專利名稱：1-去氧麥諾吉利霉素的制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為α-甘露糖苷酶的強(qiáng)力的抑制劑的1-去氧麥諾吉利霉菌素的制法。
更為詳盡地敘述，本發(fā)明涉及一種1-去氧麥諾吉利霉素制法，其特征在于，將屬于鏈霉菌屬的具有產(chǎn)生1-去氧麥諾吉利霉素能力的微生物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并從由此而得到的培養(yǎng)液中收集用一般式[Ⅰ]表示的1-去氧麥諾吉利霉素。
由于1-去氧麥諾吉利霉素對糖蛋白生物合成產(chǎn)生影響，抑制、糖鏈過程，因此，被期待作為免疫調(diào)節(jié)劑。此外，又由于將成為具有同樣作用的1-去氧麥諾吉利霉素的N取代衍生物或施旺索寧(swainsonine)，及其衍生物的合成原料，人們可期望它的有用性。
1-去氧麥諾吉利霉素為公知的化合物，關(guān)于其從豆類中分離的方法(J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1979，977)及用合成制得的方法(CarbohydrateResearch164(1987)141-148)等已經(jīng)為人們所了解。
由上述的方法來取得本發(fā)明的化合物，存在收率差及經(jīng)過步驟太多等許多經(jīng)濟(jì)上不利的方面。本發(fā)明的發(fā)明者們以解決這些問題為目的反復(fù)進(jìn)行了種種研究。
本發(fā)明的發(fā)明者們，對依據(jù)發(fā)酵法的1-去氧麥諾吉利霉素的制造法廣泛而持續(xù)地進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬的微生物能產(chǎn)生1-去氧麥諾吉利霉素這一事實，從而完成了本發(fā)明。
作為本發(fā)明涉及的微生物的代表，可以舉出本發(fā)明者們在札幌市內(nèi)土壤中分離的鏈霉菌灰紫色菌(lavendulae)SEN-158(以下稱為SEN-158株)菌株。
SEN-158株，在工業(yè)技術(shù)院微生物工業(yè)技術(shù)研究所中以微工研菌寄第4301號(FERMP-4301)被保藏，關(guān)于其菌學(xué)性質(zhì)，已為特開昭54-084094號公報所記載。此外，還委托美國典型培養(yǎng)物保藏中心以ATCC31434號保藏。
即使是SEN-158株以外的屬于鏈霉菌屬的其它菌株，只要產(chǎn)生1-去氧麥諾吉利霉素本發(fā)明也都可使用。此外，對這些菌株因用紫外線，或者Co60等進(jìn)行照射處理，或用氮芥、偶氮絲氨酸、亞硝酸、亞硝基胍，或用2-腺嘌呤等變異誘發(fā)劑作變異處理，或用形質(zhì)導(dǎo)入、形質(zhì)轉(zhuǎn)換或細(xì)胞融合等通常采用的變異處理手段而獲得的人工突變株、及自然發(fā)生的變異株，也適用于本發(fā)明。
本發(fā)明采用1-去氧麥諾吉利霉素產(chǎn)生菌，可通過通常的放線菌的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)而得以實施。
培養(yǎng)基既可為液體也可為固體，但通常，可采用依靠液體培養(yǎng)基的振蕩培養(yǎng)或進(jìn)行通氣攪拌培養(yǎng)。
培養(yǎng)基只要適合放線菌的生長，并可產(chǎn)生1-去氧麥諾吉利霉素，無論何種均可適用。
作為炭源，葡萄糖、半乳糖、甘露糖醇、蔗糖、麥芽糖、甘油、糊精、淀粉等可以采用。
作為氮源，大豆粉、蛋白胨、酵母抽提物、肉類抽提物、(コ-ソ·スティ-プ·リカ-)、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、尿素等可以采用。
此外，適量地加入氯化鈉、氯化鉀、炭酸鈣、各種磷酸鹽可以得到良好的結(jié)果。另外，也可以再加入適量的鐵、鎂等。
必要時可加入促進(jìn)使用菌生長或1-去氧麥諾吉利霉素產(chǎn)生的有機(jī)物、無機(jī)物、維生素類等。
除此之外，如發(fā)酵過程中發(fā)泡顯著，可以適量地加入消泡劑。
培養(yǎng)基的pH值、培養(yǎng)溫度等培養(yǎng)條件可在1-去氧麥諾吉利霉素產(chǎn)生的范圍內(nèi)作適當(dāng)?shù)刈儎?，但例如，在液體振蕩或通氣攪拌培養(yǎng)的情魷攏琾H為6-9、培養(yǎng)溫度在20-35℃左右為宜，以25-30℃為佳。
培養(yǎng)時間隨培養(yǎng)規(guī)模及其它條件而異，通常2-20天已足夠。
培養(yǎng)后將菌體分離，從所得培養(yǎng)液中提純目的物，并進(jìn)行精制。要將本發(fā)明物質(zhì)從培養(yǎng)液中提純并精制，可以使用通常將微生物代謝產(chǎn)物從其培養(yǎng)液中提純并精制時所采用的方法。
例如，可以單獨地采納用各種吸附劑(例如，硅膠、氧化鋁、活性炭、離子交換樹脂等)進(jìn)行的脫吸附層析法、分配層析法等，或者經(jīng)適宜地組合后使用。
在本發(fā)明的實施中，在放線菌培養(yǎng)液里有結(jié)構(gòu)式[Ⅱ]表示的莫拉諾靈(モラノリン)與本發(fā)明物質(zhì)共存的情況較多。
在此情況下，既可以用前述的差示方法將本發(fā)明物質(zhì)提出，在本發(fā)明物質(zhì)與莫拉諾靈(モラノリン)混合的狀態(tài)下，施加不與莫拉諾靈(モラノリン)反應(yīng)而僅與本發(fā)明物質(zhì)反應(yīng)的化學(xué)處理，使之轉(zhuǎn)化為衍生物，用溶劑萃取等方法而僅僅將本發(fā)明的物質(zhì)以衍生物的形式分離，隨后施加適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)處理，取得本發(fā)明物質(zhì)。
例如，在本發(fā)明物質(zhì)與莫拉諾靈(モラノリン)混合狀態(tài)下，將之轉(zhuǎn)化為N-叔-丁氧基羰基衍生物、或N-苯衍生物，隨后，再轉(zhuǎn)化為2，3-異丙叉衍生物，因為莫拉諾靈(モラノリン)不會成為異丙叉衍生物，而本發(fā)明物質(zhì)單獨成為異丙叉衍生物故可在它們的混合狀態(tài)用氯仿及水進(jìn)行分配，結(jié)果僅本發(fā)明物質(zhì)的N-叔丁氧基羰基-2，3-異丙叉衍生物被分配于氯仿中。隨后，將此保護(hù)基除去，而能單獨地得到本發(fā)明的目的物。
實施例以下舉出本發(fā)明的實施例，以對本發(fā)明作更為詳細(xì)的說明。
實施例1在500ml容量的邁耶(マィャ-)中，加入培養(yǎng)基(可溶性淀粉8%、大豆粉1%、酵母抽提物1%、氯化鉀10.05%、硫酸鎂0.05%、氯化鈉0.5%、硝酸鈉0.2%、pH7.2)100ml，進(jìn)行了滅菌。將SEN-158株(數(shù)白金耳)接種于其中，在27℃振蕩培養(yǎng)三天，得到種培養(yǎng)液。將此種培養(yǎng)液300ml(接種入30l容量的盛有15l發(fā)酵培養(yǎng)基(與種培養(yǎng)基同一組成的培養(yǎng)基)的發(fā)酵罐中，27℃下通氣攪拌培養(yǎng)11天。
消泡劑采用日產(chǎn)(ディスホ-ム)CB-442，通氣量為20升/分鐘，攪拌速度為300rpm。
將所得的培養(yǎng)液12.9升在9000rpm進(jìn)行20分鐘離心分離，使得到的上清液通過強(qiáng)酸性離子交換樹脂(ダウエックス)50W×2(H+)(11)柱，經(jīng)充分水洗后，用1N氨水進(jìn)行洗脫。
在減壓下濃縮洗脫液，使之通過強(qiáng)堿性離子交換樹脂(ダイァイオソ)SA-11A(OH-)(500ml)，并用水洗。合并流過液和洗液，減壓濃縮，再次使之通過(ダウエックス)50W×2(H+)(300ml)柱，水洗后，用0.5N氨水洗脫。
將含有目的物的組分減壓濃縮干固，并用甲醇溶解。對此以葡聚糖LH-20柱(200ml)，用甲醇進(jìn)行層析。將含目的物的組分減壓濃縮使之干固，殘留物用甲醇加溫溶解，靜置，收集生成的結(jié)晶。從甲醇再結(jié)晶，得到1-去氧麥諾吉利霉素結(jié)晶140mg。
熔點187-188℃。
元素分析值(C6H13NO4)計算值(%)C44.16H8.03N8.58實測值(%)C44.17H8.08N8.63比旋光度[α]24D＝-45.49°(C＝1.02水)1-去氧麥諾吉利霉素的鹽酸鹽13C-NMRppm;(D2O，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn);甲醇49.8ppm)48.458.961.266.566.773.21H-NMRppm;(D2O，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn);DSS)2.87(1H，m)，3.04(1H，dd，J＝1.0，15Hz)，3.25(1H，dd，J＝3.0，15Hz)，3.60-3.95(4H，m)，4.14(1H，m)實施例2使含莫拉諾靈和1-去氧麥諾吉利霉素的培養(yǎng)液11通過強(qiáng)酸性離子交換樹脂(ダウエックス)50W×2(H+)(100ml)柱，充分水洗后用0.5N氨水洗脫。減壓蒸餾除去溶劑后，用水溶解，使之通過強(qiáng)堿性離子交換樹脂(ダィァィォン)SA-11A(OH-)(100ml)，用水充分洗脫。減壓蒸餾除去溶劑后，溶解于2ml水中，加入三乙胺(3.2ml)(及預(yù)先溶于2ml二噁烷的2-叔丁氧基羰基-4，6-二甲基嘧啶23.2g，在60℃下使之徹夜反應(yīng)。
反應(yīng)液經(jīng)冷凍干燥除去二噁烷，將獲得的糖漿狀物供給硅膠層析柱(ワコ-ゲル)C-200，溶出液;a100∶1，b50∶1，c20∶1;甲叉氯∶甲醇)，從洗脫液中得到莫拉諾靈的N-Boc衍生物與1-去氧麥諾吉利霉素的N-Boc衍生物的混合物。
減壓蒸餾去除溶劑，溶于10ml甲醇，加入干燥丙酮200ml，再加入無水氯化亞鐵2g，室溫下使之反應(yīng)2天。
在其中加入10%碳酸鉀水溶液，將反應(yīng)液pH調(diào)整為7-8后，加入100ml水，用氯仿萃取。
收集氯仿層，減壓下蒸餾除去溶劑后，溶解于40ml甲醇中，加入1N鹽酸20ml，回流5小時。蒸餾去除甲醇后，使之通過(ダィァイオソ)SA-11A(OH-)(100ml)，并充分水洗。合并流過液與洗液，使之通過(ダウエックス)50W×2(H+)(100ml)柱，充分用水洗后，用0.5N氨水洗脫，減壓下蒸餾去除溶劑，用甲醇進(jìn)行重結(jié)晶，得到1-去氧麥諾吉利霉素0.5g。
權(quán)利要求
1.一種1-去氧麥諾吉利霉素(1-デオキシマンノジリマイシン)的制法，其特征在于，該制法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于鏈霉菌屬的有產(chǎn)生1-去氧麥諾吉利霉素能力的微生物；并從得到的培養(yǎng)液中取得1-去氧麥諾吉利霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種1-去氧麥諾吉利霉素制法，其特征在于，將屬于鏈霉菌屬的具有產(chǎn)生1-去氧麥諾吉利霉素能力的微生物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并從培養(yǎng)基中收集由此得到的用一般式(I)表示的1-去氧麥諾吉利霉素。
文檔編號C12P17/12GK1033395SQ8810823
公開日1989年6月14日 申請日期1988年11月28日 優(yōu)先權(quán)日1987年11月28日
發(fā)明者杉山信, 江連洋治, 小島信敏, 今野請隆, 瀨戶隆志, 中村輝也, 井東學(xué) 申請人:日本新藥株式會社