專利名稱：具有低乙酸形成能力的微生物以及用該微生物生產(chǎn)有用物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型微生物，具體地說是大腸桿菌，與野生型大腸桿菌相比，該微生物的乙酸形成能力較低;本發(fā)明也涉及通過培養(yǎng)密度的該微生物而生產(chǎn)一種高產(chǎn)率的有用物質(zhì)的方法。這里所用的“乙酸形成能力”、“形成乙酸的能力”等術(shù)語指在適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)按細(xì)菌干重計(jì)所積累乙酸的量。
利用化學(xué)方法合成象蛋白質(zhì)或維生素等有用物質(zhì)需要復(fù)雜的過程，因而花費(fèi)過大。于是人們開始利用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)這些物質(zhì)。
生物素是一種動(dòng)物、植物及微生物所必需的維生素，可用作飼料、輸液等的添加劑。人們已指望通過這類發(fā)酵法獲得生物素。日本未審專利公開(KoKai)號(hào)61-202686、62-155081以及WO87101391公開了利用經(jīng)遺傳工程技術(shù)改良的大腸桿菌菌株制備生物素的方法。
一般來說，當(dāng)使用微生物生產(chǎn)該物質(zhì)時(shí)，在帶有分批進(jìn)料培養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生高密度的微生物不失為一種有效方式，不管是從產(chǎn)物產(chǎn)量的增加來說，還是從發(fā)酵罐的有效利用及產(chǎn)物的有效回收來說，均是如此。對(duì)于大腸桿菌來說，通過高密度培養(yǎng)，可獲得許多優(yōu)點(diǎn)，尤其對(duì)于經(jīng)遺傳工程技術(shù)改良的大腸桿菌來說更是如此。但是，對(duì)于大腸桿菌來說，由于營(yíng)養(yǎng)物的代謝而形成乙酸，且在液體培養(yǎng)基中大量積累，從而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，難以實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)。能解決上述問題從而達(dá)到高密度培養(yǎng)的已知方法就是透析或過濾培養(yǎng)法，它是通過透析或過濾液體培養(yǎng)基而從培養(yǎng)系統(tǒng)中除去形成的乙酸。
還有人建議給培養(yǎng)物加壓，也就是使用純氧氣氣體而使液體培養(yǎng)基的溶解氧維持高濃度，從而抑制形成的乙酸量(Matsui等，SynopsesofPresentationsonConventionin1986，F(xiàn)ernnertationEngineeringAssociationofJapan，p206)。
但不管怎樣，透析或過濾培養(yǎng)必然帶來一些問題，例如，必需使用排除設(shè)備，或進(jìn)行復(fù)雜的設(shè)備檢修，因而是不經(jīng)濟(jì)的，或不實(shí)用的。而且，被大腸桿菌產(chǎn)生且已積累的某些有用物質(zhì)(如生物素)會(huì)與乙酸一起被從液體培養(yǎng)物中透析或過濾掉，從而在回收該有用物質(zhì)的步驟中必需處理大量的含有低濃度該物質(zhì)的液體。使得進(jìn)行高密度培養(yǎng)而獲得的優(yōu)越性幾乎完全喪失。通過給培養(yǎng)物加壓來培養(yǎng)高密度大腸桿菌使得培養(yǎng)過程中的控制或條件復(fù)雜化，且不易達(dá)到。
從不同于現(xiàn)有技術(shù)的角度(即從對(duì)大腸桿菌進(jìn)行遺傳改良的角度)進(jìn)行各種研究以彌補(bǔ)上述缺陷之后，本發(fā)明成功地獲得了野生型大腸桿菌的人工突變菌株，該菌株顯示了低乙酸合成能力，其合成能力僅為野生型的1/5或更少。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用該突變菌株生產(chǎn)有用物質(zhì)時(shí)，能夠很容易的達(dá)到高密度培養(yǎng)，而不會(huì)遇到形成的乙酸對(duì)生長(zhǎng)活性的抑制，即使不使用特異的培養(yǎng)方法(如透析、過濾、培養(yǎng)物加壓法等)時(shí)也是如此。而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這些突變菌株可被具有與有用物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)的遺傳信息的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，例如，當(dāng)將含有生物素操縱子的重組載體引入突變菌株且培養(yǎng)產(chǎn)生的菌株時(shí)，不僅該菌株的細(xì)胞能夠達(dá)到高密度，其生長(zhǎng)活性不被乙酸抑制，而且還能夠維持該生長(zhǎng)活性，從而使中間代謝物脫硫生物素(dethiobiotin)有效地代謝為生物素，極大地增加生物素的產(chǎn)量。而在常規(guī)的培養(yǎng)方法中，脫硫生物素是作為生物素生物合成的中間物保留和積累于液體培養(yǎng)基中的。另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過向液體培養(yǎng)物中加入預(yù)定量的丙氨酸可極大地增加所產(chǎn)生的脫硫生物素及生物素的產(chǎn)量。
因此，本發(fā)明涉及大腸桿菌，該大腸桿菌的特征在于其形成乙酸的能力最多為野生型大腸桿菌的1/5。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及其特征在于其形成乙酸能力最多為野生型大腸桿菌的1/5的大腸桿菌，并且該大腸桿菌含有攜帶與有用物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)的遺傳信息的重組質(zhì)粒。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)有用物質(zhì)的方法，其特征在于培養(yǎng)高密度的大腸桿菌(該大腸桿菌具有至多為野生型大腸桿菌1/5的形成乙酸能力，且含有攜帶與有用物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)的遺傳信息的重組質(zhì)粒)，然后回收產(chǎn)生的有用物質(zhì)。


圖1表示了如實(shí)施例3所解釋的pXBA312質(zhì)粒的制備方法。
本發(fā)明微生物的制備其形成乙酸能力至多為野生型大腸桿菌的1/5的大腸桿菌菌株(下面稱作AD突變株)可通過下述方法獲得對(duì)野生型大腸桿菌進(jìn)行常規(guī)的誘變處理，將產(chǎn)生的細(xì)菌細(xì)胞在合適的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，然后測(cè)定液體培養(yǎng)基中細(xì)菌細(xì)胞的濃度以及所積累的乙酸量，篩選乙酸形成能力為野生型大腸桿菌1/5的AD突變株。在一最佳實(shí)施方案中，首先從經(jīng)誘變處理而獲得的細(xì)菌細(xì)胞中篩選氟乙酸鈉抗性大腸桿菌突變株(以下稱作FR突變株)，然后從這些FR突變株中篩選乙酸形成能力比大腸桿菌低的菌株。這是因?yàn)?，在許多情況下低乙酸形成能力的大腸桿菌能夠在FR突變株中發(fā)現(xiàn)。
具體地說，首先將野生型大腸桿菌進(jìn)行常規(guī)誘變處理，例如用誘變劑N-甲基-N′-硝基-N亞硝基胍處理，將產(chǎn)生的細(xì)胞用緩沖液適當(dāng)稀釋，然后在含有氟乙酸鈉及作為唯一碳源的脯氨酸的基本瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)。再通過釣取菌落法分離產(chǎn)生的菌落，它們?yōu)镕R突變菌株。在合適的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)分離出的FR突變菌株，通過液相層析或使用酶反應(yīng)的試劑盒(F試劑盒BoehringerMannheimYamanouchi)或其他類似方法測(cè)定每一培養(yǎng)基積累的乙酸量，然后篩選并收集其乙酸形成能力至多為野生型大腸桿菌1/5的AD突變株。產(chǎn)生的該菌株具有低乙酸形成能力且對(duì)氟乙酸鈉具有抗性。如果在溶解氧不可不足的條件下于常規(guī)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)于野生型大腸桿菌而言，培養(yǎng)基中每份細(xì)菌干重所積累的乙酸量一般為0.5-1.5，而對(duì)本發(fā)明的AD突變株來說，則為0.1或更少。每份細(xì)菌干重所積累的乙酸量為積累的乙酸量(g/l)除以細(xì)胞濃度(g/l)所得的商。
解除了生物素的反饋抑制的大腸桿菌株(以下簡(jiǎn)稱為DR突變株)可取代野生型大腸桿菌株，用作進(jìn)行同樣的誘變處理親代菌株，以獲得具有低乙酸形成能力且對(duì)氟乙酸鈉具有抗性的突變株，其生物素反饋抑制已被解除，這種DR突變株包括大腸桿菌DRK-332〔FERMBP-2113;這里所引用的所有編號(hào)如“FERM-332”指發(fā)酵研究所(FRI)的保藏號(hào)，該研究所為布達(dá)佩斯條約指定的國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)，它是從最初保藏于作為日本國(guó)內(nèi)保藏機(jī)構(gòu)的FRI的FERMp-8585內(nèi)部轉(zhuǎn)換而來，這里作用的編號(hào)，如“FERMP”，指作為國(guó)內(nèi)保藏機(jī)構(gòu)的FRI的編號(hào)〕。按上述方法所獲得的AD突變株可列舉大腸桿菌DRK-3323(FERMBP-2116;FERMp-9675)按照未審日本專利公開(KoKai)號(hào)62-155081所公開的方法，可通過將自產(chǎn)生物素大腸桿菌分離的生物素操縱子插入一載體DNA而制備重組質(zhì)粒，這種重組質(zhì)?？砂ɡ鏿KHN31質(zhì)粒。而且，還可使該重組質(zhì)粒的載體表型為四環(huán)素抗性，以獲得一種穩(wěn)定的重組質(zhì)粒，它在隨后的高密度培養(yǎng)時(shí)不被消失。
也可采用另一種方法獲得含有重組質(zhì)粒的AD突變株，即通過常規(guī)方法(如MandalM.等J.Mol.Biol.，53，109(1970)上所公開的氯化鈣法)將如上述所獲得的重組載體引入AD突變株，再在瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株，由于其中載體的表型，含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞的菌落能夠選擇性地生長(zhǎng);然后挑選該菌落。
含有產(chǎn)生的重組質(zhì)粒的AD突變株包括，例如大腸桿菌DRK-3323〔pXBA312〕(FERMBP-2117FERMp-9676)。
如果所需要的有用物質(zhì)為人降鈣素(以下簡(jiǎn)稱hCT)時(shí)，可制備含有相應(yīng)重組質(zhì)粒的AD突變株。例如，可從大腸桿菌M15〔pZT32〕(FERMBP-2115FERMP-9266)分離出質(zhì)粒pZT32，這種大腸桿菌含有攜帶編碼融合蛋白(含有膠原酶斷裂位點(diǎn)的hCT-肽-β-半乳糖苷酶)基因及tac-啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒，然后將其引入AD突變株，如大腸桿菌NA-75(FERMBP-2105)，從而獲得大腸桿菌NA-75〔pZT32〕。
如果需要其它的有用物質(zhì)，可從與所需物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)的基因及載體DNA制備重組DNA，然后將其引入AD突變株，以獲得所需的微生物。
高密度培養(yǎng)按照本發(fā)明，可很容易地將上面所制備的大腸桿菌培養(yǎng)至高密度，而不會(huì)遇到乙酸對(duì)生長(zhǎng)活性的抑制。
作為培養(yǎng)本發(fā)明的大腸桿菌的培養(yǎng)基，可使用含有碳源、氮源和/或無機(jī)物的合成培養(yǎng)基，也可使用天然培養(yǎng)基?？墒褂玫奶荚窗ㄌ妓衔锶缙咸烟?、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、淀粉的水溶液、糖蜜或其類似物?？杀焕玫牡窗ò薄⒏鞣N無機(jī)或有機(jī)銨鹽(如氯化銨、磷酸銨、硫酸銨或其類似物)、天然有機(jī)氮源(如氨基酸、肉膏、酵母膏、玉米浸出液、酪蛋白水解物、脫脂大豆或其水解物)或其類似物。許多天然氮源不僅含有氮源，而且還含有碳源?？墒褂玫臒o機(jī)物包括磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣、氯化鋅、硫酸銅、氯化錳、氯化鈷、鉬酸銨、硼酸或其類似物。
當(dāng)給制備的微生物提供一種抗菌素性質(zhì)時(shí)，通過向培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的抗菌素可防止污染。
上述營(yíng)養(yǎng)物可在培養(yǎng)之前以培養(yǎng)所需總量一次性加入。而某些營(yíng)養(yǎng)物引起大腸桿菌生長(zhǎng)活性或其它類似活性減少，當(dāng)使用這類物質(zhì)時(shí)最好在培養(yǎng)前先向培養(yǎng)基中加進(jìn)一部分，然后在培養(yǎng)的過程中加進(jìn)與生長(zhǎng)所消耗的量相對(duì)應(yīng)的剩余部分。
當(dāng)利用本發(fā)明的微生物產(chǎn)生物素時(shí)，通過向培養(yǎng)基中加入丙氨酸可提高產(chǎn)量。所用的丙氨酸可為D-化合物、L-化合物或DL-化合物，它們均具有相似的效果。從成本的角度考慮，DL-化合物更好。加到培養(yǎng)基中的丙氨酸量較好為1-10g/l，最好為3-7g/l。如果其濃度超過10g/l，丙氨酸會(huì)引起細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，尤其是生物素的產(chǎn)率下降。丙氨酸可在培養(yǎng)前一次性加入，或在培養(yǎng)過程中分批加入。
本發(fā)明的微生物表現(xiàn)出低乙酸形成能力，而不受通氣及攪拌條件的影響。因此，不必象先有技術(shù)那樣在培養(yǎng)基中維持高濃度的溶解氧，以抑制乙酸的積累，但無論如何，最好將溶解氧的濃度維持在3-6ppm，以使?fàn)I養(yǎng)物充分代謝。培養(yǎng)溫度最好為25-38℃，且培養(yǎng)過程中最好將pH值維持在基本中性。約16-48小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間通常是充分的。培養(yǎng)結(jié)束后，細(xì)胞濃度的干重為50g/l或更大。
生物素的生產(chǎn)通過將含有重組質(zhì)粒(通過將生物素操縱子插入載體DNA而制備)的本發(fā)明大腸桿菌培養(yǎng)至如上所述的高密度，就可產(chǎn)生大量的生物素。培養(yǎng)完成之后，根據(jù)生物素的性質(zhì)而采用與從天然材料中提取和純化物質(zhì)相類似的提取純化方法，可從液體培養(yǎng)基中提取和純化生物素。從培養(yǎng)基中除去細(xì)菌細(xì)胞后，生物素就可吸附于活性碳上，然后通過離子交換樹脂進(jìn)行洗脫和純化。也可直接用離子交換樹脂處理培養(yǎng)物的過濾物而純化生物素。從水或乙醇中重結(jié)晶后，就可獲得純化的生物素。
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1AD突變菌株的制備在L-培養(yǎng)基(10g/l胨，5g/l酵母膏，1g/l葡萄糖，5g/l氯化鈉，調(diào)至pH7.2)中，于37℃將大腸桿菌W3110菌株(IFO 12713)振蕩培養(yǎng)3小時(shí)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收集細(xì)菌細(xì)胞，洗滌后懸浮在含有100μg/mlN-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍的TM緩沖液(0.61%tris-堿，0.5%馬來酸，pH值調(diào)至6.0)中，讓其在37℃維持30分鐘以進(jìn)行誘變。收集和洗滌之后，將細(xì)胞放至L培養(yǎng)基中，于37℃進(jìn)行復(fù)原培養(yǎng)3小時(shí)。收集并洗滌細(xì)胞后，懸浮于滅菌水中，至約107個(gè)細(xì)胞/毫升。以每平皿0.1毫升的量將懸浮液涂布于含有5g/l氟乙酸鈉的脯氨酸基本瓊脂平板(1g/l脯氨酸，4g/l硫酸銨，2g/l磷酸二氫鉀，1g/l磷酸氫二鉀，0.1g/l七水硫酸鎂，5g/l氯化鈉，15g/l瓊脂)，于37℃培養(yǎng)48小時(shí)。用釣取菌落法分離形成的菌落，其為FR突變菌株。由于獲得抗性的機(jī)制不同，F(xiàn)R突變株中包括AD突變株。與親代菌株及具有不變的乙酸形成能力的菌株相比，AD突變株的乙酸形成能力降低。
為了比較分離的FR突變株及親代菌株W3110的乙酸形成能力，在一含有50ml用于試驗(yàn)乙酸形成能力的培養(yǎng)基(5g/l硫酸銨，13.2g/l NaH2PO4·12H2O，1.8g/l K2HPO4，1g/l MgSO4·7H2O，10g/l胨，10g/l酵母膏，10g/l葡萄糖)的500ml SaKaguchi搖瓶中，于37℃將細(xì)胞振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。振蕩速度為120次/分。培養(yǎng)完成之后，用分光光度計(jì)測(cè)定每一液體培養(yǎng)基在波長(zhǎng)660nm處的光密度(OD660)、然后根據(jù)在細(xì)胞干重及OD660之間制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將其換算成細(xì)胞濃度(g/l)。離心細(xì)胞，通過利用酶反應(yīng)的定量分析試劑盒(F試劑盒，Boeringer Manhecin Yamanouchi)測(cè)定每一培養(yǎng)物上清液中的乙酸量，獲得乙酸形成能力至多為親代菌株1/5的AD突變株NA-75(FERM BP-2105)。對(duì)親代菌株W3110及AD突變株NA-75的乙酸形成能力進(jìn)行比較的結(jié)果列于表1。
表1乙酸的菌株細(xì)胞濃度累積量乙酸的/細(xì)菌干重(g/l)(g/l)累積量親株大腸桿菌W31105.14.50.88(IFO12713)AD突變株大腸桿菌NA-754.50.40.09(FERMBP-2105)
實(shí)例2由消除了生物素反饋抑制的大腸桿菌制備AD突變株消除了生物素反饋抑制的大腸桿菌DRK-332(FERMBP-2113)在L-培養(yǎng)基(10g/l胨，5g/l酵母膏，1g/l葡萄糖，5g/l氯化鈉，調(diào)pH至7.2)中于37℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌細(xì)胞，洗滌，然后是懸浮于含有100μg/ml N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍的TM緩沖液(0.61%三羥甲基氨基甲烷堿，0.5%馬來酸;調(diào)pH至6.0)中，并置于37℃下誘變30分鐘。收集并洗滌細(xì)胞后，將細(xì)胞放入L-培養(yǎng)基，于37℃進(jìn)行3小時(shí)恢復(fù)培養(yǎng)。收集細(xì)胞，洗滌，然后懸浮于滅菌水中至大約107個(gè)細(xì)胞/ml。將該懸浮液涂布于含有5g/l氟代乙酸鈉的脯氨酸基本瓊脂平板(1g/l脯氨酸，4g/l硫酸銨，2g/l磷酸二氫鉀，1g/l磷酸氫二鉀，0.1g/l硫酸鎂·7H2O，5g/l氯化鈉，15g/l瓊脂)上，涂布量為0.1ml/培養(yǎng)皿，并于37℃培養(yǎng)48小時(shí)。釣取長(zhǎng)出的菌落，作為FR突變株。由于獲得抗性的機(jī)制不同，F(xiàn)R突變株包括形成乙酸能力比親株低的AD突變株和乙酸形成能力無變化的菌株。
為了比較分離的FR突變株和親株DRK-332的乙酸形成能力，在一個(gè)含有10ml或100ml檢測(cè)其乙酸形成能力的培養(yǎng)基(5g/l硫酸銨，13.2g/l磷酸二氫鈉·12H2O，1.8g/l磷酸氫二鉀，1g/l硫酸鎂·7H2O，10g/l胨，10g/l酵母膏，10g/l葡萄糖)的500ml坂口燒瓶中于37℃振蕩培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。振蕩速度為120沖程/分鐘。通氣條件隨所用兩種培養(yǎng)基量的不同(100ml或10ml)而變化。培養(yǎng)完成后，用分光光度計(jì)測(cè)量各培養(yǎng)液在660nm波長(zhǎng)處的光密度(OD660)，然后根據(jù)以細(xì)胞干重對(duì)OD660所制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成細(xì)胞濃度(g/l)。將細(xì)胞離心，用進(jìn)行酶反應(yīng)所用的定量分析試劑盒(F試劑盒;Boeringer Mannheim Yamanouchi)測(cè)定各培養(yǎng)液上清液中乙酸的量，所獲得的AD突變株DRK-3323(FERM BP-2116)的乙酸鹽形成能力比親株小1/5。親株DRK-332和AD突變株DRK-3323的乙酸形成能力的對(duì)比結(jié)果示于表2。從表2可明顯看出，AD突變株DRK-3323不受通氣條件的影響，甚至在通氣條件差(溶解氧不足)情況下，乙酸累積量/細(xì)菌干重也小于0.25。
表2親株AD突變株菌株大腸桿菌DRK-332大腸桿菌DRK-3323(FERMBP-2113)(FERMBP-2116)在低通氣條細(xì)胞濃度2.02.5(g/l)件下培養(yǎng)＊1 乙酸累積量 4.5 0.6(g/l)乙酸累2.250.24積量/細(xì)菌干重
(接上表)在高通氣條細(xì)胞濃度2.25.8(g/l)件下培養(yǎng)＊2 乙酸累積量 3.3 0.5(g/l)乙酸累1.500.09積量/細(xì)菌干重＊1500ml培養(yǎng)瓶中裝有100ml培養(yǎng)基。
＊2500ml培養(yǎng)瓶中裝有10ml培養(yǎng)基。
實(shí)例3含有攜帶生物素操縱子的重組質(zhì)粒的AD突變株的制備(1)載體DNA的制備含有質(zhì)粒pBR322的大腸桿菌K-12株(Peden，K.，Gene，22，277，1983)在LB培養(yǎng)基〔1%Bacto胰胨(Difco生產(chǎn))，0.5%Bacto酵母膏(Difco生產(chǎn))，1%氯化鈉;用氫氧化鈉調(diào)pH至7.2〕中于37℃振蕩培養(yǎng)一天，得到細(xì)胞，然后用堿溶法(Birnboim，H.C.etal，Nucl.AcidRes.，7，1513，1979)得到質(zhì)粒DNApBR322。
如圖1所示，用兩種限制性核酸內(nèi)切酶PvuⅡ和BalⅠ酶解所得質(zhì)粒DNApBR322(1ug)，通過1%低膠凝溫度瓊脂糖凝膠(Ⅶ型，Sigma生產(chǎn))電泳處理，然后用溴化乙錠染色。切下DNA片段(約3.7Kb)，于70℃加熱5分鐘。加入幾乎等量的用TE緩沖液(10mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液，pH8.0，1mMEDTA)飽和的苯酚，徹底混勻，離心，得到水相，向水相中，加入兩體積乙醇，沉淀的載體DNA片段用DNA連接試劑盒(TaKaraShuzo生產(chǎn))連接。
用所得重組DNA溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15(△〔lac-Pro〕，thi，φ80d，lacZM15，ara，rpsl，recA，)〔從Pharmacia獲得〕。用氯化鈣法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過在含有50ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基〔1%Bacto胰胨(Difco生產(chǎn))，0.5%Bacto酵母膏(Difco生產(chǎn))，1%氯化鈉，1.5%瓊脂;用氫氧化鈉調(diào)pH至7.2〕的平板上培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)化株大腸桿菌M15〔PBRR-B4〕。
在含有50ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌M15〔PBRR-B4〕，并用上述堿溶法獲取質(zhì)粒PBRR-B4。
用兩種限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和PstⅠ酶解所得質(zhì)粒pBRR-B4(1ug)，并用1%低膠凝溫度瓊脂糖電泳處理。這樣，如上所述分離得到-DNA片段(大約3.0Kb)。
另一方面，用兩種限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和PstⅠ酶解質(zhì)粒DNAPUC13(得自Pharmacia)(2ug)，經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠(NaKarai生產(chǎn))電泳處理，然后用溴化乙錠染色。切下一DNA片段(大約40b)并在Dounce均化器(WheatonScientific生產(chǎn))中用0.5M乙酸銨(含有1mMEDTA)和等量用TE緩沖液飽和的苯酚溶液使之均化，徹底混勻后，離心，得到水相。向水相中加入兩體積乙醇，離心后，分離出沉淀的DNA片段。
如上得到的兩種DNA片段用DNA連接試劑盒(TaKaraShuzo生產(chǎn))連接。
按照上述氯化鈣法，用所得連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15菌株，讓生長(zhǎng)于含有10ug/ml四環(huán)素的LB瓊脂平板上的菌落在含有10ug/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中充分生長(zhǎng)，按如上所述的堿溶法得到質(zhì)粒DNAPBM16。
(2)帶有生物素操縱子的重組質(zhì)粒的制備將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌DRK-332〔pKHN31〕(FERMBP-2114;FERMP-8586)，其中的重組質(zhì)粒是通過將在日本未審查專利
發(fā)明者土師信一郎, 伊福歐二, 岸本治郎 申請(qǐng)人:株式會(huì)社資生堂