專(zhuān)利名稱(chēng)：L-丙氨酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，更具體地說(shuō)涉及氨基酸的制備方法，更確切地說(shuō)是關(guān)于用發(fā)酶法制取L-丙氨酸的方法。
本申請(qǐng)的發(fā)明可用于醫(yī)學(xué)，化學(xué)、食品和煙草工業(yè)。
已知制備L-丙氨酸的方法是通過(guò)具有β-脫羧酶活性的微生物固定化細(xì)胞的作用從天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)化而制備的(US，A，3898128)。
這種已知方法是多步驟的，這與必需分步制取有關(guān)，例如在方法的第一步通過(guò)天門(mén)冬氨酸酶的作用將富馬酸銨轉(zhuǎn)化成L-天門(mén)冬氨酸，方法的第二步-將所得的L-天門(mén)冬氨酸通過(guò)L-天門(mén)冬氨酸-β-脫羧酶的作用而轉(zhuǎn)化成L-丙氨酸。(ProgressinIndustrialMicrobiology，V.24，1986，Tokyo，I，Chibate，T.Tosa，T.Kakimoto“Alamine”，P.224-232)。
從外消旋混合物中分離L-丙氨酸的已知方法，包括將D，L-丙氨酸進(jìn)行乙酰化，然后借助于酰化氨基酸水解酶選擇性地水解乙?；?L-丙氨酸而獲得L-丙氨酸。此后由乙?；?D-丙氨酸中分離L-丙氨酸(US，A，3386888)。
上述方法是多步驟的，必需要制取中間產(chǎn)物D，L-丙氨酸、乙?；?D，L-丙氨酸、?；被崴饷?，這樣就使工藝復(fù)雜化并提高了工藝成本。
本發(fā)明的任務(wù)是使用微生物的新的突變體而建立一種制備L-丙氨酸的方法，該方法可以簡(jiǎn)化制備目的產(chǎn)物的工藝，并在培養(yǎng)液中達(dá)到工業(yè)上可接受的目的產(chǎn)物的產(chǎn)率。
此任務(wù)是這樣解決的在通過(guò)在含有可消化的碳、氮源，無(wú)機(jī)鹽和刺激微生物生長(zhǎng)的有機(jī)化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)短桿菌和棒狀菌屬微生物，在培養(yǎng)液中集聚L-丙氨酸，分離目的產(chǎn)物的L-丙氨酸的制備方法中，按照本發(fā)明，作為微生物使用為生長(zhǎng)需要D-丙氨酸的短桿菌和棒狀桿菌屬的微生物突變體。
由于本發(fā)明，不需過(guò)去由外消旋混合物中分離L-丙氨酸所必要的步驟，就可以在培養(yǎng)液中制取旋光純的L-丙氨酸，同時(shí)在培養(yǎng)液中目的產(chǎn)物的含量達(dá)到28克/升。
根據(jù)本發(fā)明，最好使用黃色短桿菌種(Brevibacteriumflavum)微生物突變體，它們寄存在全蘇遺傳和選育工業(yè)微生物科學(xué)研究所，URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1號(hào)(Vsesojuznynauchno-issledovatelskyinstitutgenetikiiselektsiipromyshlennykhmicroorganismov(VNIIGenetiki)URSS，113545，Moscow，Dorozhnyproezd，1)AA1黃色短桿菌菌株，在1984年4月5日登記，其登記號(hào)為B-3061;
AA2黃色短桿菌菌株，于1984年4月5日登記，其登記號(hào)為B-3062。
根據(jù)本發(fā)明，為了隨后在培養(yǎng)液中增加目的產(chǎn)物的含量(達(dá)44克/升)，最好使用對(duì)D，L-α-氨基丁酸穩(wěn)定的短桿菌屬微生物突變體。
根據(jù)本發(fā)明，宜于使用黃色短桿菌種微生物突變體，它們寄存在全蘇遺傳和選育工業(yè)微生物科學(xué)研究所，URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1號(hào)AA5黃色短桿菌菌株，于1987年4月1日登記，登記號(hào)為B-3991;
AA6黃色短桿菌菌株，于1987年4月1日登記，其登記號(hào)為B-3992。
此外，根據(jù)本發(fā)明，宜于使用戊二霉素棒狀桿菌種(Corynebacteriumglutamicum)的微生物突變體，它們寄存在全蘇遺傳和選育工業(yè)微生物科學(xué)研究所(VNIIGenetiki)URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1號(hào)AA41戊二霉素棒狀桿菌菌株，于1985年3月25日登記，其登記號(hào)是B-3321;
AA11戊二霉素棒狀桿菌菌株，于1985年3月25日登記，其登記號(hào)是B-3323。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的和優(yōu)點(diǎn)，從以下對(duì)L-丙氨酸制取方法的詳述中和實(shí)施該方法的具體實(shí)例中可以變得更加清楚。
本發(fā)明所推薦的L-丙氨酸制備方法基于利用在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生產(chǎn)L-丙氨酸的微生物。
推薦使用為生長(zhǎng)需要D-丙氨酸的短桿菌和棒狀桿菌屬的微生物的突變體。這些微生物的具體實(shí)例是生產(chǎn)L-丙氨酸的AA1黃色短桿菌菌株，它寄存在全蘇遺傳和選育工業(yè)微生物科學(xué)研究所(VNIIGenetiki)URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1號(hào)，在1984年4月5日登記，其登記號(hào)為B-3061;
生產(chǎn)L-丙氨酸的AA2黃色短桿菌菌株，它寄存在全蘇遺傳和選育工業(yè)微生物科學(xué)研究所(VNIIGenetiki)URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1號(hào)，在1984年4月5日登記，其登記號(hào)為B-3062;
生產(chǎn)L-丙氨酸的AA41戊二霉素棒狀桿菌菌株，它寄存在全蘇遺傳和選育工業(yè)微生物科學(xué)研究所(VNIIGenetiki)URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1號(hào)，在1985年3月25日登記，其登記號(hào)為B-3321;
生產(chǎn)L-丙氨酸的AA11戊二霉素棒狀桿菌菌株，它寄存在全蘇遺傳和選育工業(yè)微生物科學(xué)研究所(VNIIGenetiki)URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1號(hào)，在1985年3月25日登記，其登記號(hào)為B-3323。
根據(jù)本發(fā)明也建議使用需要D-丙氨酸并對(duì)D，L-氨基丁酸穩(wěn)定的短桿菌屬微生物突變體。這種微生物的實(shí)例可以是生產(chǎn)L-丙氨酸的AA5黃色短桿菌菌株或AA6黃色短桿菌菌株，它們寄存在全蘇遺傳和選育工業(yè)微生物科學(xué)研究所(VNII，Genetiki)URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1號(hào)，在1987年4月1日登記，其登記號(hào)分別為B-3991、B-3932。
對(duì)D-丙氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變可以用任何已知方法(例如，用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍處理或紫外線(xiàn)照射)由處理微生物而誘導(dǎo)產(chǎn)生。對(duì)D，L-α-氨基丁酸的穩(wěn)定性突變可以自生或可以用已知的任何方法由處理微生物而誘導(dǎo)產(chǎn)生。在微生物基因中對(duì)D，L-α-氨基丁酸的穩(wěn)定性突變和對(duì)D-丙氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變兩者共存可在任何反應(yīng)順序中實(shí)現(xiàn)。
作為用于選育需要D-丙氨酸的突變體的親本菌株可以使用任何生產(chǎn)外消旋丙氨酸的天然微生物或微生物的突變體。上述新菌株-AA1黃色短桿菌、AA2黃色短桿菌、AA6黃色短桿菌和AA5黃色短桿菌菌株通過(guò)遺傳一選育方法由ATCC14067黃色短桿菌菌株獲取，該菌株寄存在全蘇遺傳和選育工業(yè)微生物科學(xué)研究所(VNIIGenetiki)URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1號(hào)，并于1969年1月16日登記，其登記號(hào)是B-42。上述新的AA41戊二霉素棒狀桿菌菌株和AA11戊二霉素棒狀桿菌菌株是通過(guò)遺傳-選育方法由眾所周知的ATCC13032戊二霉素棒狀桿菌菌株獲取的。
然而，為選育本發(fā)明中所述的微生物的親本菌株或需要D-丙氨酸的并可對(duì)D，L-α-氨基丁酸穩(wěn)定的本發(fā)明的突變體型，可以使用屬于短桿菌或棒狀桿菌屬的任何微生物菌株。
AA1、AA2、AA41、AA11菌株按其本身的特性(除對(duì)D-丙氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷性和生產(chǎn)L-丙氨酸能力外)與其各自的親本菌株ATCC14067黃色短桿菌和ATCC13032戊二霉素棒狀桿菌沒(méi)有區(qū)別。
本發(fā)明的生產(chǎn)L-丙氨酸的菌株-AA1黃色短桿菌菌株和AA2黃色短桿菌菌株具有以下的形態(tài)-培養(yǎng)特征和生理生化特征。
細(xì)胞是卵形的，稍扁長(zhǎng)，不活動(dòng)的，非孢子形成的，革蘭氏陽(yáng)性的。在肉胨瓊脂上培養(yǎng)48小時(shí)后的菌落是園形的，具有光滑的，很少粗糙的表面，呈黃色，其直徑達(dá)2毫米。
兼性厭氧細(xì)菌。不稀釋明膠。發(fā)酵葡萄糖、蔗糖。吸收氨氮。在30～32℃和pH7.2～7.8條件下適宜生長(zhǎng)。為在最少的介質(zhì)中生長(zhǎng)需要生物素和硫胺素。
AA1黃色短桿菌菌株和AA2黃色短桿菌菌株的制取按下述方法實(shí)現(xiàn)在30℃，充氣條件下，在肉胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)ATCC14067菌株，直到其滴定度達(dá)109細(xì)胞/毫升。細(xì)胞用離心法洗去肉胨汁并再懸浮在檸檬酸鹽的緩沖液(pH5.5)中。在所得懸浮液中加入N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍使其最終濃度達(dá)300微克/毫升，在30℃，充氣條件下培養(yǎng)20分鐘。然后將細(xì)胞用冷卻的肉胨液洗去誘變劑，轉(zhuǎn)入有10毫升肉胨培養(yǎng)基的試管中，在30℃，充氣條件下培養(yǎng)18小時(shí)，然后接種在含有2%(重量)瓊脂的肉胨培養(yǎng)基表面上。在30℃，通過(guò)48小時(shí)培養(yǎng)，在培養(yǎng)基上成長(zhǎng)的菌落用印跡法檢測(cè)其在二種下述成分的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力培養(yǎng)基1(毫克/毫升)葡萄糖-20.0，Na2SO4-2，K2HPO4-10，NH4Cl-3.0，NH4NO3-1.0，MgSO4·7H2O-0.1，MnSO4·5H2O-1×10-4，F(xiàn)eSO4·7H2O-1×10-4，生物素5×10-5，氯化硫胺-1×10-4，瓊脂-20.0，pH7.4。培養(yǎng)基2的組成不同于培養(yǎng)基1是在于它含有100微克/毫升的L-丙氨酸。AA1黃色短桿菌和AA2黃色短桿菌突變體選自這樣的菌落，該菌落在30℃，經(jīng)過(guò)48小時(shí)培養(yǎng)不能在培養(yǎng)基1上生長(zhǎng)而能在培養(yǎng)基2上生長(zhǎng)。
本發(fā)明的生產(chǎn)L-丙氨酸的AA41戊二霉素棒狀桿菌菌株和AA11戊二霉素棒狀菌菌株具有以下的形態(tài)-培養(yǎng)特性和生理生化特征細(xì)胞是卵形的、短的，它不形成孢子，呈革蘭氏陽(yáng)性。在肉胨瓊脂上經(jīng)48小時(shí)培養(yǎng)后菌落是園形的，有光譯的，呈淡黃色，其邊緣是光滑的，直徑達(dá)2-3毫米。
兼性厭氧細(xì)菌，它不凝結(jié)牛奶，不稀釋明膠，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，吸收氨氮和尿素。適于在30-32℃和pH～7.2～7.8時(shí)生長(zhǎng)。
為了在最少培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，需要硫胺素。
AA5和AA6菌株按其本身的特征(除了對(duì)D，-L-α-氨基丁酸的穩(wěn)定性、對(duì)D-丙氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷性和生產(chǎn)L-丙氨酸能力以外)與其親本菌株ATCC14067黃色短桿菌菌株沒(méi)有不同。
本發(fā)明的生產(chǎn)L-丙氨酸的AA5黃色短桿菌菌株和AA6黃色短桿菌菌株具有以下培養(yǎng)-形態(tài)學(xué)特征。
形態(tài)學(xué)特征。
細(xì)菌是卵形的，稍扁長(zhǎng)，長(zhǎng)1.7～2.5微米，它是沒(méi)有孢子的、不活動(dòng)的、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
培養(yǎng)特征。
于30℃，在肉胨瓊脂上，在生長(zhǎng)第2晝夜形成2毫米直徑的園形、光滑、微黃色菌落。
在肉胨瓊脂上劃線(xiàn)。在第二晝夜生長(zhǎng)是中等的，邊緣是光滑的，表面是有光譯的，致密的，呈微黃奶油色。
注入肉胨瓊脂中生長(zhǎng)。在培養(yǎng)基表面基本上是中等。
有葡萄糖的格洛弗(Γловер)無(wú)機(jī)培養(yǎng)基。為了生長(zhǎng)必需生物素、硫胺素和D-丙氨酸。于30℃，在生長(zhǎng)的第2晝夜形成直徑為1毫米的菌落，呈亮奶油色。在第2晝夜的劃線(xiàn)生長(zhǎng)是中等的，致密的，呈亮淡奶油色。
在馬鈴薯上生長(zhǎng)并形成黃色色素。
不稀釋明膠。
與碳源的關(guān)系發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖、麥芽糖、較弱的半乳糖、鼠李糖、山梨糖、山梨醇、乙酸銨鹽或鈉鹽、乙醇，但不發(fā)酵乳糖。
與氮源的關(guān)系吸收硫酸銨和氯化銨、尿素。
適于在30～32℃和pH7.2～7.8生長(zhǎng)。
AA5黃色短桿菌菌株是按以下方法制備的。
將ATCC14067黃色短桿菌菌株在30℃、充氣條件下在肉胨液中培養(yǎng)，直到滴定度達(dá)109細(xì)胞/毫升。用離心法洗去細(xì)胞上的肉胨液并再懸浮于檸檬酸鹽緩沖液(pH5.5)中。在所得的懸浮液中加入N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍，直到其最終濃度為300微克/毫升，并在30℃，充氣條件下培養(yǎng)20分鐘。然后用冷卻的肉胨液洗去細(xì)胞上的誘變劑，轉(zhuǎn)入含有10毫升肉胨液的試管，在30℃培養(yǎng)18小時(shí)，然后接種在1號(hào)培養(yǎng)基表面上，1號(hào)培養(yǎng)基的組成(毫克/毫升)葡萄糖-20，Na2SO4-2，K2HPO4-1，NH4Cl-3，NH4NO3-1，MgSO4·7H2O-0.1，MnSO4·5H2O-1×10-4，F(xiàn)eSO4·7H2O-1×10-4，生物素-5×10-5，氯化硫胺-1×10-4，瓊脂-20，D，L-α-氨基丁酸-30，pH7.4。在30℃培養(yǎng)4～5晝夜，將在1號(hào)培養(yǎng)基上所成長(zhǎng)的菌落進(jìn)行純化并檢測(cè)其生長(zhǎng)丙氨酸的能力。將這樣選取的生成高產(chǎn)量D，L-丙氨酸的突變體之一重新用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍誘變，并選取為生長(zhǎng)需要D-丙氨酸的突變體。生產(chǎn)L-丙氨酸的AA5黃色短桿菌菌株是這樣選取的突變體之一。
AA6黃色短桿菌菌株是按以下方法制取的ATCC14067黃色短桿菌菌株用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍誘變并選取需要D-丙氨酸的突變體。將所得的為生長(zhǎng)需要D-丙氨酸的突變體再用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍誘變并選取對(duì)D，L-α-氨基丁酸穩(wěn)定的突變體，用類(lèi)似于上述制取AA5黃色短桿菌菌株的方法，不過(guò)，在1號(hào)培養(yǎng)基成分中要加入濃度為0.1毫克/毫升的D-丙氨酸。這樣選取的生產(chǎn)高產(chǎn)量L-丙氨酸突變體之一標(biāo)明為AA6黃色短桿菌菌株。
AA11戊二霉素棒狀桿菌菌株和AA41戊二霉素棒狀桿菌菌株是通過(guò)選育方法由ATCC13032戊二霉素棒狀桿菌菌株獲得的，該選育方法類(lèi)似于上述由ATCC14067黃色短桿菌菌株獲取AA1黃色短桿菌菌株和AA2黃色短桿菌菌株。
本發(fā)明的菌株與相應(yīng)的親本菌株ATCC14067黃色短桿菌菌株和ATCC13032戊二霉素棒狀桿菌菌株的區(qū)別特征列于下表。
為測(cè)定表中所列的菌株生長(zhǎng)時(shí)對(duì)D-丙氨酸的需要性，將這些菌株的懸浮體用環(huán)置在1號(hào)和2號(hào)培養(yǎng)基(這些培養(yǎng)基的成分已在上面說(shuō)明)的表面上，并在30℃時(shí)培養(yǎng)40小時(shí)。出現(xiàn)生長(zhǎng)以符號(hào)“+”表示，而沒(méi)有生長(zhǎng)則以符號(hào)“-”表示。
AA1，AA2，AA5，AA6，AA11，AA41菌株與其親本菌株ATCC14067和ATCC13032的不同點(diǎn)在于在1號(hào)培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)。
AA5和AA6菌株不同于表中所列的其它菌株，它能夠在類(lèi)似于2號(hào)培養(yǎng)基組成的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但與之不同的是在其組成中還含有30毫克/毫升D，L-α-氨基丁酸。
為了測(cè)定菌株對(duì)合成丙氨酸的D和L-立體異構(gòu)體的能力，將這些菌株懸浮體置入試管中，該試管含有5毫升下述組成的無(wú)菌培養(yǎng)基(克/升)葡萄糖-50.0，(NH4)2SO4-30.0，KH2PO4-30，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.0002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-30.0，要這樣考慮，使微生物濃度達(dá)到107細(xì)胞/毫升。試管在30℃，搖晃的條件下培養(yǎng)40小時(shí)。在所得培養(yǎng)液中用紙色譜法，茚三酮顯色或借助于氨基酸分析器測(cè)定D，L-丙氨酸含量(D型和L型丙氨酸的總含量)。D-丙氨酸含量是借助于D-氧化酶氨基酸在最終體積為0.4毫升的反應(yīng)混合物中發(fā)酵來(lái)測(cè)定的，該混合物含有由豬腎制得的8毫單位氧化酶D-氨基酸，0.2毫升含有D-丙氨酸0.1～5.0mM的試驗(yàn)溶液，33mM焦磷酸緩沖液，pH8.3。反應(yīng)在37℃進(jìn)行，直到達(dá)到平衡為止，在這時(shí)，93-95%D-丙氨酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸鹽。所生成的丙酮酸鹽用分光光度法在波長(zhǎng)440nm時(shí)測(cè)定。然后基于所測(cè)定的D，L-型丙氨酸總含量和D-丙氨酸含量計(jì)算在培養(yǎng)液中D-L-型丙氨酸的百分比。
所得數(shù)據(jù)列于上表。
從表中看出，AA1，AA2，AA5，AA6，AA11，AA41菌株不同于A(yíng)TCC14067和ATCC13032菌株是在于不能生產(chǎn)D-丙氨酸。
用于以后的發(fā)酵的生產(chǎn)菌株的接種材料可以用任何已知方法制備，例如，在培養(yǎng)基的表面上培養(yǎng)或在含有可消化的碳、氮源，無(wú)機(jī)鹽和保證微生物生長(zhǎng)的有機(jī)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
對(duì)有機(jī)物質(zhì)有維生素(生物素、硫胺素)，以及其他化合物，其中包括氨基酸，如果它們對(duì)具體生產(chǎn)的菌株的成長(zhǎng)是必要的。
為培養(yǎng)本發(fā)明所使用的微生物突變體，作為培養(yǎng)發(fā)酵介質(zhì)可以使用任何培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基含有可消化的碳、氮源，無(wú)機(jī)鹽，有機(jī)物質(zhì)，它們刺激微生物的生長(zhǎng)并積累L-丙氨酸。
作為可消化的碳源，可以使用以下碳源如蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露糖、淀粉、水解淀粉和糖蜜;多元醇，如丙三醇和山梨醇;有機(jī)酸，如蟻酸、乙酸、乳酸、富馬酸、馬來(lái)酸、丙酸;還有醇如甲醇和乙醇。上述碳源可以單獨(dú)使用，也可彼此以不同重量比相結(jié)合而使用。濾源物質(zhì)的總量在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)加入，或者分成若干份在發(fā)酵過(guò)程中加入。
作為可消化氮源可以使用有機(jī)物，也可以使用無(wú)機(jī)銨鹽，如硫酸銨、氯化銨、碳酸銨、乙酸銨、硝酸銨、磷酸銨、乳酸銨和氨;尿素;各種天然的含氮化合物，如胨、酵母水解物、肉的提取液和植物蛋白的水解物。
作為無(wú)機(jī)鹽可以使用磷酸鉀、磷酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、鐵、錳和鋅鹽、碳酸鈣。
作為上述微生物生長(zhǎng)所必需的有機(jī)物質(zhì)可以使用硫胺素、生物素或其代用物，如果因微生物生長(zhǎng)需要的話(huà)也可以用氨基酸。在培養(yǎng)基的其它成分的組成中，在有足量有機(jī)物質(zhì)存在的條件下，就沒(méi)有必要加入純態(tài)的有機(jī)物質(zhì)。
積聚L-丙氨酸是在充氣條件下，在20～37℃溫度和pH6.5～9.0培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的。
發(fā)酵開(kāi)始后經(jīng)過(guò)6～10小時(shí)，觀(guān)察到呈現(xiàn)L-丙氨酸?？墒窃谂囵B(yǎng)液中達(dá)到最大程度的積聚L-丙氨酸是完全消耗碳源和能量的結(jié)果(經(jīng)過(guò)32小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，這決定于所使用的碳源濃度和能量)。
在培養(yǎng)液中L-丙氨酸的含量用紙色譜法和茚三酮顯色方法或用氨基酸分析器進(jìn)行測(cè)定。
積聚的L-丙氨酸可以使用任何已知方法由培養(yǎng)液中分離出來(lái)，例如，使用離心法或過(guò)濾除去微生物和其它不溶微粒，在離子交換柱上吸附L-丙氨酸，接著洗脫、濃縮并結(jié)晶L-丙氨酸。
實(shí)施例1AA2黃色短桿菌菌株的接種物是通過(guò)將微生物在試管中的斜面肉胨液表面上培養(yǎng)而制備的，該肉胨液含有15克/升瓊脂和100毫升/升D-丙氨酸，在30℃培養(yǎng)22小時(shí)，接著用無(wú)菌生理溶液洗去微生物(在所得懸浮液中微生物濃度為109細(xì)胞/毫升)。
在250毫升體積的發(fā)酵瓶中無(wú)菌操作，按10毫升注入滅過(guò)菌的發(fā)酵介質(zhì);其成分如下(克/升)糖蜜-200.0(按蔗糖計(jì)算-100)，酵母生物量水解物-120.0，CaCO3-30.0，pH7.5。
在發(fā)酵瓶中，按0.5微升加入AA2黃色短桿菌菌株的接種物，并在30℃，搖晃條件下(70轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)72小時(shí)。在完成發(fā)酵后所得的培養(yǎng)液中L-丙氨酸的含量為5.1克/升。將250毫升所得的含有5.1克L-丙氨酸的AA2黃色短桿菌菌株的培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離(5000轉(zhuǎn)/分，20分鐘)以除去細(xì)菌和其它不溶解的微粒。所得上清液以從上到下的流動(dòng)方向流經(jīng)裝有NH+4型離子交換樹(shù)脂的柱子，其流速為每小時(shí)按樹(shù)脂體積計(jì)為0.6～0.7體積的溶液。柱子用水洗滌并用3.5%的氨水溶液洗脫吸附的L-丙氨酸。將所得洗脫液真空濃縮并在14～16℃下將L-丙氨酸結(jié)晶四小時(shí)。通過(guò)濾紙由溶液中過(guò)濾分離晶體并真空干燥。不計(jì)算其在母液中的含量，L-丙氨酸的產(chǎn)量為3.3克，為培養(yǎng)液中含量的總量的65%。
根據(jù)紙色譜數(shù)據(jù)，產(chǎn)品的純度為77.4%。
實(shí)施例2AA1黃色短桿菌菌株的接種物是在例1所述的類(lèi)似條件下制備的。
在250毫升體積的發(fā)酵瓶中無(wú)菌操作，按10毫升注入無(wú)菌發(fā)酵介質(zhì)，其組成如下(克/升)糖蜜-200.0(按蔗糖計(jì)算-100);酵母生物量水解物-120。0;CaCO3-30.0，pH7.5。
在發(fā)酵瓶中按0.5毫升加入AA1黃色短桿菌株的接種物，該菌株是在例1所述的類(lèi)似條件下制得的。發(fā)酵瓶在30℃，搖晃條件(70轉(zhuǎn)/分)下培養(yǎng)72小時(shí)。完成發(fā)酵后，所得培養(yǎng)液中L-丙氨酸的含量為6.9克/升。
實(shí)施例3在250毫升體積的發(fā)酵瓶中無(wú)菌操作，按10毫升注入滅過(guò)菌的以下組成的發(fā)酵介質(zhì)(克/升)糖蜜-200。0(按蔗糖計(jì)算-100);酵母生物量水解物-120.0;CaCO3-30.0，pH7.5。
在發(fā)酵瓶中按0.5毫升加入AA11戊二霉素棒狀桿菌菌株接種物，該菌株是在例1所述的類(lèi)似條件下制取的。發(fā)酵瓶在30℃，搖晃條件(70轉(zhuǎn)/分)下培養(yǎng)72小時(shí)，完成發(fā)酵后所得的培養(yǎng)液中的L-丙氨酸含量為3.8克/升。
實(shí)施例4在250毫升體積的發(fā)酵瓶中無(wú)菌操作，按10毫升加入滅過(guò)菌的以下組成的發(fā)酵介質(zhì)(克/升)糖蜜-200.0(按蔗糖計(jì)算-100)，酵母生物量水解物-120.0，CaCO3-30.0，pH7.5。
在發(fā)酵瓶中按0.5毫升加入AA41戊二霉素棒狀桿菌菌株接種物，該菌株是在例1所述的類(lèi)似條件下制取的。發(fā)酵瓶在30℃，搖晃條件(70轉(zhuǎn)/分)下培養(yǎng)72小時(shí)。完成發(fā)酵后所得培養(yǎng)液中的L-丙氨酸含量為6.4克/升。
實(shí)施例5發(fā)酵操作是在例1所述的類(lèi)似條件下進(jìn)行的，作為生產(chǎn)L-丙氨酸的菌株使用AA1黃色短桿菌菌株，但使用以下組成的培養(yǎng)發(fā)酵介質(zhì)(克/升)蔗糖-100.0，(NH4)2SO4-55.0，KH2PO4-3.0，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.0002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-50.0，pH7.5。
培養(yǎng)72小時(shí)后，在培養(yǎng)液中的L-丙氨酸含量為17.6克/升。
實(shí)施例6發(fā)酵操作是在例1所述的類(lèi)似條件下進(jìn)行的，可是作為生產(chǎn)L-丙氨酸的菌株使用AA2黃色短桿菌菌株并使用以下組成的發(fā)酵介質(zhì)(克/升)蔗糖-100.0，(NH4)2SO4-55.0，KH2PO4-3.0，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.0002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-50.0，pH7.5。
培養(yǎng)72小時(shí)后，在培養(yǎng)液中的L-丙氨酸含量為20.4克/升。
實(shí)施例7發(fā)酵操作是在例1所述的類(lèi)似條件下進(jìn)行的，可是作為生產(chǎn)L-丙氨酸的菌株使用AA11戊二霉素棒狀桿菌菌株并使用以下組成的發(fā)酵介質(zhì)(克/升)蔗糖-100.0，(NH4)2SO4-55.0，KH2PO4-3.0，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.0002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-50.0，pH7.5。
培養(yǎng)72小時(shí)后，在培養(yǎng)液中的L-丙氨酸含量為2.6克/升。
實(shí)施例8發(fā)酵操作是在例1所述的類(lèi)似條件下進(jìn)行的，可是作為生產(chǎn)L-丙氨酸的菌株使用AA41戊二霉素棒狀桿菌菌株，并使用以下組成的發(fā)酵介質(zhì)(克/升)蔗糖-100.0，(NH4)2SO4-55.0，KH2PO4-3.0，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.00002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-50.0，PH7.5。
培養(yǎng)72小時(shí)后，在培養(yǎng)液中的L-丙氨酸含量為5.1克/升。
實(shí)施例9
發(fā)酵操作是在例5所述的類(lèi)似條件下進(jìn)行的，在發(fā)酶瓶中加入作為生產(chǎn)L-丙氨酸菌株的AA5黃色短桿菌菌株。發(fā)酵介質(zhì)具有以下組成(克/升)蔗糖-120.0，(NH4)2SO4-55。0，KH2PO4-3.0，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.0002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-50.0，pH7.5。
發(fā)酵瓶在30℃，搖晃條件下培養(yǎng)72小時(shí)。發(fā)酵完成后所得培養(yǎng)液中的L-丙氨酸含量為32.9克/升。
實(shí)施例10發(fā)酵操作是在例5所述的類(lèi)似條件下進(jìn)行的，在發(fā)酵瓶中加入作為生產(chǎn)L-丙氨酸菌株的AA6黃色短桿菌菌株。
發(fā)酵介質(zhì)具有以下組成(克/升);蔗糖-120.0;(NH4)2SO4-55.0;KH2PO4-3.0;MgSO4·7H2O-1.0;D-丙氨酸-0.1;FeSO4·7H2O-0.01;MnSO4·5H2O-0.01;生物素-0.0002;溴化硫胺-0.00005;CaCO3-50.0;pH7.5。發(fā)酵瓶在30℃，搖晃條件下培養(yǎng)72小時(shí)。發(fā)酵完成后，所得培養(yǎng)液中的L-丙氨酸含量為31.4克/升。
實(shí)施例11發(fā)酵操作是在例5所述的類(lèi)似條件下進(jìn)行的，在發(fā)酵瓶中加入作為生產(chǎn)L-丙氨酸菌株的AA6黃色短桿菌菌株。
發(fā)酵介質(zhì)具有以下組成(克/升)蔗糖-120.0，(NH4)2SO4-55.0，KH2PO4-3.0，MgSO4·7H2O-1.0，D-丙氨酸-0.1，F(xiàn)eSO4·7H2O-0.01，MnSO4·5H2O-0.01，生物素-0.0002，溴化硫胺-0.00005，CaCO3-50.0，pH7.5。
發(fā)酵瓶在30℃，搖晃條件下培養(yǎng)72小時(shí)。在發(fā)酵完成后所得培養(yǎng)液中的L-丙氨酸含量為20.6克/升。
實(shí)施例12發(fā)酵操作是在例5所述類(lèi)似條件下進(jìn)行的?？墒窃诎l(fā)酵瓶中按0.5毫升加入AA5黃色短桿菌菌株的接種物，該接種物是懸浮液，它是從一晝夜瓊脂化的肉胨液斜面上沖洗而得的(微生物濃度為109細(xì)胞/毫升)。發(fā)酵介質(zhì)具有以下組成(克/升)蔗糖-150。0;(NH4)2SO4-55.0;KH2PO4-3.0;MgSO4·7H2O-1.0;D-丙氨酸-0.1;FeSO4·7H2O-0.01;MnSO4·5H2O-0.01;生物素-0.0002;溴化硫胺-0.00005;CaCO3-50.0，PH7.5。
發(fā)酵瓶在30℃，搖晃條件下培養(yǎng)96小時(shí)。發(fā)酵完成后，所得培養(yǎng)液中的L-丙氨酸含量為43.8克/升。
由250毫升AA5黃色短桿菌菌株培養(yǎng)液中純化L-丙氨酸(L-丙氨酸總含量為11克)是在例1所述的類(lèi)似條件下進(jìn)行的。L-丙氨酸的產(chǎn)量在不計(jì)算其在母液中的含量時(shí)為7.3克，是在培養(yǎng)液中的含量的總量的67%。產(chǎn)品的純度按紙色譜法為91.3%。
實(shí)施例13發(fā)酵操作是在例5所述類(lèi)似的條件下進(jìn)行的。
但是在發(fā)酵瓶中按0.5毫升加入AA6黃色短桿菌菌株的接種物，該接種物是懸浮液，它是從一晝夜瓊脂化肉胨液斜面上沖洗而得的(微生物濃度為109細(xì)胞/毫升)。發(fā)酵介質(zhì)具有以下組成(克/升)蔗糖-150.0;(NH4)2SO4-55.0;KH2PO4-3.0;MgSO4·7H2O-1.0;D-丙氨酸-0.1;FeSO4·7H2O-0.01;MnSO4·5H2O-0.01;生物素-0.0002;溴化硫胺-0.00005;CaCO3-50.0，pH7.5。
發(fā)酵瓶在30℃，搖晃條件下培養(yǎng)36小時(shí)。發(fā)酵完成后所得培養(yǎng)液中的L-丙氨酸含量為42.3克/升。
實(shí)施例14發(fā)酵操作是在例5所述類(lèi)似的條件下進(jìn)行的。
但是在發(fā)酵瓶中按0.5毫升加入AA1黃色短桿菌菌株的接種物，該接種物是懸浮液，它是從一晝夜瓊脂化的肉胨液斜面上沖洗而得的(微生物濃度為109細(xì)胞/毫升)。發(fā)酵介質(zhì)具有以下組成(克/升)蔗糖-150.0;(NH4)2SO4-55.0;KH2PO4-3.0;MgSO4·7H2O-1.0;D-丙氨酸-0.1;FeSO4·7H2O-0.01;MnSO4·5H2O-0.01;生物堿-0.0002;溴化硫胺-0.00005;CaCO3-50.0;pH7.5。
發(fā)酵瓶在30℃，搖晃條件下培養(yǎng)96小時(shí)。發(fā)酵完全后所得培養(yǎng)液中的L-丙氨酸含量為28.1克/升。
權(quán)利要求
1.通過(guò)在含有碳、氮源，無(wú)機(jī)鹽和微生物生長(zhǎng)刺激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)短桿菌和棒狀桿菌屬的微生物，直到在培養(yǎng)液中積累L-丙氨酸，接著分離目的產(chǎn)物制取L-丙氨酸的方法，其特征在于作為微生物使用為生長(zhǎng)需要D-丙氨酸的短桿菌和棒狀桿菌屬的微生物突變體。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于使用寄存在全蘇遺傳和選育工業(yè)微生物科學(xué)研究所(VNIIGenetika)URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1號(hào)的黃色短桿菌種微生物突變體AA1黃色短桿菌菌株，1984年4月5日登記，其登記號(hào)為B-3061;AA2黃色短桿菌菌株，1984年4月5日登記，其登記號(hào)為B-3062。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于使用對(duì)D，L，α-氨基丁酸穩(wěn)定的短桿菌屬微生物突變體。
4.按照權(quán)利要求1，3的方法，其特征在于使用寄存在全蘇遺傳和選育工業(yè)微生物科學(xué)研究所(VNIIGenetika)URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1號(hào)的黃色短桿菌種的微生物的突變體AA5黃色短桿菌菌株，1987年4月1日登記，其登記號(hào)為B-3991;AA6黃色短桿菌菌株，1987年4月1日登記，其登記號(hào)為B-3992。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于使用寄存在全蘇遺傳和選育工業(yè)微生物科學(xué)研究所(VNIIGenetika)URSS，113545，莫斯科，Dorozhny街1號(hào)的戊二霉素棒狀桿菌種的微生物的突變體AA41戊二霉素棒狀桿菌菌株，1985年3月25日登記，其登記號(hào)為B-3321;AA11戊二霉素棒狀桿菌菌株，1985年3月25日登記，其登記號(hào)為B-3323。
6.生物學(xué)純的微生物培養(yǎng)物，具有以下任何一種生產(chǎn)L-丙氨酸菌株的特征和標(biāo)志AA1黃色短桿菌;AA2黃色短桿菌;AA5黃色短桿菌;AA6黃色短桿菌;AA41戊二霉素棒狀桿菌;AA11戊二霉素棒狀桿菌。
全文摘要
L-丙氨酸的制取方法，包括在含有可消化的碳、氮源，無(wú)機(jī)鹽和微生物生長(zhǎng)刺激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)為生長(zhǎng)需要D-丙氨酸的短桿菌或棒狀桿菌屬的微生物突變體，直到在培養(yǎng)液中積累L-丙氨酸，接著分離目的產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12P13/06GK1038669SQ8910350
公開(kāi)日1990年1月10日 申請(qǐng)日期1989年4月19日 優(yōu)先權(quán)日1988年4月26日
發(fā)明者埃斯米克·格沃考夫那·阿日簡(jiǎn), 阿特·阿爾伯托維奇·阿姆巴察綿, 沙瓦施·米基洛維奇·考查林, 瑪里查·埃那里考夫那·埃那里金 申請(qǐng)人:亞美尼亞生物工藝科學(xué)制造聯(lián)合公司氨基酸科學(xué)技術(shù)研究所