到導(dǎo)致人IgG1產(chǎn)生之整合作用的頻率為132個(gè)中有1個(gè)即0.75%;最近用同樣細(xì)胞及導(dǎo)致產(chǎn)生人IgG之質(zhì)粒所作實(shí)驗(yàn)表明整合頻率為512個(gè)中有2個(gè)，即0.39%，這些結(jié)果均提示平均頻率可能接近0.5%。引人注意的是，即使在克隆以后，仍發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞系可產(chǎn)生小鼠和人IgG1，雖然偶然也分離到只產(chǎn)生一種或另一種蛋白的克隆(表Ⅱ)。將得自產(chǎn)生人IgG1之親代小井的細(xì)胞以有限稀釋度鋪板，并分析得自各親代的12個(gè)克隆是否產(chǎn)生人IgG1(huIgG1)(如表1所示)及小鼠IgG。使用羊抗小鼠IgG(Cat＃1070SouthernBiotech，BirminghamAL)和羊抗小鼠卡巴/HRP(Cat＃OB1141-85FisherBiotech，OrangeburgNY)分別作俘獲和檢測(cè)試劑來(lái)檢測(cè)小鼠IgG(mIgG)。結(jié)果示于表Ⅱ中。所給數(shù)據(jù)為產(chǎn)生人抗體、小鼠抗體或兩者之克隆的數(shù)目。
表2來(lái)自產(chǎn)生人IgG1之L20轉(zhuǎn)染體的克隆中小鼠與人IgG1的產(chǎn)生親代huIgG1mIgGhuIgG1/mIgG7C500127E610118D600128F82288H12101110G302109F1101119F1210112.表達(dá)的嵌合L20重鏈的特征(1)Western印跡分析按下述方法對(duì)得自選擇之克隆的上清液作Western印跡分析，顯示人重鏈在血清學(xué)上是與其他不同的，并證明其有預(yù)期的大小范圍洗滌生長(zhǎng)水平接近于平臺(tái)部分的培養(yǎng)物并重新懸浮于無(wú)血清培養(yǎng)基中。24小時(shí)后收獲上清，對(duì)0.1M NH4OAc透析、凍干并重新懸浮于5mM Tris(pH6.8)中。這些樣品和親代細(xì)胞系L20的等分樣品加上純化的抗體2H9(一種人IgG1蛋白)，以及純化的小鼠L20IgG1，在β-巰基乙醇存在下經(jīng)加熱煮沸而變性，然后通過(guò)一濃度范圍為10-20%的丙烯酰胺梯度凝膠進(jìn)行電泳。將凝膠電泳轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上。用含2%無(wú)脂肪干乳粉的PBS封閉所得濾膜，用羊抗人IgG/HRP(＃10501 CALTAG，San Francisco CA)著染并用溶于Tris緩沖鹽水的30mg 4-氯-1-萘酚(Sigma，St.Louis MO)顯色。
(2)流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析通過(guò)下述的流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法(表Ⅲ)證明人和小鼠IgG1是抗原特異的以ELISA法檢測(cè)用于Western吸印分析的樣品，以確定小鼠和人IgG1的濃度。稀釋這些樣品以調(diào)整到適于進(jìn)行流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的濃度(μg/ml)。在所指出的L20抗體(或培養(yǎng)基)存在下將得自人腫瘤細(xì)胞系2981或3347(Hellstrom等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83∶7059-7063)的5×105個(gè)細(xì)胞于4℃保溫30分鐘，洗兩次并用1∶50稀釋(在培養(yǎng)基中)的羊抗人IgG/FITC(異硫氰酸熒光素)(CALTAG，San Francisco CA)或羊抗小鼠IgG/FITC(TAGO，Burlingame CA-重鏈和輕鏈特異的)于4℃染色30分鐘。然后將這些制備物洗兩次、再懸浮、并用流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析相對(duì)熒光強(qiáng)度。結(jié)果示于表Ⅲ中。數(shù)值是作為各制備物的線性熒光當(dāng)量(LFE)給出的。
表Ⅲ小鼠和人重鏈嵌合L20抗體的抗原特異性克隆抗體濃度LFE2981靶細(xì)胞huIgGmIgGα-huα-m7E6-101.003568H12-81.003878F8-81.00.539119H12-11.00.14278F8-1000.421010G3-501.0231mL2001.0218培養(yǎng)基00223347靶細(xì)胞α-huα-m7E6-100.4073mL2000.423培養(yǎng)基0022可見，親本L20細(xì)胞系很可能保留生產(chǎn)性重鏈等位基因的兩個(gè)拷貝，而其中只有一個(gè)在已知細(xì)胞內(nèi)經(jīng)歷了特異性重組。在10ml處于生長(zhǎng)平臺(tái)期的培養(yǎng)物上清液中，發(fā)現(xiàn)只表達(dá)嵌合抗體之克隆的生產(chǎn)水平為5-10μg/ml。
(3)Southern印跡分析使用對(duì)人Cγ1特異的探針進(jìn)行Southern印跡分析，用三種不同的酶證明在所有產(chǎn)生人IgG1的細(xì)胞系間均有特異片段的整合。L20親代細(xì)胞系中-BamHI位點(diǎn)在限制性酶切圖中顯示位于靶順序的1.4kb上游，因此，預(yù)期在靶位點(diǎn)插入重組載體可產(chǎn)生一能夠與huCγ探針雜交的5.5kbBamHI片段。每個(gè)產(chǎn)生人IgG1的克隆中均可觀察到這樣一個(gè)片段。
(4)ADCC分析以ADCC檢測(cè)法比較小鼠L20IgG1抗體與攜帶嵌合重鏈之蛋白質(zhì)的活性(Hellstrom等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82∶1499-1502)。由表Ⅳ所示的結(jié)果可以看出，將重鏈恒定區(qū)改變?yōu)槿薎gG1的重鏈恒定區(qū)即為這一特異性提供了一種新的效應(yīng)物功能。
表Ⅳ小鼠MAbL20和嵌合重鏈L20介導(dǎo)的2981靶細(xì)胞的ADCC免疫球蛋白濃度(μg/ml)2981靶細(xì)胞的ADCCL208F8-8458%L207E6-10853%MAbL201031%無(wú)＊0 31%＊只有效應(yīng)細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)3.使用不同靶載體產(chǎn)生的嵌合L20重鏈在進(jìn)一步的實(shí)施例中，我們使用了圖4A中所示的另一質(zhì)粒將人Cγ1外顯子引入小鼠雜交瘤細(xì)胞L20中，導(dǎo)致了人IgG1嵌合重鏈蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。將質(zhì)粒4A轉(zhuǎn)染到雜交瘤細(xì)胞系L20中，在對(duì)大約700個(gè)整合過(guò)程的ELISA試驗(yàn)中可見4個(gè)小井產(chǎn)生huIgG。
嵌合的G28.1重鏈的構(gòu)建在另一實(shí)施例中，我們使用圖3中所示的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化小鼠雜交瘤細(xì)胞系G28.1(Ledbetter等，LeukocytetypingⅢ，A.J.McMichaeled.，OxfordUniv.PressP.339-340，1987)以用同樣方法生產(chǎn)抗原特異性人IgG1重鏈。一次實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致864個(gè)整合過(guò)程中產(chǎn)生出4個(gè)huIgG1產(chǎn)生者細(xì)胞。按下述程序用ELISA法鑒定、證實(shí)這些細(xì)胞系、然后試驗(yàn)它們的結(jié)合扁桃體B細(xì)胞的能力將人扁桃體B細(xì)胞與得自所指出的細(xì)胞系(或培養(yǎng)基)的上清液一起保溫，洗滌并按前述方法用羊抗人IgG(αhu)或羊抗小鼠IgG(αm)反向染色，然后用流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行分析。結(jié)果示于表Ⅴ中。用ELISA法定量上清液中的小鼠和人IgG并以ng/ml為單位給出檢測(cè)數(shù)值。熒光數(shù)據(jù)以線性熒光當(dāng)量(Iinearfluorescenceequivalents)表示。
表Ⅴ重鏈嵌合G28.1上清液的抗原特異性細(xì)胞系huIgGmIgGLFEα-hu11F1008791F119789934F58691383D2908677
3D11568516培養(yǎng)基009α-mG28.108353培養(yǎng)基003這些結(jié)果再次表明攜帶人IgG1嵌合重鏈的抗體分子保留了抗原特異性。
嵌合的L6重鏈的構(gòu)建將圖4B中所示的重組的靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到形成單一細(xì)胞系的小鼠雜交瘤細(xì)胞系L6中，后者則形成能穩(wěn)定地產(chǎn)生嵌合重鏈的克隆(在沒有小鼠重鏈的情況下)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該抗體可結(jié)合人腫瘤細(xì)胞并通過(guò)ADCC(用人效應(yīng)細(xì)胞)介導(dǎo)瘤細(xì)胞破壞，其效力比小鼠L6更強(qiáng)(表Ⅵ)，而與用常規(guī)重組技術(shù)產(chǎn)生的重鏈和輕鏈嵌合L6的作用差不多(見1984年12月21日提交的684，759號(hào)專利申請(qǐng)和1985年10月18日提交的776，321號(hào)專利申請(qǐng)，兩者均列為本文參考文獻(xiàn))。
表Ⅵ由小鼠MAbL6和嵌合重鏈L6介導(dǎo)的2981靶細(xì)胞的ADCC免疫球蛋白濃度(μg/ml)3347靶細(xì)胞的ADCCL67B7.160.0183%L67B7.70.0182.5%MAbL60.0158%
無(wú)＊0.01 53%＊只加效應(yīng)細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)Southern印跡進(jìn)一步肯定了10kbAva片段及8kbBglⅡ片段的存在，此兩者均與huCg1探針雜交?；谝郧皩?duì)已克隆的基因組L6重鏈可變區(qū)基因片段的限制性酶切圖分析，表明這些片段與載體質(zhì)粒在靶位點(diǎn)處的插入相符。
本發(fā)明并不只限于實(shí)施例中所公開的范圍，這些實(shí)施例旨在舉例闡明本發(fā)明的不同方面，而且功能上等同的各種方法亦屬于本發(fā)明之范圍內(nèi)的。除了本文所給出和描述的內(nèi)容外，對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，根據(jù)前面描述所作的種種改動(dòng)應(yīng)是顯而易見的。這些改動(dòng)將落入待批權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)嵌合抗體分子的方法，其包括(a)用包含(i)一置換基因，其可修飾一編碼由一抗體生成細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體之一部分的順序，和(ii)一靶順序，該順序與相鄰于被修飾之抗體順序的第二DNA順序同源-的靶載體轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系，從而使置換基因通過(guò)體內(nèi)位點(diǎn)特異性同源重組來(lái)修飾抗體順序；以及(b)選擇產(chǎn)生嵌合抗體分子的轉(zhuǎn)染體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中被修飾的抗體分子包括一恒定區(qū)基因或其部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中置換基因編碼第一抗體恒定區(qū)或其部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中置換基因編碼一種酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子或銜接子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中被修飾的抗體順序包括可變區(qū)基因或其部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中置換基因編碼第二抗體可變區(qū)或其部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中被修飾的抗體順序包括一重鏈基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中靶順序與相鄰于被修飾之重鏈基因的V、D、J、或開關(guān)區(qū)或內(nèi)含子同源。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中被修飾的抗體順序包括一輕鏈基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中靶順序與相鄰于被修飾之輕鏈基因的V、D或J區(qū)或內(nèi)含子同源。
11.一種生產(chǎn)嵌合抗體分子的方法，其包括(a)培養(yǎng)一嵌合抗體生成細(xì)胞系，該細(xì)胞系是用包含(ⅰ)一置換基因，其可修飾一編碼由該細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體之一部分的順序，和(ⅱ)一靶順序，該順序與相鄰于被修飾之抗體順序的第二DNA順序同源-的靶載體轉(zhuǎn)染該抗體生成細(xì)胞系而制得的，從而使置換基因通過(guò)體內(nèi)位點(diǎn)特異性同源重組來(lái)修飾抗體順序并由被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系表達(dá)嵌合抗體;以及(b)由培養(yǎng)物中分離嵌合抗體分子。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或11的方法，其中嵌合抗體分子包括一小鼠來(lái)源的可變區(qū)和一人類來(lái)源的恒定區(qū)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或11的方法，其中嵌合抗體分子包括一與酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子或銜接子連接的可變區(qū)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中被轉(zhuǎn)染的抗體生成細(xì)胞系產(chǎn)生單克隆抗體L6。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中被轉(zhuǎn)染的抗體生成細(xì)胞系產(chǎn)生單克隆抗體L6。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中抗體生成細(xì)胞系包括寄存于ATCC登記號(hào)為HB 8677的細(xì)胞系。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中抗體生成細(xì)胞系包括寄存于ATCC登記號(hào)為HB 8677的細(xì)胞系。
18.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中被轉(zhuǎn)染的抗體生成細(xì)胞系產(chǎn)生單克隆抗體L20。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中抗體生成細(xì)胞系包括寄存于ATCC登記號(hào)為HB8913的細(xì)胞系。
20.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中被轉(zhuǎn)染的抗體生成細(xì)胞系產(chǎn)生單克隆抗體L20。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中抗體生成細(xì)胞系包括寄存于ATCC登記號(hào)為HB8913的細(xì)胞系。
全文摘要
描述了使用新的重組DNA載體和同源重組生產(chǎn)嵌合抗體的方法?？墒褂帽景l(fā)明的重組DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染抗體生成細(xì)胞，從而在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中發(fā)生有針對(duì)性的同源重組，導(dǎo)致基因修飾并由被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生嵌合抗體分子。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1033290SQ88107368
公開日1989年6月7日 申請(qǐng)日期1988年10月26日 優(yōu)先權(quán)日1987年10月27日
發(fā)明者金·R·福爾杰·布魯斯, 亨利·佩里·費(fèi)爾 申請(qǐng)人:昂科金公司