專利名稱：在甲基營養(yǎng)性酵母中表達(dá)乙型肝炎s和前s2蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)領(lǐng)域。一方面，本發(fā)明涉及提高主要由乙型肝炎S蛋白和前S2蛋白組成之抗原顆粒在甲基營養(yǎng)型酵母中表達(dá)水平的方法。另一方面，本發(fā)明涉及新的DNA分子及用其轉(zhuǎn)化的新的酵母菌株。
乙型肝炎病毒(HBV)可引起急性和慢性肝病，并導(dǎo)致世界范圍內(nèi)的公眾健康問題。HBV可引起導(dǎo)致虛弱的慢性感染過程，結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重的進(jìn)行性肝損傷、原發(fā)性肝癌及死亡。大多數(shù)情況下，病人能夠完全康復(fù)，但也有相當(dāng)一部分受HBV感染者成為本病的慢性攜帶者，有向其他人傳播本病的可能性。
近年DNA重組技術(shù)的進(jìn)展已為闡明HBV的基因結(jié)構(gòu)和制備抗HBV疾苗提供了許多有用的方法和手段?，F(xiàn)在已經(jīng)知道HBV基因組由約3.2千個(gè)堿基對(duì)的部分雙鍵DNA分子及一個(gè)與之共價(jià)連接的DNA聚合酶分子組成，包在一29nm核殼體中。核殼體則被封裝在由細(xì)胞脂質(zhì)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)組成的脂蛋白外殼中。這就是所說的病毒顆粒，其直徑為42nm。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，病毒外殼由三種不同的、但相關(guān)的表面蛋白組成這三種蛋白質(zhì)一般被稱為S、前S2和前S1蛋白質(zhì)。每個(gè)病毒顆粒均包含300～400個(gè)S蛋白分子和40～80個(gè)前S2及前S1蛋白分子。
S蛋白由226個(gè)氨基酸構(gòu)成，是正常病毒脂蛋白外殼的主要成分。S蛋白約為24-25千道爾頓(KDa)，可稱為P24或P25。S蛋白也可糖基化為27-28千道爾頓糖蛋白，并稱之為GP27或GP28。
第二種HBsAg蛋白質(zhì)是前S2表面抗原，也稱為中期HBsAg多肽。前S2包含281個(gè)氨基酸，是在S蛋白的N末端增加55個(gè)氨基酸而形成的。前S2蛋白約為31千道爾頓，故可稱為P31蛋白。前S2蛋白也有兩種糖基化形式，即分別稱為GP33和GP36的33KDa和36KDa糖蛋白。這種抗原蛋白被認(rèn)為在不對(duì)S起反應(yīng)或?qū)僅有微弱反應(yīng)的人體內(nèi)引起一種另外的抗原反應(yīng)。
第三種HBsAg蛋白質(zhì)是前S1表面抗原，也稱為晚期HBsAg多肽。前S1包含389-400個(gè)氨基酸(根據(jù)HBV的抗原亞型而異)。前S1是將其特有的108-119個(gè)氨基酸加到完整前S2蛋白的N末端上形成的。前S1蛋白約為43千道爾頓，故也稱為P43蛋白。前S1也有其一個(gè)46千道爾頓的糖基化形式，稱為GP46糖蛋白。
在HBV感染的過程中，完整的病毒核殼體被包裝在脂蛋白外殼中，形成42nm顆粒。HBV感染期間也形成中空的22nm顆粒，其主要由S和前S2蛋白及某些前S1蛋白構(gòu)成。雖然完整的病毒核殼體是有感染性的，但22nm中空顆粒是無感染性的。然而，中空顆粒引起的免疾反應(yīng)能產(chǎn)生足夠的免疫力，可用于制備抗HBV疫苗。
從前用于制備乙型肝炎疫苗的22nm顆粒是由HBV攜帶者的血漿中制得的。但得自人血漿中22nm顆粒必須經(jīng)過徹底純化，以除去感染性HBV顆粒及其他血漿來源的病原體。另外，由于人血漿的有限來源，也嚴(yán)重地限制了乙型肝炎疫苗的制備。
利用DNA重組技術(shù)，已有可能在轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系及釀酒酵母(SaccharomycesCerevisiae)中表達(dá)22nm顆粒內(nèi)的肝炎S蛋白。近年來使用的哺乳動(dòng)物體系費(fèi)用太高，而酵母體系則只產(chǎn)生相當(dāng)?shù)土康腟蛋白。
已經(jīng)證明欲制得具有抗原性的、可用作有效疫苗之前S2蛋白的工作是異常困難的。已發(fā)現(xiàn)前S2蛋白對(duì)重組體系內(nèi)的蛋白水解作用十分敏感。水解后產(chǎn)生兩個(gè)不再保留前S2之抗原性的較小蛋白片段。另外，很難在重組體系中表達(dá)前S2蛋白。在同一重組體系中，前S2的表達(dá)水平約為S蛋白之表達(dá)水平的十分之一。
建立一種可提高含HBV S蛋白和前S2蛋白之抗原性HBV顆粒產(chǎn)量的方法，將是對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)重要貢獻(xiàn)。這些顆粒將以潛在的更加有效的疫苗形式，由主要S蛋白與有更大潛在抗原性的前S2蛋白組成。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種提高抗原性HBV顆粒-其主要由HBV的S蛋白和前S2蛋白構(gòu)成-之產(chǎn)量的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含S蛋白和前S2蛋白之DNA編碼順序的新的載體。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用一或多個(gè)能夠提高HBV顆粒(該顆粒由S蛋白和非糖基化前S2蛋白組成)之產(chǎn)量的載體轉(zhuǎn)化的新的甲基營養(yǎng)性酵母。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用生產(chǎn)主要含S蛋白及前S2蛋白之抗原性HBV顆粒的方法所產(chǎn)生的產(chǎn)品。
由下文的詳細(xì)描述及所提供的權(quán)利要求，將會(huì)進(jìn)一步了解本發(fā)明的這些及其他目的。
依據(jù)本發(fā)明，我發(fā)現(xiàn)了一種提高抗原性HBV顆粒產(chǎn)量的方法，其包括用至少一個(gè)含S蛋白之結(jié)構(gòu)基團(tuán)的宿主相容性表達(dá)暗盒及至少一個(gè)含前S2蛋白之結(jié)構(gòu)基團(tuán)的載體相容性表達(dá)暗盒轉(zhuǎn)化甲基營養(yǎng)性酵母，并在適于顆粒產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化體。


圖1圖解顯示質(zhì)粒pA0801的構(gòu)成，該質(zhì)粒是pBR322衍生的、位置1上沒有EcoRⅠ位點(diǎn)的質(zhì)粒，在原pBR322pvuⅡ位點(diǎn)被一BglⅡ位點(diǎn)取代，該質(zhì)粒含有一來自pBSAGI5I(NRRL18021)之3′AOX1終止順序的700bpBglⅡ/xhoⅠ片段。
圖2圖解顯示了質(zhì)粒pA0802的構(gòu)成，該質(zhì)粒為含有來自質(zhì)粒pBSAGI5I(NRRL18021)之啟動(dòng)子-基因-終止子表達(dá)暗盒的質(zhì)粒pA0801的衍生物，所說的暗盒是在質(zhì)粒pA081的ClaⅠ位點(diǎn)插入的。
圖3圖解顯示了質(zhì)粒pA0803的構(gòu)成，該質(zhì)粒為-pA0802衍生的質(zhì)粒，其原有的一個(gè)HBsAg編碼順序經(jīng)StuⅠ-EcoRⅠ消化而除去，并在同一位點(diǎn)保留一個(gè)EcoRⅠ位點(diǎn)。
圖4圖解顯示了質(zhì)粒pA0811的構(gòu)成，該質(zhì)粒衍生于質(zhì)粒pA0803，是經(jīng)用BamHⅠ消化pA0803并插入一個(gè)酵母屬ARG4基因的2.0Kb片段而得到的。
圖5A顯示了質(zhì)粒pA0801和pA0802的構(gòu)建流程。
圖5B顯示了質(zhì)粒pA0803和pA0811的構(gòu)建流程。
圖6顯示了含有HBV血清型adw之前S2基因的HBV。質(zhì)粒AM6是圖6中所示HBV基因組的衍生物，其中pBR322質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ消化后于26位的BamHⅠ位點(diǎn)插入。
圖7圖解顯示了質(zhì)粒pVM4的構(gòu)成，該質(zhì)粒是由pBR322衍生的，其含有在BamHⅠ位點(diǎn)插入的巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)HIS4基因。括號(hào)指出被破壞的位點(diǎn)。HIS4基因是在pYJ30內(nèi)寄存的(NRRLB-15890)。
圖8圖解顯示了質(zhì)粒pYM10的構(gòu)成。PYM10是PYJ30(NRRLB-15890)的衍生物，原在2959位上的BamHⅠ位點(diǎn)已被破壞。圖中括號(hào)指示被破壞的限制性酶切點(diǎn)。
圖9圖解顯示了質(zhì)粒pA0804的構(gòu)成，該質(zhì)粒由BglⅡ至BglⅡ(順鐘向)片段中含有一線性整合的位點(diǎn)特異性載體?？稍谠撡|(zhì)粒的唯一EcoRⅠ位點(diǎn)中插入結(jié)構(gòu)基因。
前S2結(jié)構(gòu)基因是本領(lǐng)域中已知的，并已由LO測(cè)定了它的順序(Characteristics of Pre S2Region of Hepatitis B Virus，Biochemical and Biophysical Research Communications 135382，1986)。本領(lǐng)域內(nèi)的許多研究人員已克隆了該結(jié)構(gòu)基因并已表達(dá)了這一基因，如參見Lo和Valenzuela，Synthesis and Assembly in yeast of Hepatitis B Surface Antigen Particles Containing the Polyalbumin Receptor，Biotechnology 3317(1985)(僅列出二個(gè)名字?？捎杀绢I(lǐng)域研究人員處得到該基因亦可經(jīng)合成或重新分離到該結(jié)構(gòu)基因。也已發(fā)現(xiàn)，任何前S2血清型均可用于本發(fā)明的實(shí)施。
S結(jié)構(gòu)基因也是本領(lǐng)域中已知的，并也已由Lo測(cè)定了它的順序(文獻(xiàn)同上)?？捎墒袌?chǎng)上實(shí)到該結(jié)構(gòu)基因，并可經(jīng)合成或重新分離到該結(jié)構(gòu)基因。也已發(fā)現(xiàn)任何S血清型均可用于本發(fā)明的實(shí)施。
用于本發(fā)明之一個(gè)實(shí)施方案的前S2結(jié)構(gòu)基因血清型adw得自于質(zhì)粒AM6。質(zhì)粒AM6是圖6所示HBV基因組的衍生物，其中在26位的BamHⅠ位點(diǎn)上插入了pBR322質(zhì)粒。表1中列出了該前S2結(jié)構(gòu)基因的核苷酸順序?？稍谌魏芜m當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主(如MC1061)中培養(yǎng)本發(fā)明所用的質(zhì)粒。
由質(zhì)粒AM6回收前S2結(jié)構(gòu)基因的兩個(gè)片段并在體外合成N末端開始的13個(gè)氨基酸的核苷酸順序。用于本發(fā)明的核苷酸順序是依照化學(xué)法或酶促方法合成的，如使用基于磷酸三酯、亞磷酸酯或氰乙基氨基磷酸酯化學(xué)的化學(xué)方法。
含75%前S2結(jié)構(gòu)基因的C末端編碼區(qū)是經(jīng)用DraⅠ消化質(zhì)粒AM6得到的?？墒褂蒙唐稤raⅠ核酸內(nèi)切酶完成DraⅠ消化(所有核酸內(nèi)切酶均按制造廠商推薦的方法使用)。然后用苯酚提取DraⅠ片段并用乙醇沉淀之。
按標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成技術(shù)制備八聚體StuⅠ接頭(AAGGCCTT)，并使用T4連接酶以平頭連接法連接到DraⅠ片段上。用苯酚提取終止連接反應(yīng)，然后用乙醇沉淀之。然后用StuⅠ核酸內(nèi)切酶消化所得片段以除去StuⅠ的多聚體(multimers)。
然后用XbaⅠ消化連有StuⅠ的片段，以凝膠電泳法分離所得約600bp含前S2結(jié)構(gòu)基因之C末端編碼區(qū)的StuⅠ/XbaⅠ片段。
然后用T4連接酶將該600bp片段連接到已用瓊脂糖凝膠電泳法分離的質(zhì)粒pYM4的5.7KbXbaI/StuI消化產(chǎn)物中(圖2)。
然后直接用該連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(MC1061)細(xì)胞，并將其培養(yǎng)在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中。

選擇轉(zhuǎn)化成功的菌落并按Birnboim和Doly(NucleicAcidsResearch71513，1979)所述方法提取質(zhì)粒DNA。
用StuⅠ消化提取的質(zhì)粒DNA，用苯酚抽提并用乙醇沉淀。制備EcoRⅠ接頭并連接到StuⅠ片段上。經(jīng)EcoRⅠ消化以除去過多的接頭。進(jìn)一步用XbaⅠ消化這些接有EcoRⅠ接頭的片段，并用電泳法分離含有前S2結(jié)構(gòu)基因之C末端部分的片段。
將XbaⅠ-EcoRⅠ酶切產(chǎn)物連接到XbaⅠ-EcoRⅠ切斷的PUC18中。將連接混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(MC1061)中，然后使之在氨芐青霉素存在下生長。使用ClaⅠ和XbaⅠ進(jìn)行片段消化分析篩選含前S2結(jié)構(gòu)基因之C末端部分的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。將依該方法選擇出的質(zhì)粒定名為PHS2-B。
先用XbaⅠ和BamHⅠ消化質(zhì)粒AM6以回收前S2基因的中間部分。經(jīng)凝膠電泳分離所需的250bp片段。然后將250bp XbaⅠ/BamHⅠ片段連接到已用XbaⅠ和BamHⅠ消化的PUC18中，并用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061。經(jīng)回收質(zhì)粒DNA并用BamHⅠ消化之，以分析于氨芐青霉素存在下生長的培養(yǎng)物。電泳結(jié)果顯示含有2.7Kb線性片段的那些質(zhì)粒即被視為含有所要的250bp片段。分離一個(gè)含有250bp片段的轉(zhuǎn)化菌落并進(jìn)行大量培養(yǎng)。由菌落中分離純化質(zhì)粒DNA并用EcoRⅠ和BamHⅠ消化之。經(jīng)電泳分離載體帶。然后使該載體與下列經(jīng)酶處理的雙鏈寡核苷酸連接
PstIBamHI5′AATTCAATCCGTCTGCAG3′3′GTTAGGCAGACGTCCTAG5′用一連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061并根據(jù)氨芐青霉素抗性選擇有正確插入物的菌落。該質(zhì)粒被定名為pPS2。
合成具有下列順序的寡核苷酸來制得前S2的N末端編碼區(qū)HindIIIPstI5′AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA3′ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG5′將該順序克隆到經(jīng)HindⅢ和PstⅠ消化的pUC18中。根據(jù)EcoRⅠ消化并電泳后是否存在一約75bp片段來確定所要的轉(zhuǎn)化體。將按這一方法選擇的質(zhì)粒定名為pTBO-2A。
用PstⅠ和XbaⅠ消化載體pTBO-2A，以加入基因的中間部分該插入片段是pPS2的250bp.PstⅠ-XbaⅠ片段。根據(jù)是否存在一大于300bp的EcoRⅠ片段及290bp XbaⅠ/HindⅢ片段來確定轉(zhuǎn)化體。將該正確的分離物稱為pTBO-3。將得自pTBO-3的HindⅢ/XbaⅠ片段插入XbaⅠ/HindⅢ消化的pHS2B中即構(gòu)成完整的前S2基團(tuán)。根據(jù)存在-825bp EcoRⅠ片段來確定氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。該構(gòu)建物被稱為pTBO4。
可用任何適當(dāng)方法培養(yǎng)上面列出的大腸桿菌菌株。培養(yǎng)大腸桿菌的一般技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，而具體適用于本發(fā)明所用菌株的培養(yǎng)條件也是本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員知道的。
多種依據(jù)其致密尺寸和封閉環(huán)形螺旋結(jié)構(gòu)的技術(shù)均可用于從大腸桿菌中回收質(zhì)粒DNA。例如可在收獲之后離心得到宿主細(xì)胞沉淀物，然后重新懸并溶菌。離心溶菌產(chǎn)物以除去細(xì)胞碎片并保留含DNA的上清液。然后用苯酚提取，以除去大部分其他污染物。進(jìn)一步使用密度梯度離心或凝膠過濾技術(shù)處理經(jīng)苯酚提取的DNA，以由細(xì)菌DNA中分離出質(zhì)粒DNA。完成上述處理所用的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的，而且而且有關(guān)技術(shù)中所使用的許多方法也是已知的。
可通過選擇適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶來完成對(duì)質(zhì)粒的核酸酶消化，其中使用的核酸內(nèi)切酶應(yīng)以利于回收前S2結(jié)構(gòu)基因的方式切斷所篩選的質(zhì)粒。使用何種核酸內(nèi)切酶將根據(jù)將由其中切掉前S2基因的質(zhì)粒而定。例如，可按實(shí)施例Ⅰ中所述的方法回收保留于質(zhì)粒AM6中的前S2結(jié)構(gòu)基因。
可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種技術(shù)，如P.G.Seely和E.M.Southern(GelElectrophoresisofNucleicAcids-APracticalApproach(D.RickwoodandB.D.Hames，eds.)p39，1982)所述的方法完成DNA的凝膠電泳。也可使用適于不同凝膠的多種技術(shù)進(jìn)行洗脫如電泳洗脫、擴(kuò)散、凝膠溶解(瓊脂糖凝膠)或物理擠提(瓊脂糖凝膠)。另外應(yīng)明確的是，對(duì)于某些凝膠，如高質(zhì)量、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠則不一定要洗脫。
一旦分離到含前S2結(jié)構(gòu)基因或其部分的片段，在將其插入載體之前可能要求先進(jìn)行其他處理。這些處理可能包括(但不僅限于)在片段上加上接頭或?qū)⑵涡蕹善蕉恕?br> 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)M13誘變作用由前S2基因構(gòu)建了S基因。經(jīng)M13誘變作用刪除前面的165個(gè)堿基對(duì)(編碼前S2結(jié)構(gòu)基因開始的55個(gè)氨基酸)，結(jié)果在插入的EcoRⅠ位點(diǎn)后緊跟著S結(jié)構(gòu)基因之ATG起始密碼的5′端。進(jìn)行M13誘變的技術(shù)是本領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的，Zoller和Smith(Methods in Enzymology 100468，1983)所述的技術(shù)便是其中之一。用于誘變的M13載體和試劑可由市場(chǎng)上買到，如購自New England Biolabs公司。
上述誘變過程包括首先將前S2結(jié)構(gòu)基因插入雙鏈環(huán)形復(fù)制形或RF形的M13載體中(為使用方便起見，可選用M13mp18，但亦可使用其他M13載體)。在大腸桿菌MC1061中增殖質(zhì)粒pTB04中的前S2結(jié)構(gòu)基因，并用Birmbolm Doly(上述文獻(xiàn))的方法分離質(zhì)粒DNA。然后用EcoRⅠ消化pTB04質(zhì)粒。經(jīng)凝膠電泳分離含前S2結(jié)構(gòu)基因的約825bp ECORⅠ片段。然后將該片段插入M13mp18的EcoRⅠ位點(diǎn)。再用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞(如JM101或JM103)?；陲@色反應(yīng)選擇轉(zhuǎn)化體，該顯色反應(yīng)表明所要的片段如隔斷了β半乳糖苷酶基因則將在指示平板上形成透明斑而非蘭色菌斑。
可經(jīng)測(cè)定順序、核酸內(nèi)切酶消化及凝膠電泳或用其他適當(dāng)技術(shù)確定插入的方向。分離一個(gè)其中在M13通用引物附近插入了起始蛋氨酸的克隆并用于第一次誘變。
接下來在體外合成含下列核苷酸順序的短寡核苷酸CGGGT-ACCGA-GCTCG-AATTC-ATGGA-GAACA-TCACA-TCAGG
可用酶促方法或化學(xué)方法制得用于本發(fā)明的合成順序。這些適用方法包括(但不只限于)基于磷酸三酯、亞磷酸酯或氰乙基氨基磷酸酯化學(xué)的化學(xué)方法。
制備已插入了結(jié)構(gòu)基因的單鏈形式的M13。然后將部分互補(bǔ)于前S2基因之5′端E和S編碼區(qū)之5′端的合成寡核苷酸與含前SS2結(jié)構(gòu)基因的單鏈M13載體一起退火。使用部分互補(bǔ)的合成寡核苷酸作引物，以Klenow片段和三磷酸脫氧寡核苷酸于4℃體外進(jìn)行DNA合成。然后部分互補(bǔ)的合成寡核苷酸就會(huì)沿著環(huán)形M13模板延伸。用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM101或JM103細(xì)胞。將菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上并與放射活性標(biāo)記的寡核苷酸雜交，因而突變鏈會(huì)發(fā)生雜交而原來的模板則沒有雜交，從而對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選。然后用這些突變體制備模板，并用于轉(zhuǎn)化JM103。再次依上述方法篩選這些轉(zhuǎn)化體。然后測(cè)定經(jīng)第二次篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化體DNA的順序并鑒定有正確順序的空斑。用EcoRⅠ消化這些菌落的雙鏈復(fù)制形DNA并分離含S結(jié)構(gòu)基因的678堿基對(duì)片段。表2中顯示了這一順序。
分離S和前S2結(jié)構(gòu)基因后，即可將基因插入到適當(dāng)?shù)募谆鶢I養(yǎng)性酵母載體和質(zhì)粒或線性位點(diǎn)特異性整合載體中。本發(fā)明中優(yōu)選的載體是可與畢赤屬酵母特別是巴斯德畢赤酵母相容的載體。
長期以來，質(zhì)粒一直是DNA重組技術(shù)中使用的基本構(gòu)件之一。質(zhì)粒是見于微生物體內(nèi)的染色體外環(huán)形雙鏈DNA。已發(fā)現(xiàn)質(zhì)?？稍诩?xì)胞內(nèi)產(chǎn)生單個(gè)或多個(gè)拷貝。質(zhì)粒DNA中含有質(zhì)粒擴(kuò)增所需的信息即包括細(xì)菌復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)。質(zhì)粒中編碼的信息也可能包括用于篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞中質(zhì)粒的一個(gè)或多個(gè)表型標(biāo)志。依靠表型或篩選標(biāo)志，如抗生素抗性基因或彌補(bǔ)宿主生化途徑中缺陷的基因，得以識(shí)別、篩選和保留已被轉(zhuǎn)化之宿主細(xì)胞的克隆。
為了在甲基營養(yǎng)性酵母中表達(dá)前S2和S結(jié)構(gòu)基因，須將各基因可操作地連接到5′調(diào)節(jié)區(qū)和3′終止順序上，以形成將通過載體進(jìn)入宿主內(nèi)的表達(dá)暗盒。
為清楚闡述起見，將本文所用術(shù)語限定如下可操作地連接，是指一種排列方式，該方式使得各組分組合在一起以完成其功能。
調(diào)節(jié)區(qū)即可對(duì)各種刺激起反應(yīng)并影響mRNA轉(zhuǎn)錄速率的DNA順序。
3′終止順序可發(fā)揮穩(wěn)定mRNA之功能的3′端與終止密碼相連的順序，如產(chǎn)生多聚腺苷酸的順序。
“宿主可相容的”是指能在宿主中完成其正常功能的DNA順序，如得自宿主的調(diào)節(jié)區(qū)及3′終止順序。
本發(fā)明實(shí)踐中優(yōu)選的是整合載體，如歐洲專利申請(qǐng)86114700.7號(hào)中所述的Cregg的線性位點(diǎn)特異性整合載體。這類載體包括有上述排列的，至少含1)第一個(gè)可插入之DNA片段2)用于篩選之標(biāo)志基因及3)第二個(gè)可插入之DNA片段的順序。
可插入DNA片段的長度至少為大約200個(gè)核苷酸，并且具有與宿主基因組DNA某些部分同源的核苷酸順序。線性位點(diǎn)特異性整合載體的各成分依次排列形成一線性DNA片段，使得表達(dá)暗盒和用于篩選的標(biāo)志基因位于第一個(gè)可插入DNA片段的3′末端與第二個(gè)可插入DNA片段的5′末端之間。第一和第二個(gè)可插入DNA片段彼此間的排列次序和定向與其在親本基因組中一樣。
用作第一和第二個(gè)可插入DNA片段的核苷酸順序與天然基因組位點(diǎn)(該位點(diǎn)上發(fā)生基因組修飾)的分離部分是同源的。因此，如果基因組修飾發(fā)生在醇氧化酶基團(tuán)的座位，則所用的第一和第二個(gè)可插入DNA片段將是與醇氧化酶基因座位的分離部分同源的順序。線性片段中的兩個(gè)可插入之DNA片段彼此間必須采取如其在親代基因組中一樣的相對(duì)定向?？捎米鞯谝缓偷诙€(gè)可插入之DNA片段的核酸順序包括選自醇氧化酶(AO×1)基因、二羥丙酮合成酶(DHAS1)基因、p40基因和HISA基因的核苷酸順序。1985年10月29日提交的歐洲專利申請(qǐng)85113737.2號(hào)中公開了AO×1基因、DHAS1基因、p40基因和HIS4基因(該專利申請(qǐng)列為本文參考文獻(xiàn))。
第一個(gè)可插入之DNA片段含有可操作的調(diào)節(jié)區(qū)，如包括用于表達(dá)暗盒中的調(diào)節(jié)區(qū)。使用第一個(gè)可插入之DNA片段作為表達(dá)暗盒的調(diào)節(jié)區(qū)是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。圖4中圖解顯示了一利用第一個(gè)可插入之DNA片段作為暗盒調(diào)節(jié)區(qū)的載體。
另外，如圖9中所示，插入位點(diǎn)和3′終止順序可直接連在第一個(gè)可插入之DNA片段的3′側(cè)。線性位點(diǎn)特異性整合載體的這種構(gòu)型的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是為插入結(jié)構(gòu)基因提供了一個(gè)方便的位點(diǎn)，而不必增加一相容的終止順序。
用于轉(zhuǎn)化宿主菌株的DNA中還須至少包含一個(gè)用于篩選的標(biāo)志基因。這將有利于篩選和分離那些已獲得轉(zhuǎn)化DNA的生物體。標(biāo)志基因可為被轉(zhuǎn)化的生物體提供宿主所沒有的表型特征，如使之恢復(fù)產(chǎn)生特定氨基酸的能力(未被轉(zhuǎn)化的宿主菌株的該特定氨基酸生物合成途徑是有缺陷的)，或?qū)δ晨股鼐哂锌剐缘取?br> 用于篩選的標(biāo)志基因可選自巴斯德畢赤酵母和釀酒酵母，HIS4基因和ARG4基因、釀酒酵母的轉(zhuǎn)換酶基因(SUC2)，或大腸桿菌可轉(zhuǎn)輸成分Tn601或Tn903的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解到，亦可在用于本發(fā)明實(shí)踐的載體中插入其他DNA順序，如細(xì)菌質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA等。這類順序可使這些載體在細(xì)菌宿主中擴(kuò)增并保留。
如果第一個(gè)可插入之DNA片段不含調(diào)節(jié)區(qū)，則須將一適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)區(qū)以可操作的連接方式插入到結(jié)構(gòu)基因上，以提供一可操作的表達(dá)暗盒。同樣，如果在插入位點(diǎn)沒有提供3′終止順序以形成完整的表達(dá)暗盒，則必須將-3′終止順序可操作地連接到將被插入之結(jié)構(gòu)基因上。
本領(lǐng)域內(nèi)的熟練技術(shù)人員都知道，已鑒定了許多調(diào)節(jié)區(qū)域，這些區(qū)域可與甲基營養(yǎng)性酵母聯(lián)合使用。這類調(diào)節(jié)區(qū)包括(但不只限于)選自由釀酒酵母中分離的酸性磷酸酶、半乳糖激酶、醇脫氫酶、細(xì)胞色素C、α接合因子和3磷酸甘油醛脫氫酶等的調(diào)節(jié)區(qū)由巴斯德酵母中分離的伯醇氧化酶(AOX1)、二羥丙酮合成酶(DHAS1)、p40調(diào)節(jié)區(qū)和HIS4調(diào)節(jié)區(qū)等的酵母調(diào)節(jié)區(qū)。本發(fā)明實(shí)踐中優(yōu)選的調(diào)節(jié)區(qū)是根據(jù)其對(duì)含甲醇培養(yǎng)基起反應(yīng)的能力而鑒定的，如選自歐洲專利申請(qǐng)85113737.2號(hào)公開之AOX1、DHAS1、p40的調(diào)節(jié)區(qū)。
本發(fā)明中特別優(yōu)選的調(diào)節(jié)區(qū)是AOX1調(diào)節(jié)區(qū)。
3′終止順序可用于表達(dá)暗盒中或作為上述載體的一個(gè)部分。3′終止順序?yàn)榭刹僮鞯剡B接到一基因上時(shí)，可發(fā)揮其終止、聚腺苷酸化和/或穩(wěn)定由結(jié)構(gòu)基因編碼的信使RNA。作為本發(fā)明所用之3′終止順序來源的少數(shù)幾個(gè)例子，包括但不只限于釀酒酵母、多形漢森氏酵母(HansenulaPolymorpha)及畢赤屬酵母3′終止順序，其中優(yōu)選的是得自巴斯德畢赤酵母如選自AOX1基因、DHAS1基因、p40基因及HIS4基因之3′終止順序的3′終止順序。而特別優(yōu)選的是AOX1基因的3′終止順序。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，也可將其他的DNA順序如細(xì)菌質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA等插入到本發(fā)明的載體中。這類順序可使這些載體得以在細(xì)菌宿主中擴(kuò)增并保留。
另一個(gè)適用的載體是至少含下列片段之有序排列順序的整合載體，所說的片段為1)一個(gè)可插入的DNA片段，2)一個(gè)用于篩選的標(biāo)志基因，3)一個(gè)表達(dá)暗盒和4)隨意選用的另一個(gè)可插入的DNA片段。整合載體成分相當(dāng)于用于線性整合的位點(diǎn)特異性載體的成分，不同的是其只應(yīng)是一個(gè)可插入的DNA片段，但據(jù)信整合載體通過同源重組整合了整個(gè)載體。其中優(yōu)選的是圖4所示的環(huán)形整合載體。本發(fā)明實(shí)踐中最好使用線性轉(zhuǎn)化載體如圖9所示構(gòu)建物的BglⅡ片段及圖4所示整合載體的環(huán)狀形式。
可用任何適用技術(shù)將S或前S2結(jié)構(gòu)基因插入適當(dāng)載體中，其包括在適當(dāng)位點(diǎn)切斷所選用的載體，并使載體中至少存在一個(gè)含S和前S2結(jié)構(gòu)基因的可操作的表達(dá)暗盒。
可用任何適當(dāng)?shù)倪B接技術(shù)，如使用T4 DNA連接酶連接S或前S2結(jié)構(gòu)基因。
混合物最好轉(zhuǎn)化到細(xì)菌宿主如大腸桿菌中來完成對(duì)S和前S2結(jié)構(gòu)基因與載體之連接混合物的首次篩選、增殖和最適擴(kuò)增。適用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的技術(shù)是已知的。另外，在細(xì)菌宿主中保存載體所必需的選擇標(biāo)志及細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)的技術(shù)也是已知的。
用適于從宿主DNA中分離質(zhì)粒DNA的方法，分離和/或純化表達(dá)體系中含S或前S2結(jié)構(gòu)基因的所需質(zhì)粒。
同樣，最好于增殖后檢驗(yàn)經(jīng)連接形成的載體，以證實(shí)其中是否存在S或前S2基因及其是否可操作地連接到調(diào)節(jié)區(qū)和3′終止順序上所用方法包括但不只限于核酸內(nèi)切酶消化法、凝膠電泳法或核酸內(nèi)切酶消化-Southern雜交法。
為完成本發(fā)明，必須將至少兩個(gè)不同的相容表達(dá)暗盒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中。有幾種方法能將這兩個(gè)不同的表達(dá)暗盒插入宿主中，如可將兩個(gè)具有功能的表達(dá)暗盒置于載體(如病毒、質(zhì)?；蚓€性位點(diǎn)特異性整合載體)并用這些載體轉(zhuǎn)化宿主。用至少兩個(gè)不同的表達(dá)暗盒(S和前S2)轉(zhuǎn)化同一宿主的另一方法可以是用兩個(gè)不同的載體來轉(zhuǎn)化宿主，其中一個(gè)含有S表達(dá)暗盒，另一個(gè)則含有前S2表達(dá)暗盒。雙轉(zhuǎn)化可用兩個(gè)不同的載體同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化(即一個(gè)轉(zhuǎn)化過程中使用兩種載體)或相繼進(jìn)行轉(zhuǎn)化(先將一個(gè)載體轉(zhuǎn)化到宿主中，然后用另一個(gè)載體第二次轉(zhuǎn)化該宿主細(xì)胞)。雙重連續(xù)轉(zhuǎn)化是目前優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法。
可用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化技術(shù)將質(zhì)?；蚓€性載體轉(zhuǎn)化到酵母宿主中，如包括(但不只限于)由Hinnen等人(Proc.Acad.Sci.751929，1978)、Ito等人(J.Bacteriol.153163，1983)、Cregg等人(Mol.CellBiol.53376，1985)或Sreekrishna等人(Gene59115，1987)所描述的技術(shù)。本發(fā)明的實(shí)踐中最好使用Cregg的轉(zhuǎn)化技術(shù)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中使用了過量的線性載體并用Southern雜交法選擇多重插入。
用于轉(zhuǎn)化的酵母宿主可以是任何適用的甲基營養(yǎng)性酵母。甲基營養(yǎng)性酵母包括(但不只限于)選自漢遜氏酵母屬、假絲酵母屬(Candida)、克勒克氏酵母屬(Kloeckera)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharowyces)、擬球酵母屬(Torulopsis)和紅酵母屬(Rhodotorula)的、能在甲醇基質(zhì)上生長的酵母。C.Anthony，The Biochemistry of Methylotrophs，269頁(1982)中列出了這類酵母的一些實(shí)例。其中優(yōu)選的是畢赤屬甲基營養(yǎng)酵母，如營養(yǎng)缺陷型巴斯德畢赤酵母GS115(NRRL Y-15851)或PPF1(NRRL Y-18017)。因?yàn)闋I養(yǎng)缺陷型甲基營養(yǎng)酵母容易篩選，故特別適用于本發(fā)明。如果選擇到適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化標(biāo)志基因，如使用SUC2將巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化為能在蔗糖上生長的菌株或使用抗生素抗性標(biāo)志(如G418R基因)時(shí)，也可用野生型甲基營養(yǎng)酵母菌株獲得成功的結(jié)果。
本發(fā)明的實(shí)踐中最好聯(lián)合使用兩個(gè)選擇標(biāo)志，以篩選其中S和S2基因均已穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到宿主內(nèi)的轉(zhuǎn)化體。因此本發(fā)明中應(yīng)將宿主與載體結(jié)合起來，以確保當(dāng)在不同載體中使用兩個(gè)不同的選擇標(biāo)志時(shí)，每個(gè)標(biāo)志都能被單獨(dú)篩選。結(jié)合使用宿主和載體的例子之一是使用具有載體pA0804(HIS4標(biāo)志)和pA0811(ARG4標(biāo)志)的PPF1(HIS4，ARG4)。另一個(gè)可能的結(jié)合方式是使用僅在一個(gè)途徑中有營養(yǎng)缺陷者與彌補(bǔ)該缺陷的基因及抗生素抗性基因或能產(chǎn)生出新表型的基因(如SUC2)結(jié)合。
可使用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)篩選轉(zhuǎn)化了的甲基營養(yǎng)性酵母細(xì)胞，這些技術(shù)包括(但不只限于)于轉(zhuǎn)化后在沒有由于細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷而必須的生化產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)原來的營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞、通過檢測(cè)新的表型(“methanolslow”)進(jìn)行篩選，或在存在某種抗生素(該抗生素對(duì)某轉(zhuǎn)化體中沒有抗性基因的酵母是有毒性的)條件下培養(yǎng)。
可用適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)篩出的轉(zhuǎn)化了的甲基營養(yǎng)性酵母細(xì)胞，這些技術(shù)包括搖瓶發(fā)酵、高密度發(fā)酵或Cregg等人(High-LevelExpressionandEfficientAssemblyofHepatitisBSurfaceAntigenintheMethylotrophicYeast，PichiaPastoris，Bio/Technology5479，1987)所述的技術(shù)。
可用適于調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)揮功能的方法完成表達(dá)。如果是利用甲醇反應(yīng)性調(diào)節(jié)區(qū)，可使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含有與所用調(diào)節(jié)區(qū)相應(yīng)的醇類的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以誘導(dǎo)表達(dá)。
可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，先將誘導(dǎo)了足夠長時(shí)間的轉(zhuǎn)化細(xì)胞溶菌再以粗品形式回收抗原顆粒，如先以球磨法破碎細(xì)胞、然后離心一定時(shí)間以除去細(xì)胞碎片。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，可利用多種從單細(xì)胞宿主生物體中提取異源蛋白質(zhì)的方法來代替上述的一般提取技術(shù)或進(jìn)行進(jìn)一步的純化。1988年4月13日提交的Cregg等人的專利申請(qǐng)(代理人案卷號(hào)為32342US，該文已列為本文參考文獻(xiàn))中公開了本發(fā)明優(yōu)選的純化方法。
下列非限定性實(shí)施例旨在進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例菌株用于下述實(shí)施例的宿主酵母菌株是巴斯德畢赤酵母GS115(his4)NRRLY-15851。
巴斯德畢赤酵母PPF1(arg4his4)NRRLY-18017。
大腸桿菌MC1061NRRL18016。
大腸桿菌JM103δ(lacPro)thirpsL(strA)supEendAsbcBhsdR。
培養(yǎng)基YPD，1升20g酵母浸膏20g蛋白20g葡萄糖LB培養(yǎng)液，1升5.0g酵母浸膏(Difco)10.0g蛋白5.0gNaClTE緩沖液1.0mMEDTA溶于0.01M(PH7.4)
Tris緩沖液PEG溶液20%聚乙二醇-335010mM CaCl210mMTris-HCl(pH7.4)一過濾除菌溶液A0.2MTris-HCl(pH7.5)0.1M MgCl20.5MNaCl0.01M二硫蘇糖醇(DTT)溶液B0.2MTris-HCl(pH7.5)0.1M MgCl20.1MDTT20×SSPE4.4gNaOH7.4g Na2EDTA27.6g NaH2PO4·H2O210gNaCl-用NaOH將pH調(diào)至7.5-
8.0-加H2O至1升10×轉(zhuǎn)移緩沖液5.0gNaCl96.8gTrizma堿9.74g甘氨酸加水至1升實(shí)施例1載體pTBO4的構(gòu)建質(zhì)粒AM6是圖6所示HBV基因組的衍生物，其中pBR322質(zhì)粒是在26位BamHⅠ位點(diǎn)插入的。
載體pTBO4含有編碼乙型肝炎表面抗原前S2形式之281個(gè)氨基酸的基因。該基因由三個(gè)片段構(gòu)成C末端75%結(jié)構(gòu)基因、編碼13個(gè)氨基酸的N末端接頭，及其余的中心部分。含有adw血型前S2基團(tuán)的質(zhì)粒AM6是本發(fā)明所用C末端部分和中間部分的來源。Valenzuela等人(ICN-UCLA Symposia on Animal Virus Genetics，p57-70，1980)公開了具有下列修飾的順序天然順序ATG-CAG-TGG-AAT-TCC誘變的順序ATG-CAG-TGG-AAC-TCCA.前S2的C末端部分(所有限制酶均得自BoehringerMannheim公司，并按制造廠商推薦的方法使用之)。
經(jīng)DraⅠ消化，由質(zhì)粒AM6(圖1)中分離C末端部分，DraⅠ在兩個(gè)位置切斷HBV基因組，其中一個(gè)是在表面抗原最后一個(gè)氨基酸的密碼子處。在30μl反應(yīng)體積中用牛小腸堿性磷酸酶處理(在50mM Tris Cl，pH9.0，1mM MgCl2、100μm ZnCl2、1mM亞精胺中于37℃用1單位酶處理1小時(shí))以使末端去磷酸化。用苯酚抽提并用乙醇沉淀全部消化產(chǎn)物(Maniatis等)。用氰乙基氨基磷酸酯化學(xué)法用Applied Biosystems 380A型DNA合成儀合成八聚StuⅠ接頭(AAGGCCTT)。將1μg StuⅠ接頭溶解于重蒸餾水中。取出10ng等分樣品并于37℃在總體積為50μl含70mM Tris Cl(pH7.6)、10mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇、1mM ATP和10單位多核苷酸激酶的反應(yīng)介質(zhì)中用磷酸鹽標(biāo)記30分鐘。將接頭加熱到90℃終止酶促反應(yīng)，并緩慢冷卻到室溫以利于雙鏈DNA形成。將StuⅠ接頭加至上述DraⅠ消化產(chǎn)物中并按下述方法用T4連接酶連接之。反應(yīng)于23℃在含6.6M Tris·Cl(pH7.6)、5mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇、1mM ATP和1Weiss單位T4連接酶的10μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行1小時(shí)。用苯酚抽提以終止連接反應(yīng)然后用乙醇沉淀。然后用大于50單位的酶進(jìn)行StuⅠ限制性消化(過夜)，以除去StuⅠ接頭的多聚體。DraⅠ消化與StuⅠ接頭結(jié)合恢復(fù)了因DraⅠ消化而除去的轉(zhuǎn)譯終止密碼子。
用XbaⅠ消化StuⅠ連接的DraⅠ片段，產(chǎn)生約600bp長的所需之StuⅠ/XbaⅠ片段由0.8%制備性瓊脂糖凝膠中分離之。該片段含有C末端75%的基因并將該片段克隆到已用XbaⅠ和StuⅠ消化的、并按上述方法去磷酸化的載體PYM4(圖7中)。(可用ClaⅠ消化pVM30并重新連接末端而由質(zhì)粒PYM30得到PYM4。PYM30則得自寄存在Northern Regional Research Center，United States Department of Agriculture，Peoria，Illinois的大腸桿菌宿主[寄存登記號(hào)為NRRL B-15890])。由0.8%制備性瓊脂糖凝膠中分離pYM4的5.7Kb限制性片段。使用載體pYM4僅僅因它具有方便的限制性位點(diǎn)。50ng載體和500ng插入片段在50mM Tris-HCl(pH7.4)10mM MgCl2、10mM二硫蘇糖醇、1mM亞精胺、1mM ATP中于23℃用1Weiss單位T4連接酶連接1小時(shí)(10μl反應(yīng)體積)。用連接反應(yīng)混合物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)MC 1061細(xì)胞(大腸桿菌)使之成為氨芐青霉素抗性菌株。大腸桿菌菌株MC1061寄存于Northern Regional Research Center，United States Department of Agriculture，Peoria，Illinois，寄存登記號(hào)為NRRL-18016。MC1061具有下列表型特征F(-)，araD139 δ(lac IPOZY)X74 galk galUhsr hsm(+)rpsL δ(ara ABOIC leu)7697。按下述方法使MC1061成為便于轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞在Damon IEC DPR600離心機(jī)中以3，000rpm、4℃離心5分鐘以收獲大腸桿菌MC1061的對(duì)數(shù)生長中期培養(yǎng)物(50ml)并在10mM NaCl中洗滌。將培養(yǎng)物重新懸浮于25ml 50mM CaCl2中(0℃，30分鐘)。在上述條件下離心細(xì)胞并再次懸浮于2ml 50mM CaCl3中。轉(zhuǎn)化時(shí)，將連接反應(yīng)混合物加到100μl感受態(tài)細(xì)胞懸浮中，在冰上(0℃)放置15分鐘、于37℃熱沖擊15分鐘并于23℃保溫5分鐘。將細(xì)胞直接平鋪在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平皿上。平皿于37℃保溫10-16小時(shí)。收獲所得菌落并用限制性酶消化法進(jìn)行鑒定。將細(xì)胞在含有50μg/ml氨芐青霉素的5ml L-培養(yǎng)液中于37℃生長5小時(shí)，并按Birnboim和Doly(Nucleic Acids Research I1513，1979)的方法制備DNA。用BamHⅠ和XbaⅠ消化微量制備物。產(chǎn)生1.5Kb Xba/Bam酶切片段的培養(yǎng)物被視為具有插入段，并按上述方法純化一個(gè)培養(yǎng)物的大量DNA制品，然后在氯化-溴乙啶梯度離心分帶。該克隆被稱為PHS1。
用Stu1消化質(zhì)粒PHS1，按上述方法去磷酸化、用苯酚抽提并用乙醇沉淀。按前述方法將合成的EcoRⅠ接頭(GGAATTCC)磷酸化、自身退火并連接到該平頭末端的DNA上。經(jīng)EcoRⅠ消化過夜除去過量接頭，繼之用XbaⅠ消化DNA，然后用苯酚提取并用乙醇沉淀。經(jīng)1.0%制備性凝膠電泳分離含所需600bpXbaⅠ-EcoRⅠ片段和582bp(XbaⅠ-EcoRⅠ)載體片段的二種片段混合物。將這些片段連接到按上述方法用XbaⅠ-EcoRⅠ消化并去磷酸化的PUC18(50ng)上，用上述方法轉(zhuǎn)化MC1061細(xì)胞使之成為有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體。用DNA微量制備物的限制性消化產(chǎn)物確定兩片段中那一個(gè)已被克隆。不需要的片段具有一ClaⅠ位點(diǎn)，從而使ClaⅠ/XbaⅠ雙重消化產(chǎn)物產(chǎn)生大約560bp+2400bp的二個(gè)片段，而正確的片段在經(jīng)ClaⅠ/XbaⅠ消化之后則產(chǎn)生一線性3Kb片段。用EcoRⅠ和XcaⅠ消化所得的片段可產(chǎn)生600bp+2400bp的片段。大量純化一個(gè)這樣的克隆并定名為PHS2-B。其完整前S2基因C末端區(qū)域的最后密碼子后含有一EcoRⅠ位點(diǎn)。
B.前S2基因的中間部分按下述方法克隆前S2基因的中間部分。用XbaⅠ和BamHⅠ消化質(zhì)粒AM6并由0.8%制備性瓊脂糖凝膠上分離出一250bp片段。按上述方法將該片段(50ng)連接到50ng用XbaⅠ和BamHⅠ消化并去磷酸化的PUC18上。按上述方法用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株MC1061，使之成為氨芐青霉素抗性菌株。用BamHⅠ消化微量樣品并選擇含2.7Kb線性片段者。大量增殖一個(gè)分離物并按上述方法分離和純化DNA。該克隆稱為pPS1。用EcoRⅠ和BamHⅠ切割該克隆并用0.8%制備性瓊脂糖凝膠經(jīng)電泳分離和純化載體帶。將下列按上述方法合成的激酶處理的雙鏈寡核苷酸連接到該載體上EcoRIRstIBamHI5′AATTCAATCCGTCTGCAG3′3′GTTAGGCAGACGTCCTAG5′用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061，使之成為氨芐青霉素抗性菌株。經(jīng)PstⅠ消化檢驗(yàn)微量制備物的確切特征。選擇一個(gè)含250bpPstⅠ片段的克隆，進(jìn)行大量制備并分離質(zhì)粒pPS2。
C.前S2基因的N末端部分由按上述方法合成之含下列順序的合成寡核苷酸產(chǎn)生包括EcoRⅠ和編碼N端開始的13個(gè)氨基酸順序的區(qū)域HindIIIEcoRIRstI5′AGCTTGAATTCATGCAGTGGAACTCCACTGCCTTCCACCAAACTCTGCA 3′3′ACTTAAGTACGTCACCTTGAGGTGACGGAAGGTGGTTTGAG5′該片段含有HindⅢ和PstⅠ末端及ATG前面的EcoRⅠ順序。與10倍于載體DNA的過量的寡核苷酸連接，而將該順序克隆到經(jīng)HindⅢ和PstⅠ消化并去磷酸化的PUC18中，根據(jù)一小EcoRⅠ片段(～75bp)的存在來鑒定轉(zhuǎn)化體。該克隆被稱為pTBO-2A。
用PstⅠ和XbaⅠ消化載體pTBO-2A而加入基因的中間部分;插入物為來自pPS2的250bp Pst-Xba片段。根據(jù)一大于300bp EcoRⅠ片段及290bp XbaⅠ/HindⅢ片段的存在來鑒定轉(zhuǎn)化體。該正確的分離物被稱為pTBO-3。將pTBO-3的HindⅢ/XbaⅠ片段插入XbaⅠ/HindⅢ消化的PHS2B中即得到完整的前S2基因。根據(jù)-825bp EcoRⅠ片段的存在鑒定氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。該構(gòu)建物被定名為pTBO4。
實(shí)施例Ⅱ載體pTB05A的構(gòu)建由載體pA0804和pTB04(分別見實(shí)施例Ⅴ和Ⅰ)構(gòu)建含前S2編碼基因的載體。按前述方法用EcoRⅠ消化2μgl)pA0804并在30μl反應(yīng)體積中用堿性磷酸酶處理之(于50mM Tris。Cl pH9.0、1mM MgCl2、100μM ZnCl2、1mM亞精胺中用1單位酶于37℃處理1小時(shí))。pTB04經(jīng)EcoRⅠ消化，釋放出編碼前S2基因的825bp片段。使用0.8%瓊脂糖經(jīng)制備性瓊脂糖凝膠電泳純化該片段。依實(shí)施例1中所述方法連接500ng片段和50ng PA0804。按實(shí)施例1中所述方法用所得載體轉(zhuǎn)化MC1061使之成為氨芐青霉素抗性菌株。使用Birnboin和Doly(Nucleic Acids Research 71513，1979)的方法分離DNA并用PstⅠ消化以鑒定其特征。檢出含2.1KbPstⅠ片段的一個(gè)克隆，證明其在正確方向上有一插入物并定名為pTB05A。
實(shí)施例ⅢpTB047模板的構(gòu)建用EcoRⅠ消化1μg雙鏈M13mp18DNA(由實(shí)施例1得到)并在30μl反應(yīng)體積中用牛小腸堿性磷酸酶處理使之去磷酸化(在50mM Tris·Cl，pH9，0.1mM MgCl2、100μM ZnCl2、1mM亞精胺中于37℃用1單位酶處理1小時(shí))。經(jīng)用HcoRⅠ消化由pTB04(見實(shí)施例1)中分離含前S2基因的825bp EcoRⅠ片段，然后用0.8%制備性瓊脂糖凝膠中分離之。按下述方法用T4連接酶連接50ng M13mp18載體和500ng EcoRⅠ插入物。反應(yīng)于23℃在10μl含6.6M Tris·Cl(pH 7.6)、5mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇、1mM ATP和1Weiss單位T4連接酶的反應(yīng)混合物中進(jìn)行1小時(shí)。
然后以下述方法用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化已成為感受態(tài)的大腸桿菌JM103細(xì)胞。在Damon IEC DPR600型臨床離心機(jī)中離心(3，000rpm、4℃，5分鐘)收獲大腸桿菌JM103細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長中期培養(yǎng)物(50ml)并在10mM NaCl中洗滌。將培養(yǎng)物于0℃在25ml 50mM CaCl2中重新懸浮30分鐘。按上述方法離心細(xì)胞并重新懸浮于2ml 50mM CaCl2中。
為進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將連接反應(yīng)混合物加到100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液中在冰上(0℃)放置15分鐘、于37℃熱沖擊5分鐘并于23℃保溫5分鐘。然后將細(xì)胞平鋪在含IPTG和X-gal的軟瓊脂凝膠中并倒在LB培養(yǎng)基上，于37℃保溫過夜，并篩選平皿中透明菌斑。
為確定那個(gè)菌斑有正確定向的插入片段，制備雙鏈DNA并分別用EcoRⅠ和XbaⅠ酶消化之。發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)具有靠近M13通用引物之插入部分的起始蛋氨酸，因而隨后會(huì)產(chǎn)生含有插入物之反義鏈的模板。該模板被定名為pTB047。
實(shí)施例ⅣpTBO-6和PHB6的構(gòu)建經(jīng)刪除編碼前S2前面的55個(gè)氨基酸的165bp而產(chǎn)生編碼226氨基酸的HBsAg(S形式)的DNA順序。可使用下列寡核苷酸引物，使模板pTB047(得自實(shí)施例Ⅲ)經(jīng)受M13引物指導(dǎo)的缺失誘變以達(dá)到上述目的EcoRI5′CGGGTACCGAGCTCGAATTCATGGAGAACATCACATCAGG3′該引物可使用AppliedBiosystems公司的380A型DNA合成儀借助氰乙基氨基磷酸酯化學(xué)法合成。按照下述程序進(jìn)行誘變。
對(duì)已經(jīng)在2ml LB培養(yǎng)基中保溫約7小時(shí)的陽性菌斑進(jìn)行微量制備。在25ml LB培養(yǎng)基中接種250μl新生長的JM103細(xì)胞。培養(yǎng)物生長1小時(shí)后接種100μl已保溫7小時(shí)的菌斑培養(yǎng)物。然后使培養(yǎng)物生長過夜。使用Sorvall RC-5B型SS34接頭將培養(yǎng)物離心(10，000rpm，10分鐘)兩次以澄清上清液。向培養(yǎng)物內(nèi)加入3.5ml20%PEG/2.5MNaCl并于4℃保溫5小時(shí)。然后依上述方法將培養(yǎng)物離心10分鐘。傾去上清并將沉淀物重新懸浮于2ml TE緩沖液中。然后用苯酚(用TE平衡過的)抽提、用苯酚/氯仿抽提一次、用CHCl3抽提二次、用乙醚抽提一次。加入8M LiCl使其終濃度達(dá)到0.8M。加入3倍體積的乙醇，將溶液于20℃下放置過夜以沉淀DNA。將溶液按前述方法再離心10分鐘(10，000rpm)并用70%乙醇洗滌。將沉淀物再懸浮于150μl 10mM Tris·Cl(pH7.4)中。
1微微摩爾(pmole)重組模板與20微微摩爾寡核苷酸引物及1μl溶液A混合。加入蒸餾水使終體積為10μl。樣品于65℃保溫5分鐘，然后將溫度降至37℃保溫30分鐘。
于樣品中再加入下列溶液溶液B1μl10mMdATP1μl10mMdCTP1μl10mMdGTP1μl10mMdTTP1μl5u/μlKlenow片段2μl蒸餾水3μl20μl于15℃下至少保溫4-6小時(shí)。
然后將樣品用蒸餾水稀釋40倍。取5μl用于6個(gè)試管的感受態(tài)JM103細(xì)胞(各200μl)。將已轉(zhuǎn)化的JM103細(xì)胞平鋪在上面蓋有軟瓊脂的LB培養(yǎng)基上。經(jīng)濾膜雜交法篩選陽性菌斑。按上述方法合成一個(gè)與寡核苷酸引物互補(bǔ)的雜交探針。取15pmole這種探針，在25μl總體積中65℃保溫10分鐘。加入3μl10×激酶緩沖液(Maniatis等)、1μl10mMATP和1μl多核苷酸激酶(100U/μl)。樣品于37℃保溫1小時(shí)并過G-50Sephadex柱。收集柱的第一個(gè)洗脫峰。
將磷酸纖維素濾膜在轉(zhuǎn)化平皿上定位放置5-10分鐘，而制得與上述探針雜交的硝酸纖維素濾膜。然后從平皿上取下濾膜并置于變性溶液(1.5M NaCl、0.5N NaOH)中漂浮3分鐘(正面朝溶液)。使濾膜在變性溶液中浸沒5分鐘，然后移入中和溶液(1M Tris·Cl，pH8，8，1.5M NaCl)內(nèi)浸5分鐘。再將已中和的濾膜移入2×SSC(1×SSC是150mM NaCl，15mM檸檬酸鈉)中浸5分鐘。將濾膜風(fēng)干并在真空下80℃烘烤1小時(shí)。使濾膜在含有5ml雜交緩沖液、10×Denhardts(1×Denhardts含0.02%Ficoll、0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.02%牛血清白蛋白)、0.5%SDS和5×SSPE的封閉的塑料袋中于65℃預(yù)雜交1小時(shí)。將緩沖液換成5ml/濾膜的新鮮雜交緩沖液。將先已制備的放射活性互補(bǔ)寡核苷酸于65℃保溫5分鐘，然后將足夠的探針加到含濾膜的新鮮雜交緩沖液中，達(dá)到1×106Cpm/ml。在低于計(jì)算之探針熔解溫度5℃條件下雜交4小時(shí)。
然后用6×SSC于室溫下將濾膜洗三次、每次10分鐘。最后于雜交溫度下用6×SSC洗一次。將濾膜置于3MMWhatman濾紙上干燥，然后壓片(作好定位標(biāo)記)曝光過夜。各摘取三個(gè)陽性菌斑，并分別在2mlLB培養(yǎng)液中37℃保溫5小時(shí)時(shí)。
對(duì)各陽性菌斑進(jìn)行模板微量制備。將1ml菌斑培養(yǎng)物移入Eppendorf離心管中并用Eppendorf5414型離心機(jī)離心5分鐘。收取800μl上清液并向其中加入200μl20%PEG/2.5MNaCl。然后將上清液在室溫下保溫10分鐘并在Eppendorf離心機(jī)中離心10分鐘。吸出上清液并將沉淀物重新溶解于200μl TE(10mM Tris，pH7.4∶1mM EDTA)。用苯酚/氯仿抽提溶解的沉淀物，并在上層水相加入LiCl溶液(使LiCl濃度達(dá)到0.8M)以沉淀模板DNA。加入2 1/2 -3倍體積乙醇，在干冰上放置5分鐘使樣品沉淀。按上述方法將沉淀物離心10分鐘。使終體積達(dá)到150μlTE。
用回收的DNA轉(zhuǎn)化200μl感受態(tài)JM103細(xì)胞。轉(zhuǎn)化中使用了1μl1/10稀釋的分離的噬菌體DNA。在平皿上平鋪轉(zhuǎn)化混合物并按前述方法用寡核苷酸篩選菌斑。
對(duì)已在2ml LB培養(yǎng)基中保溫約7小時(shí)的陽性菌斑進(jìn)行大范圍的微量制備。在25ml LB培養(yǎng)基中接種250μl新培養(yǎng)的JM103細(xì)胞。使培養(yǎng)物生長1小時(shí)并接種100μl已培養(yǎng)7小時(shí)的菌斑培養(yǎng)物。然后使培養(yǎng)物生長過夜，并在SS34轉(zhuǎn)頭于Sorvan MC-58離心機(jī)上以10，000rpm離心10分鐘以澄清上清液。向培養(yǎng)物內(nèi)加入3.5ml20%PEG/2.5M NaCl并于4℃保溫5小時(shí)。然后再次按上述方法將培養(yǎng)物離心10分鐘。棄去上清并將沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊重新溶解在2mlTE緩沖液中。用已用TE平衡過的苯酚抽提溶解的細(xì)胞沉淀，用苯酚/氯仿抽提一次、用CHCl3抽提兩次并用乙醚抽提一次。加入8M LiCl使其終濃度為0.8M。加入3倍體積的乙醇并將溶液放置過夜以沉淀其中的DNA。按前述方法以10，000rpm將溶液離心10分鐘并用70%乙醇洗滌。將沉淀物重新懸浮于150μl10mM Tris(pH7.4)中。
用菌落雜交法鑒定陽性菌落(GrunsteinandHogness，PNAS723961，1975)并用二脫氧順序測(cè)定法進(jìn)行順序分析，以找到具有正確突變的M13構(gòu)建物。按Maniatis等人的堿溶菌方法回收RFDNA。在0.8%制備性瓊脂糖凝膠上分離678bpEcoRⅠ片段并再克隆到pA0804和pA0811(分別參見實(shí)施例Ⅴ和Ⅵ)中。按實(shí)施例Ⅰ中所述方法用這兩個(gè)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061細(xì)胞。對(duì)DNA微量制備物進(jìn)行XbaⅠ消化(也如實(shí)施例Ⅰ所述)以鑒定含適當(dāng)定向之插入物的轉(zhuǎn)化體。一個(gè)衍生自pA0804的轉(zhuǎn)化體積被稱為pTB06，一個(gè)由pA0811轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體被稱為pHB6。
實(shí)施例ⅤpA0803和pA0804的構(gòu)建pA0804是一個(gè)能夠?qū)Π退沟庐叧嘟湍窤OX1座位產(chǎn)生位點(diǎn)特異性破壞作用的載體。它含有下列成分AOX1啟動(dòng)子和被唯一的EcoRⅠ克隆位點(diǎn)分開的轉(zhuǎn)錄終止子;野生型畢赤屬HIS4基因;AOX1座位3′末端的一段DNA基因組片段，位于轉(zhuǎn)錄終止子下游;在細(xì)菌宿主中篩選和復(fù)制所必需的順序。上述成分的排列應(yīng)使載體進(jìn)行一次限制性消化就能釋放一含有表達(dá)暗盒和篩選標(biāo)志的DNA片段，其末端同源于基因組的某一連續(xù)部分，即AOX1座位，并能在轉(zhuǎn)化過程中穩(wěn)定地插入染色體中。
pA0804是乙型肝炎表面抗原表達(dá)質(zhì)粒pBSAGI5I(NRRL18021)的衍生物。它是以含有下列修飾的pBR322為基礎(chǔ)的質(zhì)粒構(gòu)成的。用EcoRⅠ消化pBR322然后用苯酚抽提并用乙醇沉淀。然后用Klenow聚合酶填補(bǔ)末端。取2μgEcoRⅠ消化好的pBR322在25μl含50mMTris·Cl(pH7.2)、10mM MgSO4、100μM二硫蘇糖醇、50μg/ml牛血清白蛋白、100μM dATP、100μM dTTp和1單位Klenow聚合酶的反應(yīng)混合物中于室溫下保溫15分鐘。經(jīng)苯酚抽提和乙醇浮淀后連接DNA使成閉環(huán)質(zhì)粒，并用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061。根據(jù)沒有EcoRⅠ位點(diǎn)而存在PstⅠ、PvuⅡ和SalⅠ等診斷位點(diǎn)來篩選轉(zhuǎn)化體。該質(zhì)粒被稱為pBR322-RI。
進(jìn)一步修飾該質(zhì)粒，以在PvuⅡ位點(diǎn)摻入BglⅡ位點(diǎn)。用PvuⅡ消化質(zhì)粒并以平頭連接法加入磷酸化的BglⅡ接頭(GAGATCTC)。經(jīng)過夜BglⅡ消化除去過多的接頭，使用T4DNA連接酶將質(zhì)粒連成環(huán)形質(zhì)粒。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061使之成為氨芐青霉素抗性菌株。經(jīng)用BglⅡ限制性消化以證明BglⅡ位點(diǎn)的存在，并根據(jù)SalⅠ/BglⅡ消化產(chǎn)物以證明BglⅡ位點(diǎn)是在前述的PvuⅡ位點(diǎn)處，從而得以鑒定轉(zhuǎn)化體。該質(zhì)粒被稱為pBR322BglⅡ-RI。
由pBSAGI5I中提取一些DNA片段，并將它們裝配在pBR322BglⅡ-RI中而產(chǎn)生pA0804和pA0811從pBSAGI5I中取出長700bp的BglⅡ/XhoⅠ的AOX1座位的3′端目的片段，取其50ng與5ng已用SalⅠ和BglⅡ消化的親本質(zhì)粒連接。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061，使之成為氨芐青霉素抗性菌株。按實(shí)施例1中所述方法，根據(jù)微量制品DNA的BamHⅠ/BglⅡ消化產(chǎn)物確定轉(zhuǎn)化體特征，從而觀察到一大約900bp的片段。選擇一個(gè)這樣的轉(zhuǎn)化體并大量純化DNA。這樣的質(zhì)粒被定名pA0801。
用ClaⅠ消化質(zhì)粒pBSA6151并分離含有啟動(dòng)子一基因一終止子表達(dá)暗盒的2.1Kb片段。用ClaⅠ消化2μg pA0801并在30μl反應(yīng)混合物中用堿性磷酸酶處理之(在50mM Tris-HCl pH9.0、1mM、MgCl2、100μm ZnCl2、1mM亞精胺中于37℃用1單位酶處理1小時(shí))。50ng ClaⅠ片段與5ng pA0801載體連接，并用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061使之成為氨芐青霉素抗性菌株。經(jīng)BglⅡ消化鑒定這些菌落以證實(shí)產(chǎn)生2.3和2.7Kb片段之譜帶的片段已被插入并正確定向。該單一轉(zhuǎn)化體被稱為pA0802。
在乙型肝炎病毒表面抗原基因之3′端的唯一StuⅠ位點(diǎn)上切割質(zhì)粒pA0802。EcoRⅠ接頭經(jīng)磷酸化、退火并連接到StuⅠ消化的質(zhì)粒上。經(jīng)EcoRⅠ過夜消化除去過多的接頭。EcoRⅠ消化也在5′末端切斷HBsAg結(jié)構(gòu)基因，從而除去該基因。再連接后，通過唯一的EcoRⅠ克隆位點(diǎn)將啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子連接一起。經(jīng)BglⅡ消化再次定性氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體，鑒定具有正確譜帶(2.3和2.1Kb)的轉(zhuǎn)化體并定名為pA0803。
用BamHⅠ消化質(zhì)粒pA0803，經(jīng)制備性瓊脂糖凝膠電泳分離來自pYM10(圖8)的2.7KbBgaⅡ片段并連接到用BamHⅠ消化后去磷酸化的pA0803上。(pYM10是pYJ30(NRRLB-15890)的衍生物，后者在2959位上的BamHⅠ位點(diǎn)已被破壞。根據(jù)存在產(chǎn)生-7.4Kb片段的XbaⅠ位點(diǎn)和2.3及5.1Kb之BglⅡ酶切譜帶來鑒定轉(zhuǎn)化體。該質(zhì)粒被稱為pA0804。
實(shí)施例ⅥpA0811的構(gòu)建也構(gòu)建了含有酵母屬ARG4基因(而不是畢赤酵母屬HIS4基因)的第二個(gè)相關(guān)質(zhì)粒。ARG4基因的一個(gè)可能的來源是得自pYM25(其為一大腸桿菌宿主[NRRLB-18015]中的質(zhì)粒)的2.0KbHpaⅠ片段。該菌株可由NorthernRegionalResearchCenteroftheUnitedStatesDepartmentofAgriculture，Peoria，Illinois提供。
用0.8%制備性瓊脂糖凝膠純化片段。500ng片段與50ngBamHI消化的、末端填平的pA0803相連接(見實(shí)施例Ⅴ)。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌NC1061，使之成為氨芐青霉素抗性菌株。經(jīng)BglⅡ消化鑒定轉(zhuǎn)化體，并用瓊脂糖凝膠電泳法證實(shí)正確插入物的大小。該質(zhì)粒被稱為pA0811。
實(shí)施例Ⅶ酵母DNA微量制備104細(xì)胞/ml在5ml YPD于37℃生長過夜，然后使用Damon IED DPR600臨床離心機(jī)離心沉淀細(xì)胞(3，000rpm，5分鐘)。將細(xì)胞沉淀物懸浮于0.5ml 1M山梨醇、0.1ml0.5M EDTA(pH7.5)中并將樣品移入1.5ml離心管內(nèi)。加入0.02ml濃度為2.5ml/ml的Zymolyase 60，000(Miles Laboratories)并于37℃保溫60分鐘。用離心機(jī)以高速離心1分鐘得到細(xì)胞沉淀物，并重新懸浮于0.5ml50mMTris。Cl(pH7.4)和20mMEDTA中。加入0.05ml10%SDS，與樣品混合并于65℃保溫30分鐘。加入0.2ml5M醋酸鉀，并于冰上放置60分鐘。再次在離心機(jī)中以高速度將樣品離心5分鐘。
將上清液移入一干凈的1.5ml離心管內(nèi)并于室溫加入1倍體積的異丙醇?；靹驑悠凡⒂谑覝叵路胖?分鐘，然后在離心機(jī)中以高速度短時(shí)間離心(10秒鐘)。傾去上清并將沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊風(fēng)干。將沉淀重新懸浮于0.3ml10mMTris·Cl(pH7.4)和1mMEDTA中后，加入15μl胰RNA酶的1mg/ml溶液并于37℃保溫30分鐘。加入0.03ml3M醋酸鈉，與混勻樣品后再加入0.2ml異丙醇。在離心機(jī)中以高速度離心樣品得到DNA沉淀物。棄去上清，將沉淀物風(fēng)干并重新懸浮于0.1-0.3ml10mMTris·Cl(pH7.4)和1mMEDTA中。(注將該DNA用于限制性酶切之前，須將溶液以高速度離心15分鐘以除去可能抑制消化作用的不溶性物質(zhì))。
實(shí)施例Ⅷ混合顆粒菌株的開發(fā)按下述方法構(gòu)建含編碼乙型肝炎表面抗原S(p24)和前S2(p31)形式之表達(dá)暗盒的兩個(gè)混合的顆粒菌株。使用Cregg等人(Bio/Technology 5479，1987)所述的原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化技術(shù)，用1μg未切割的pHB6轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母PPF1(arg4 his4)(pHB6是實(shí)施例Ⅳ和Ⅵ中所述含S基團(tuán)之pA0811的亞克隆)。在含有組氨酸的基本培養(yǎng)基上重新獲得已證明的精氨酸原養(yǎng)型的轉(zhuǎn)化體并按下述方法就整合位點(diǎn)進(jìn)行篩選。
按實(shí)施例Ⅶ所述方法由這些轉(zhuǎn)化體和野生型巴斯德畢赤酵母制備DNA，用EcoRⅠ消化并在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳。對(duì)這些DNA進(jìn)行Southern印跡分析(Maniatis等，1983)，并使濾膜與AOXⅠ特異性探針(pPG4.0，NRRL15868)或HIS4特異性探針(pYM4)雜交。pYM4詳見實(shí)施例Ⅰ中所述。
將已知重組體與野型菌株的雜交印跡譜相比較以確定整合的位點(diǎn)。野生型帶的任何改變都是那個(gè)座位處發(fā)生整合的證據(jù)。將在AOXⅠ座位5′端有一整合，而且還含有野生型AOXⅠ基因及HIS4突變的轉(zhuǎn)化體稱為PPEⅠ/PHB6。
然后用上述BglⅡ切割的pTB05A(得自實(shí)施例Ⅱ)轉(zhuǎn)化該菌株。在基本培養(yǎng)基上再生已證明為組氨酸原養(yǎng)型的轉(zhuǎn)化體并就“methanolslow”(Mut-)表型進(jìn)行篩選，其表明了AOXⅠ座位的整合?？砂聪率龇椒êY選表型在無菌蒸餾水存在下刮取平皿的表面收集轉(zhuǎn)化菌并以低輸出功率超聲處理15秒鐘。然后稀釋到A600＝0.1，并以10-3和10-4稀釋度各重復(fù)兩份平鋪在含有甘油(作為碳源)的基本平皿上，在30℃下保溫2-3天。然后將它們復(fù)制于另外的基本平皿上，該平皿內(nèi)已在汽相中加入了100μl甲醇。30℃保溫24小時(shí)后顯現(xiàn)在甲醇存在時(shí)有10-20%的轉(zhuǎn)化體比其余轉(zhuǎn)化體生長得慢。然后選擇10個(gè)這樣的慢速生長的菌落作進(jìn)一步的分析。由含有甘油的基本平皿中采集相應(yīng)的菌落，依實(shí)施例Ⅸ中所述方法在搖瓶中培養(yǎng)，并按實(shí)施例Ⅺ所述方法檢測(cè)22nm樣顆粒的活性。按上述方法確定有pHB6的轉(zhuǎn)化株。將所得菌株定名為PPFⅠ/pTB012-1，其表達(dá)了p24和p31蛋白的一個(gè)拷貝。
鑒定了另一個(gè)已整合了前S2表達(dá)暗盒之兩個(gè)拷貝的菌株。其被稱為PPE1/pTB012-2并表達(dá)了前S2基因的兩個(gè)拷貝和S基因的一個(gè)拷貝。
表3中顯示了顆粒表達(dá)水平。
表3顆粒表達(dá)水平菌株暗盒蛋白質(zhì) (AUSRIATM)PPF1/pTB012-1 1前S2p31 ～150-2001Sp24μg顆粒/ml溶菌產(chǎn)物PPF1/pTB012-2 2前S2p31 ～150-2001Sp24μg顆粒/ml溶菌產(chǎn)物另外，對(duì)部分純化的蛋白制品進(jìn)行SDS/PAGE分析和銀染色表明了p24和p31的存在。
實(shí)施例Ⅸ搖瓶表達(dá)研究發(fā)酵之前，所有菌株均按下述方法培養(yǎng)在搖瓶中以確保表達(dá)水平。按常規(guī)方法，將轉(zhuǎn)化株細(xì)胞接種在含2-5%甘油的0.67%酵母氮源基質(zhì)中并于30℃培養(yǎng)過夜達(dá)到中至晚對(duì)數(shù)生長期。然后使用Damon IEC DPR600臨床離心機(jī)離心(3，000 rpm，5分鐘)收集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀物用無菌水洗兩次，然后以0.5A600單位/ml的密度接種于磷酸鹽緩沖之含1%甲醇的0.67%YNB中，并以中等搖動(dòng)速度于30℃培養(yǎng)4-6天。在不同時(shí)間，取出50A600單位的等分樣品并儲(chǔ)存于-20℃下。用由這些等分樣品制得的蛋白提取物進(jìn)行AUSRIATM(見實(shí)施例Ⅺ)和Western印跡分析(Towbin等，PNAS 764350，1979)。所用抗體(1∶1000稀釋)為得自Calbioche公司的Lot ＃702106。將細(xì)胞的等分樣品(100A600單位)移入13×100mm硼硅酸鹽培養(yǎng)管中并在Sorvalll RC-5B型離心機(jī)中離心(12，000rpm4℃)，用20倍體積的溶菌緩沖液(0.5M NaCl、0.1%Triton X-100(W/V)、1M苯基、甲基磺酰氟(PMSF)和10mM磷酸鈉，pH7.5)洗兩次。用0.5g酸洗的玻璃珠(0.5mm)加0.35ml溶菌緩沖液懸浮細(xì)胞樣品，并使用Vortex混合器以最大速度及一分鐘間隔期攪拌8次。兩次攪拌之間，使混合物在冰上至少冷卻1分鐘。完成溶菌后，取出含破碎細(xì)胞的溶液并用0.35ml溶菌緩沖液洗玻璃珠。結(jié)合兩溶液并使用Sorvall RC-5B型離心(13，000rpm，44℃)以除去細(xì)胞碎片。然后用AUSRIATM方法和Western印跡分析法檢測(cè)蛋白樣品。經(jīng)TCA沉淀后用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
實(shí)施例Ⅹ發(fā)酵表達(dá)研究按下述方法發(fā)酵。向Fembach瓶內(nèi)的500ml酵母氮基質(zhì)(YNB)+2%甘油中接種取自種子培養(yǎng)物或基本葡萄糖平皿的培養(yǎng)物。(平皿培養(yǎng)物是經(jīng)沒有可測(cè)知之退化的情況下每月傳代得以保留的)。于30℃200rpm旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)1天后，將種菌接種到含480g甘油、40mg生物素和40ml微量鹽溶液(表5)的7.5升基本培養(yǎng)基(表4)中。發(fā)酵器置于30℃和PH5.5條件下，使培養(yǎng)以批量形式生長直到甘油被消耗完了為止(約24小時(shí)時(shí))。中間可通入NH3氣以控制pH值。根據(jù)CO2排出量的急劇降低和溶解氧的急劇增加(或氧攝入率的降低)來記錄甘油消耗?？砂?8ml/小時(shí)的進(jìn)料速率添加甲醇，以使發(fā)酵罐內(nèi)達(dá)到～0.5%MeOH，并維持在這一水平?？筛鶕?jù)甲醇的實(shí)際消耗速率調(diào)整其流速。以大約2天間隔加入20ml等量的微量鹽溶液，以維持甲醇消耗速度。在給送甲醇后約7-8天內(nèi)HBsAg的水平持續(xù)增加。
表4培養(yǎng)基組成(7.5升)480g甘油40mg生物素134ml H3PO4(85%)5.8g CaSO4·2H2O92g H2SO475g MgSO4·7H2O21gKOH
表5IM1微量鹽溶液五水含硫酸酮0.06碘化鉀0.08一水含硫酸錳0.30鉬酸鈉0.20硼酸0.02一水合硫酸鋅2.00一水合氯化鐵4.8硫酸5.00ml/升實(shí)施例ⅪAUSRIATM放射免疫檢測(cè)法用Abbott AUSRIATM檢測(cè)藥盒測(cè)定由畢赤酵母屬生產(chǎn)系統(tǒng)合成的HBsAg的量。藥盒中所含抗體與HBsAg顆粒結(jié)合，而不與HBsAg單體結(jié)合。所有稀釋液都是在含1.0%BSA和0.02%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)中配制的。檢測(cè)方法基本上如藥盒使用說明書所述。按下述劑量加拌并制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
管號(hào)檢測(cè)的ng數(shù)緩沖液(μl)陽性對(duì)照(μl)1-4無NSB無只加200μl緩沖液5-60.119557-80.2190109-100.51752511-121.01505013-142.010010015-163.05015017-184.0無200按下述方法標(biāo)記微量滴定板的各小孔。
AABBCCDD112342567839101112413141516517181920
首先向各小孔內(nèi)加入小珠，然后加緩沖液，最后加標(biāo)準(zhǔn)(陽性對(duì)照)或經(jīng)稀釋的樣品。稀釋待測(cè)樣品以得到處于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的信號(hào)。一般將樣品密度(mg/ml)的估計(jì)值除以0.02即得到所使用的稀釋度。通常向含有100μl緩沖液的小孔內(nèi)加入100μl樣品。蓋上小孔并對(duì)照實(shí)驗(yàn)桌面輕輕叩擊淺盤。然后于室溫下將樣品放置過夜以獲得最大結(jié)合效率。次日早晨使用由Abbott Labs公司提供的PentZwash系統(tǒng)用去離心水將各小孔洗4次。向各小井內(nèi)加入200μl125Ⅰ標(biāo)記的抗-HBs抗體，輕輕敲擊淺盤，然后在45℃水浴中保溫1小時(shí)。按前述方法洗小珠并對(duì)放射活性計(jì)數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定待測(cè)物的濃度。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)基本由S和前S2蛋白組成之抗原性HBV顆粒的方法，其包括a)用至少一個(gè)含可操作地連接到調(diào)節(jié)區(qū)和3′終止順序上之S蛋白結(jié)構(gòu)的基因的表達(dá)暗盒，和至少一個(gè)含可操作地連接到調(diào)節(jié)區(qū)及3′終止順序上之前S2蛋白結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)暗盤轉(zhuǎn)化甲基營養(yǎng)酵母，然后b)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)所得到的已轉(zhuǎn)化的酵母菌株以產(chǎn)生所說的HBV顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的轉(zhuǎn)化是選自質(zhì)?；蚓€性整合位點(diǎn)特異性載體的至少一個(gè)載體完成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中載體是整合性的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中使用了含下列依次排列之成分的第一個(gè)整合位點(diǎn)特異性載體ⅰ)第一個(gè)可插入的DNA片段，ⅱ)標(biāo)志基因，和至少一個(gè)含可操作地連接到調(diào)節(jié)區(qū)及3′終止順序上之前S2蛋白結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)暗盒，以及ⅲ)第二個(gè)可插入的DNA片段其中標(biāo)志基因和組分(ⅱ)之暗盒的次序是可以互換的b)和含有下列組分的第二個(gè)整合載體ⅰ)至少一個(gè)可插入的DNA片段，ⅱ)標(biāo)志基因，和至少一個(gè)含可操作地連接到調(diào)節(jié)區(qū)及3′終止順序上之S蛋白結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)暗盒，其中標(biāo)志基因和組分(ⅱ)之暗盒的次序是可以互換的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的可插入之DNA片段是由分離自巴斯德酵母并選自AOX1、p40、DHAS和HIS4的基因的DNA順序衍生的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中至少一個(gè)表達(dá)暗盒包含a)選自由巴斯德畢赤酵母分離的AOX1、p40、DHAS、由釀酒酵母分離的酸性磷酸酶、半乳糖激酶、醇脫氫酶、細(xì)胞色素C、α接合因子及3-磷酸甘油醛脫氫酶的調(diào)節(jié)區(qū)，該調(diào)節(jié)區(qū)可操作地連接到b)前S2蛋白的結(jié)構(gòu)基因上，該結(jié)構(gòu)基因可操作地連接到c)選自由AOX1基因、p40基因、DHAS基因和HISHIS4基因分離之一組3′終止順序的巴斯德畢赤酵母3′終止順序上。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中至少一個(gè)表達(dá)暗盒包含a)選自由巴斯德畢赤酵母分離的AOX1、p40、DHA、由釀酒酵母分離的酸性磷酸酶、半乳糖激酶、醇脫氫酶、細(xì)胞色素C、α接合因子及3-磷酸甘油醛脫氫酶的調(diào)節(jié)區(qū)，該調(diào)節(jié)區(qū)可操作地連接到b)S蛋白的結(jié)構(gòu)基因上，該結(jié)構(gòu)基因可操作地連接到c)選自從AOX1基因、p40基因、DHAS基因和HISHIS4基因分離之一組終止順序的巴斯德畢赤酵母3′終止順序上。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的標(biāo)志基因選自從巴斯德畢赤酵母分離的HIS4和ARG4、從釀酒酵母分離的SUC2及Tn903和Tn601的新霉素抗性基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所說的標(biāo)志基因是獨(dú)自被選擇的不同基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的含有前S2結(jié)構(gòu)基因的載體包含a)第一個(gè)可插入的DNA片段，其為由巴斯德畢赤酵母中分離的長約一千堿基的5′AOX1調(diào)節(jié)區(qū)，該片段可操作地連接到b)前S2蛋白的結(jié)構(gòu)基因上，該結(jié)構(gòu)基因可操作地連接到c)由巴斯德畢赤酵母中分離之AOX1的3′終止順序上，該終止順序連接到d)由巴斯德畢赤酵母中分離的標(biāo)志基因HIS4上，該標(biāo)志基因則連接到e)第二個(gè)可插入的DNA片段上，該片段為大約0.65千堿基的3′AOX1終止順序。
11.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的含S結(jié)構(gòu)基因的載體包含a)一個(gè)可插入的DNA片段，其為由巴斯德畢赤酵母中分離的約一千堿基的5′AOX1調(diào)節(jié)區(qū)，該片段可操作地連接到b)S蛋白的結(jié)構(gòu)基因上，該結(jié)構(gòu)基因可操作地連接到c)由巴斯德畢赤酵母中分離之AOX1的3′終止順序上，該終止順序連接到d)由釀酒酵母中分離的標(biāo)志基因ARG4上，該標(biāo)志基因連接到e)一可插入的DNA片段上，該片段為長約0.65千堿基的3′AOX1終止順序。
12.一個(gè)整合載體，其包含a)至少一個(gè)可插入的DNA片段，其為由巴斯德畢赤酵母中分離的長約一千堿基的5′AOX1基因之可操作的調(diào)節(jié)區(qū)，該片段可操作地連接到b)S蛋白的結(jié)構(gòu)基因上，該結(jié)構(gòu)基因可操作地連接到c)由巴斯德畢赤酵母中分離的AOX13′終止順序上，該終止順序被連接到d)由巴斯德畢赤酵母中分離的標(biāo)志基因ARG4上，該標(biāo)志基因則被連接到e)第二個(gè)可插入的DNA片段上，該片段為長約0.65千堿基的3′AOX1終止順序。
13.用至少一個(gè)包含依次可操作地連接了一調(diào)節(jié)區(qū)、一前S2結(jié)構(gòu)基因及-3′終止順序的表達(dá)暗盒，和至少一個(gè)包含依次可操作地連接了一調(diào)節(jié)區(qū)、-S結(jié)構(gòu)基因及-3′終止順序的表達(dá)暗盒轉(zhuǎn)化的甲基營養(yǎng)酵母。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的甲基營養(yǎng)酵母，其中酵母是巴斯德畢赤酵母。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的甲基營養(yǎng)酵母，其中酵母是巴斯德畢赤酵母菌株P(guān)PF1。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的巴斯德畢赤酵母PPF1，其中所說的PPF1是用下列載體轉(zhuǎn)化的(a)至少一個(gè)線性整合的位點(diǎn)特異性載體，其具下列依次排列的片段，ⅰ)第一個(gè)可插入的DNA片段，ⅱ)一標(biāo)志基因和至少含有前S2結(jié)構(gòu)基因的畢赤酵母屬相容性表達(dá)暗盒，其可操作地連接于ⅲ)選自從巴斯德畢赤酵母AOX1基因、p40基因、DHAS基因和HIS4基因分離之3′終止順序的3′終止順序上，ⅳ)第二個(gè)可插入的DNA片段，其中標(biāo)志基因和組分(ⅱ)之暗盒次序可以互換的，以及(b)至少一個(gè)含有下列成分的整合載體ⅰ)至少一個(gè)可插入的DNA片段，ⅱ)一標(biāo)志基因和至少一個(gè)含有S結(jié)構(gòu)基因的畢赤酵母屬相容性表達(dá)暗盒，其可操作地連接于ⅲ)選自從巴斯德畢赤酵母AOX1基因、p40基因、DHAS基因和HIS4基因分離之3′終止順序的3′終止順序上，其中標(biāo)志基因和組分(ⅱ)之暗盒的次序是可以互換的。
17.含權(quán)利要求16之前S2結(jié)構(gòu)基因的線性位點(diǎn)特異性整合載體，所說的載體包含a)第一個(gè)可插入的DNA片段，其為由巴斯德畢赤酵母中分離的長約一千堿基的5′AOX1調(diào)節(jié)區(qū)，該片段可操作地連接到b)前S2結(jié)構(gòu)基因上，該結(jié)構(gòu)基因可操作地連接到c)由巴斯德畢赤酵母中分離之AOX1的3′終止順序上，該終止順序連接到d)由巴斯德畢赤酵母中分離的HIS4標(biāo)志基因上，該標(biāo)志基因則與e)第二個(gè)可插入的DNA片段連接，該片段為長約0.65千堿基的3′AOX1終止順序。
18.含權(quán)利要求16之S結(jié)構(gòu)基因的整合載體所說的載體，所說載體包含a)第一個(gè)可插入的DNA片段，其為由巴斯德畢赤酵母中分離之長約一千堿基的5′AOX1調(diào)節(jié)區(qū)，該片段可操作地連接到b)S結(jié)構(gòu)基因上，該結(jié)構(gòu)基因可操作地連接到c)由巴斯德畢赤酵母中分離之AOX1的3′終止順序上，該終止順序連接于d)一標(biāo)志基因上，其為由釀酒酵母中分離的ARG4并與e)第二個(gè)可插入的DNA片段連接，該片段為長約0.65千堿基的3′AOX1終止順序。
19.巴斯德畢赤酵母PPF1/pTBO12-1。
20.按權(quán)利要求16方法轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母PPF1，其中所說的PPF1是用所說線性整合位點(diǎn)特異性載體的一個(gè)以上拷貝轉(zhuǎn)化的。
21.巴斯德畢赤酵母PPF1/pTBO12-2。
22.用權(quán)利要求1的方法制得的抗原性HBV顆粒。
全文摘要
提高主要由乙型肝炎S蛋白和前S
文檔編號(hào)C12N1/16GK1038668SQ89103330
公開日1990年1月10日 申請(qǐng)日期1989年5月13日 優(yōu)先權(quán)日1988年5月13日
發(fā)明者格里高利·帕特里克·泰爾 申請(qǐng)人:菲利普石油公司