專利名稱：降鈣素原多肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及刺激成骨細胞和前成骨細胞增生的多肽、該多肽的制造方法、含有該多肽的治療組合物以及促進哺乳動物骨生長的方法。
骨的生長、保養(yǎng)和修復涉及骨的生成和消溶速率之間的平衡。這兩種過程(統(tǒng)稱為“再造”)通過一些激素和生長因子進行調節(jié)，這些激素和生長因子包括甲狀旁腺素、降鈣素、胰島素、促生長因子、甲狀腺素、糖皮質激素、維生素D、雄激素、雌激素、表皮生長因子、轉化生長因子β、成纖維細胞生長因子和血小板衍生的生長因子。這些化學信使影響成骨細胞和前成骨細胞(骨生成細胞)以及破骨細胞(骨消溶細胞)的發(fā)育和活性。骨的再造與骨骼起一種礦質庫的作用有關，并與其保持細胞活力、流體交換和骨的強度所起的作用有關。骨代謝的不平衡會導致骨質疏松癥和其他疾病。Raisz和Kream(NewEngl.J.Med.30929-35，83-89，1983)及Raisz(NewEngl.J.Med.318818-827，1988)對骨的再造過程作了評論。
雖然健康人通常無需借助藥物就能使骨生長和使骨折愈合，但在某些情況下，骨頭會變弱或不能完全愈合。例如，老年人和經受皮質類固醇治療的病人(如移植病人和那些正進行慢性肺病治療的人)骨折愈合均很慢。而且，骨質疏松癥患者往往因骨代謝的不平衡而導致骨折和殘廢。
通常用雌激素、降鈣素、鈣、氟化鈉、磷酸氫鹽或它們的混合物治療骨質疏松癥。這些治療方法不能根除病因，而且療效有限。用雌激素治療會使子宮內膜癌的危險率增加。雌激素的使用是受限制的，因為只有一小部分55歲以下的婦女會發(fā)生反應，對年齡更大的人來說，骨頭沒有對雌激素的反應性。氟化鈉的用法正在研究中，但還未被認可。而且，在氟化物刺激下生成的骨可能是畸形的。此外，施用氟化物會產生很大的毒性。單獨施用鈣是無效的，除非飲食中明顯缺鈣。即使在缺鈣的情況下，用鈣治療的好處也只限于缺少補充維生素D的情況。用降鈣素治療似乎會減少骨的消溶，但骨質的任何增加都可能是暫時的。降鈣素最后失效被認為是由成骨細胞活性減少而導致的，后者則是骨生成和消溶相偶聯(lián)的結果。這不能證明降鈣素能減少骨質疏松癥患者發(fā)生骨折的頻率。多種副作用，包括腸胃不適和鼻子出血可限制降鈣素的使用。最后，用促生長因子(類腺島素生長因子)治療骨質缺乏癥可能會發(fā)生并發(fā)癥和副作用，因為這些生長因子對軟組織細胞會發(fā)生作用。
技術上仍需要能促進骨生成和/或逆轉骨損傷的物質。本發(fā)明提供的多肽具有這種活性，還具有其他有關的優(yōu)點。
簡單地說，本發(fā)明公開了已分離的多肽和編碼能刺激成骨細胞和前成骨細胞增生的多肽的DNA順序。該多肽一般具有如下特征，(a)它們的長度至少為12個氨基酸;(b)它們至少與大鼠N-降鈣素原(N-proCT)的一部分基本同源;以及(c)在最能刺激成骨細胞和前成骨細胞的濃度下，與成纖維細胞相比，它們可使成骨細胞和前成骨細胞中DNA合成至少增加兩倍。一方面，本發(fā)明的肽具有的氨基酸順序選自由下列構成的一組大鼠、人、雞和鮭魚N-proCT以及與大鼠、人和雞N-降鈣素原基因相關的肽(N-proCGRP)順序，如

圖1所示。為方便和清楚起見，本發(fā)明的多肽一般根據(jù)與大鼠N-proCT的同源性定義。但應該明白，本發(fā)明還包括由其他物種衍生的多肽以及這些多肽的衍生物。第二方面，本發(fā)明肽具有的氨基酸順序選自由下列構成的一組(a)VPLRSTLESSPG;(b)APFRSALESSPA;(c)APVRPGLESITD;和(d)APARTGLESMTD。第三方面，本發(fā)明肽的長度小于32個氨基酸。
第四方面，本發(fā)明公開了刺激成骨細胞和前成骨細胞分裂的肽的分離方法。該方法一般包括(a)制備能表達降鈣素或降鈣素相關基因的細胞的含水提取物;(b)分離該含水提取物以富集分子量約小于15000的多肽;和(c)用疏水層析和/或陰離子交換層析分離已富集的組分，以從富集組分中分離肽。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方案中，分離含水提取物的步驟包括使含水提取物進行反相HPLC和凝膠過濾。本領域的普通技術人員應當明白，改變各步驟的順序基本上不會影響所需要的結果。
本發(fā)明還公開了用一種表達載體轉染或轉化的宿主細胞，該表達載體含有以可操作的方式連接于編碼上述肽的DNA順序的轉錄啟動子。上述的合適宿主細胞包括酵母宿主細胞。
第五方面，本發(fā)明公開了刺激成骨細胞和前成骨細胞分裂的肽的制造方法。該方法一般包括(a)將一個表達載體導入宿主細胞中，該表達載體含有以可操作方式連接編碼具有上述特征的肽的DNA順序的轉錄啟動子;(b)在合適的條件下培養(yǎng)該宿主細胞;和(c)從該宿主細胞中分離肽。
第六方面，本發(fā)明提供的治療組合物含有上述的一種肽和與肽混合的生理上可接受的載體或稀釋劑。該治療組合物可用來促進病人的骨生成。在該方法中，可將該組合物從鼻內加入或注射。在一種具體方案中，組合物可進一步包含有效量的一種物質，加雌激素、氟化鈉、降鈣素或磷酸氫鹽。在另一具體方案中，組合物還可包含一種生長因子，如胰島素、一種類胰島素生長因子、血小板衍生的生長因子、轉化生長因子α、轉化生長因子β或表皮生長因子，它們的用量足以進一步增加成骨細胞和前成骨細胞中的DNA合成。
參看下面的詳細說明和附圖將對本發(fā)明的上述及其他方面一目了然。
圖1說明刺激成骨細胞和前成骨細胞生長的典型多肽的氨基酸順序。方框表示相同的氨基酸順序。星號表示為使同源性達到最大而引入的空隙。數(shù)字表示大鼠的順序。除非另有表示，N-proCGRP順序相應于不同的N-proCT順序。還沒有鮭魚降鈣素基因相關肽(CGRP)順序的報道。用標準的單字母符號命名氨基酸。
圖2表示用針對大鼠N-proCT最后6個殘基(NCAP)的抗血清，對系列稀釋的合成多肽和甲狀腺細胞提取物(Ext)進行免疫測定的結果。
圖3表示用針對大鼠降鈣素原前面12個氨基酸殘基(NTP)的抗血清，對系列稀釋的肽和大鼠腫瘤細胞(樣品)進行免疫測定的結果。倒三角形表示降鈣素、C-proCT、NCAP、CGRP和生長激素抑制素。
圖4表示從甲狀腺腫瘤細胞提取物中分離多肽的反相高效液相層析分離圖。使用A300A/辛基反相HPLC柱;收集1ml的組分，干燥后檢測免疫反應性NCAP(圓圈)和免疫反應性NTP(方塊)。虛線表示乙腈梯度。
圖5表示由大鼠髓甲狀腺癌(MTC)中得到的部分純化的N-proCT的凝膠過濾結果。箭頭表示分子量標記。N-proCT為7.4KDa峰，該峰同時具有NTP(方塊)和NCAP(圓圈)免疫活性。
圖6表示典型的降鈣素衍生肽對于雞成骨細胞和前成骨細胞的促有絲分裂作用。圓圈表示合成的NTP-Tyr〔proCT(1-12)-Tyr〕;倒三角形表示合成的降鈣素。
圖7表示部分純化的大鼠N-proCT對雞(A)和大鼠(B)成骨細胞和前成骨細胞的促有絲分裂作用。
圖8表示用部分純化的N-proCT和降鈣素對大鼠皮膚細胞和雞骨細胞的促有絲分裂作用的檢測結果。
圖9表示純化的合成人N-proCT對培養(yǎng)的雞成骨細胞和前成骨細胞的促有絲分裂作用。
圖10表示合成的人N-proCT對于從骨關節(jié)炎患者制得的人成骨細胞(a)和人骨肉瘤細胞(b)的促有絲分裂作用。
圖11表示由含有酵母優(yōu)選密碼的寡核苷酸構成的大鼠N-proCT的編碼順序。
圖12為大鼠N-proCT編碼順序的裝配圖。
圖13表示N-proCT的酵母表達載體的構建。
圖14表示質粒PCPOT和PDPOT。
圖15表示用于生產降鈣素原衍生的多肽的幾種酵母表達載體。
圖16表示用重組N-proCT檢測對于雞骨細胞致有絲分裂作用的結果。對于每一個試驗條件，結果表達為平均±標準誤差(n＝4-6)。
圖17表示啤酒酵母TPI1啟動子的亞克隆。
圖18表示質粒PMVR1的構建。
圖19表示MATa2操縱基因順序被插入TPI1啟動子中。
圖20表示質粒PSXR109、PSXR110、PSXR111和PSXR112的構建。
圖21表示用N-proCT處理的小鼠和未經處理的對照小鼠骨生長比較試驗的結果。
本發(fā)明提供的各種多肽特別可刺激成骨細胞和前成骨細胞的增生，因此可用于促進哺乳動物骨的生長。按本發(fā)明的優(yōu)選方案，這些多肽可從降鈣素原或proCGRP的氨端區(qū)域衍生。它們可被重新合成，從天然產生它們的合適細胞或組織中分離，或通過DNA重組技術制成。
降鈣素是一種由甲狀腺的C細胞生成的32-殘基的肽激素，也由某種甲狀腺腫瘤大量生成。該激素可抑制成骨細胞的活性，并通過這種機制減少血中的鈣含量。降鈣素是根據(jù)高鈣量和其他營養(yǎng)信號而分泌的。用高脂肪食物喂養(yǎng)的大鼠產生的降鈣素增加，表明它能參與脂肪代謝。注射大劑量的降鈣素可抑制食欲，還具有止痛作用。
與生物合成其他小肽激素的情況一樣，降鈣素是由一種大激素原產生的(Roos等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.601134-1140，1974)。降鈣素原首先是在大鼠中進行特征鑒定的(Jacobs等人，Science213457-459，1981，Amara等人，J.Biol.Chem.2572129-2132，1982);現(xiàn)在已知道大鼠順序結構上與人和小雞前體的順序相似(Gkonos等人，J.Biol.Chem.26114386-14391，1986;Lasmoles等人，EMBOJ.102603-2607，1985)。大鼠降鈣素原有111個殘基(Birnbaum等人，J.Biol.Chem.2592870-2874，1984);降鈣素順序(proCT60-91)居于前體內，通過鄰接的多元裂解位點與氨基及羧基端分開。為研究降鈣素生物合成和分泌而發(fā)展的富含降鈣素的細胞系，證實了產生降鈣素和C端16肽(C-proCT)是加工降鈣素原的一種主要途徑(Birnbaum等人，J.Biol.Chem.261699-703，1986;Birnbaum等人，J.Biol.Chem.257241-244，1982;Muszynski等人，J.Biol.Chem.25811678-11683，1983)。
降鈣素基因表達的研究(Amara等人，Nature298240-244，1982)表明該基因編碼兩個不同的分泌多肽。第二個稱為“降鈣素基因相關肽”或“CGRP”，它是由不同的RNA拼接產生的。成熟的CGRP由37個氨基酸組成。生成多肽的前體(降鈣素原和proCGRP)其前面51個氨基酸殘基是相同的。與降鈣素一樣，CGRP是通過多元裂解位點與它的氨基和羧基端鄰接順序分開。CGRP(至少在高劑量時)也能降低血鈣和抑制骨的消溶。降鈣素和CGRP有各自的細胞受體，但它們均能與另一者的受體相結合(Roos等人，Endocrinology11846-51，1986)。已提出用CGRP和CGRP的類似物降低血壓和減少胃酸分泌(Evans等人，US4530838和US4549986)。
直接或間接的證據(jù)表明，至少存在有另外三種降鈣素相關的人基因或假基因。Fischer等人(J.Clin.Endocrinol.Metab.571314-1316，1983)鑒定了人體甲狀腺和大腦中具免疫活性的類鮭魚降鈣素物質。Steenbergh等人(A.Pecile編，Calcitonin1984，Elsevier，1985，P.23)提出存在人降鈣素假基因。Steenbergh等人(FEBSLett.20997，1986)分離并表征了人CGRP-Ⅱ的一種基因，看來它不能進行另一種表達以產生一種類降鈣素肽。現(xiàn)在還有跡象表明存在第三種人降鈣素相關基因(ThesisofJ.W.M.Hoppener，UniversityofUtrecht，“人降鈣素/CGRP基因”，1988年4月12日)。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過降鈣素原和proCGRP的加工產生穩(wěn)定的N端多肽(分別稱為N-proCT和N-proCGRP)，該多肽長度約為52-57個氨基酸，這取決于前體蛋白質。當進行標準的致有絲分裂作用測定時，發(fā)現(xiàn)這些多肽對成骨細胞和前成骨細胞具有特異的細胞增生活性。而且，發(fā)現(xiàn)由一個物種產生的多肽對另一物種的成骨細胞和前成骨細胞具有特異的細胞增生活性。
如上所述，已分離和表征了許多物種的降鈣素和CGRP，這些物種包括人、大鼠和小雞，以及鮭魚降鈣素。還研究了編碼這些多肽的基因和cDNA順序。這些研究表明降鈣素和CGRP是由相同基因編碼的，而且是由不同的RNA拼接產生的。而且，還在人體中鑒定了已知只在腫瘤中表達的一種降鈣素假基因和一種類鮭魚降鈣素肽。本發(fā)明的多肽可相應于由這些降鈣素基因產物的任一前體衍生的氨基酸順序。典型的多肽包括人、雞、大鼠和鮭魚N-proCT(54或57個氨基酸)以及人、雞和大鼠N-proCGRP(52或55個氨基酸)，其順序如圖1所示。本發(fā)明的多肽還包括降鈣素原和proCGRP的氨基端部分的片段。例如，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)來自降鈣素原氨端的12氨基酸片段對成骨細胞和前成骨細胞具有意想不到的特異的促細胞分裂活性。本發(fā)明包括這種12氨基酸片段和具有此12殘基氨端順序的較大的降鈣素原衍生多肽。該多肽最好包括31氨基酸多肽，它來自人、雞、大鼠和鮭魚N-proCT以及人、雞和大鼠N-proCGRP的氨基端。用蛋白水解酶或溴化氰(CNBr)分裂N-proCT或N-proCGRP可產生另外的生物活性多肽。例如，CNBr分解人的N-proCT可產生36和21氨基酸的多肽。本領域的普通技術人員應該知道，氨基酸順序的小變化不會改變這些多肽的實用性質。這種變化包括氨基酸的取代和缺失，可以由遺傳性多態(tài)現(xiàn)象或物種多樣性而產生，或通過遺傳工程引入該多肽中。當引入變化時，一般最好保留如圖1所示的具有高度種間同源性的那些順序，并避免該多肽的化學性質(如電荷、疏水性等)產生較大的變化。如上所述，本發(fā)明的多肽一般根據(jù)大鼠N-proCT而定義。一般來說，本發(fā)明的多肽與大鼠N-proCT的一部分基本上同源，一般至少約有40%同源性，這反映了圖1所示的種間同源性程度。該多肽最好與人N-proCT的一部分基本同源，后者與大鼠N-proCT約有60%的同源性。關于這一點，該多肽最好與大鼠N-proCT氨端最多32個氨基酸中的至少一部分，即大約10個鄰接氨基酸基本上同源。
本發(fā)明的多肽可從天然產生它們的組織或培養(yǎng)細胞中分離，也可用普通的化學方法合成，或通過DNA重組技術產生。
已知能產生可回收量降鈣素、CGRP或相關基因產物的細胞和組織可用作多肽源。合適的細胞包括正常和贅生性C細胞和腦細胞。一種最好的贅生性C細胞源是1-2-4髓甲狀腺癌，已由Roos等人(Endocrinology10526-32，1979)所公開。用一種含水緩沖劑從細胞或組織中提取多肽。最好使組織絞碎，并用濃度約為1-2N的一種有機酸熱溶液提取多肽。提取溫度最好至少為70℃，沸騰溫度更好。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，將組織糜加入約10-20倍體積的1.5N乙酸中，并煮沸20-30分鐘。然后冷卻所得到的勻漿，從含水提取物中分離不溶解的物質和脂質，最好用離心法分離。然后最好以二步法根據(jù)大小分離含水提取液，即分批式反相層析和凝膠過濾法。優(yōu)選的層析基質為C-18二氧化硅。然后用一種合適的有機溶劑從基質中洗脫多肽。一般在VydacC-18、寬口、30微米二氧化硅的5克柱中進行分離，該二氧化硅已用90%乙腈/0.1%三氟乙酸(TFA)活化，并用0.1%TFA的溶液平衡。樣品上柱后，先用25ml0.1%TFA，再用50ml20%乙腈/0.1%TFA洗滌柱子。用45%-90%乙腈/0.1%TFA洗脫N-proCT。然后使部分純化的肽干燥，并溶于6M胍中，用凝膠過濾法進一步純化。一種優(yōu)選的凝膠過濾基質是SephadexG-50(Pharmacia，Piscataway，NJ)。用培養(yǎng)的骨細胞通過免疫測定和/或活性試驗測定含有本發(fā)明多肽的組分。凝膠過濾峰再用疏水色譜，如反相高效液相色譜分離。關于這一點，特別優(yōu)選的色譜基質是C-8二氧化硅，10微米反相樹脂(Whatman)。從C-8二氧化硅中以37%乙腈洗脫N-proCT，而且能夠通過35%-40%乙腈/0.1%TFA的梯度流洗80分鐘，以將其從其他蛋白質中分離。最好通過免疫測定檢測峰組分。若需要的話，再用常規(guī)方法，如陰離子交換層析、高效液相層析和免疫親和層析作進一步純化?；蛘呦扔妹庖哂H和層析再用高效液相層析純化該多肽。
可用常規(guī)的化學方法合成短于大約20-32個氨基酸的多肽。已公開的肽合成方法有例如，Merrifield(J.Am.Chem.Soc.852149-2154，1963)和Houghten(Proc.Natl.Acad.Sci.USA825131-5135，1985)。也可從各種市售來源得到多肽，這些市售來源包括PeninsulaLaboratories(Belmont，Calif)，BachemBioscience，Inc.(Philadelphia，Pa.)，Biosearch，Inc.(SanRafael，Calif.)及AppliedBiosystems(FosterCity，Calif.)。
最好用遺傳工程細胞制備本發(fā)明的多肽。在細菌、真菌細胞和培養(yǎng)的高等真核細胞中生產重組蛋白質和多肽的方法為已有技術。簡單地說，將編碼所研究的肽的DNA順序與合適的轉錄啟動子相連接，并與其他成分(轉錄終止子、多聚腺苷酸信號、增強子、選擇標記等)一道插入載體中，并根據(jù)所選用的宿主細胞類型進行選擇。合適成分的選擇、表達載體的構建以及宿主細胞的轉化或轉染均為普通技術人員所公知。
編碼本發(fā)明多肽的DNA順序最好是合成的。使用合成的寡核苷酸時，可根據(jù)宿主細胞的偏愛選擇密碼子。合成DNA的方法已被如Caruthers等人(US4458066)和Itakura等人(Science1981056-1063，1977)公開，但一般最好是自動合成。一般說來，制備長約50-60堿基的寡核苷酸是方便的。設計寡核苷酸對時，應使得退炎后產生重迭的互補末端，這樣則有利于較長順序的裝配。然后連接重迭片段以產生較長的順序。
合適的DNA順序也可通過編碼降鈣素或CGRP前體的cDNA或基因組克隆的酶促消化而獲得。該克隆已被Amara等人(Nature 298240-244，1982)、Amara等人(J.Biol.Chem.2572129-2132，1982)和Birnbaum等人(J.Biol.Chem.2585463-5466，1983)所公開。
用于進行本發(fā)明的原核宿主細胞最好是大腸桿菌的菌株，但也能用芽孢桿菌(Bacillus)和其他屬的菌株。轉化這些宿主和表達克隆于其中的外源DNA順序的方法是現(xiàn)有技術(參見如Maniatis等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，冷泉港實驗室，1982)。用于在細菌宿主中表達克隆的DNA順序的載體一般含有一種選擇標記，如一種抗菌素抗性的基因，以及能在該宿主細胞中起作用的啟動子。合適的啟動子包括trp(Nichols和Yanofsky，Meth.Enzymol.101155-164，1983)、lac(Casadaban等人，J.Bacteriol.143971-980，1980)和入噬菌體(Queen，J.Mol.Appl.Genet.21-10，1983)啟動子體系?？捎糜谵D化細菌的質粒包括PBR322(Bolivar等人，Gene295-113，1977)、PUC質粒(Messing，Meth、Enzymol.10120-78，1983;Vieira和Messing，Gene 19259-268，1982)、PCQV2(Queen，同上)及其衍生物。質粒可含有病毒和細菌二者的成分。
真核微生物，如啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)或絲狀真菌〔如曲霉屬(Aspergillus)、脈孢菌屬(Neurospora)〕也可用作本發(fā)明的宿主細胞。啤酒酵母是一種特別好的宿主。在文獻中，轉化酵母的方法是眾所周知的，如Beggs(Nature 275104-108，1978)和Mackay(Meth.Enzymol.101325-343，1983)已作敘述。按已知方法，如Yelton等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA811740-1747，1984)可轉化曲霉屬。合適的酵母表達載體包括YRP7(Struhl等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA761035-1039，1979)、YEP13(Broach等人，Gene 8121-133，1979)、PJDB249和PJDB219(Beggs，同上)及其衍生物。這些載體一般含有一種選擇標記，如營養(yǎng)標記LEU2，它可在攜有Leu2突變的宿主菌株中選擇出，或最好包含一種“必要基因”，如Kawasaki和Bell(EP171142)所述。必要基因標記最好是粟酒裂殖酵母的三糖磷酸異構酶基因(POT1基因)，它能夠使培養(yǎng)在富含葡萄糖基質中的缺乏三糖磷酸異構酶的宿主細胞中的質粒穩(wěn)定地維持下去。含有這種POT1選擇標記的表達載體包括PCPOT(ATCC39685)、PMPOT2(ATCC67788)及其衍生物。在這些載體中，所插入的表達單元的轉錄方向最好與POT1基因的方向相反?？捎糜诮湍副磉_載體中的優(yōu)選啟動子包括來自酵母糖酵解基因的啟動子(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.25512073-12080，1980;Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1419-434，1982;Kawasaki US4599311)或來自乙醇脫氫酶(ADH)基因的啟動子(Young等人，Genetic Engineering of Microoganisms for Chemicals，Hollaender等人編，New YorkPlenum，1982，p.335;Ammerer，Meth.Enzymol.101192-201，1983;Russell等人，Nature 304652-654，1983)以及這些啟動子的衍生物和變異體。衍生物和變異體包括天然發(fā)生的突變型啟動子(如ADH2-4C)、由基因工程產生的雜交啟動子(見例如Bitter，WO86/06077;Rosenberg等人，EP164556)和其他基因工程衍生物。一般說來，這種衍生物與其親本啟動子相比具有增強的啟動子強度或改變的調節(jié)性。特別好的組成啟動子是三糖磷酸異構酶(TPI1)啟動子和ADH2-4C啟動子。特別好的調節(jié)啟動子包括野生型ADH2啟動子和溫度調節(jié)型雜交啟動子。溫度調節(jié)型雜交啟動子的構建方法如美國專利申請889100和036823中所述，即將一個或多個、最好是二個或多個拷貝的酵母接合型調節(jié)成分插入啟動子如TPI1啟動子中而構成。所得到的雜交啟動子被用于一種宿主細胞中，該宿主細胞能以溫度敏感方式表達接合型成分。就此而言，合適的酵母宿主細胞包括溫度敏感的sir和ste突變體。改變轉化細胞的生長溫度(一般為23°-36℃)可調節(jié)啟動子的強度。而且，在表達載體中最好含有轉錄終止信號，例如TPI1終止子。為便于純化由酵母轉化體產生的多肽，最好將編碼分泌蛋白質的酵母基因的信號順序以正確定向與編碼本發(fā)明肽的順序相連接。合適的信號順序包括MFa1基因的前原區(qū)(Kurjan和Herskowitz，Cell 30933-943，1982;Kurjan等人，US4546082)或BAR1基因的前原區(qū)(Mackay等人，US4613572)。酵母宿主菌株到處都可得到，例如美國典型培養(yǎng)物收集中心(Rockville，Md)或YeastGeneticStockCenter(Berkeley，Calif.)。宿主菌株最好攜有pep4突變，以減少本發(fā)明肽的蛋白降解。
高等真核細胞也可用作本發(fā)明合適的宿主細胞，最好是培養(yǎng)的哺乳動物細胞。用于哺乳動物細胞中的表達載體應含有一種啟動子，該啟動子能指導轉錄導入哺乳動物細胞中的克隆的DNA順序。特別好的啟動子是小鼠金屬硫因-1(MT-1)啟動子(Palmiter等人，Science222809-814，1983)或腺病毒2的主要晚期啟動子(Berkner和Sharp，Nuc.AcidsRes.121925-1941，1984)。在該表達載體中還含有位于DNA順序插入位點下游的多聚腺苷酸信號。還可含有其他順序，如增強子和RNA拼接信號。一般情況下，本發(fā)明肽的編碼順序以正確定向與哺乳動物的分泌信號順序相連接，以使肽從細胞中分泌出來。
通過例如磷酸鈣介導的轉染(Wigler等人，Cell14725，1978;Corsaro和Pearson，Somat.CellGenet.7603，1981;Graham和VanderEb，Virol.52456，1973)或電激法(Neumann等人，EMBOJ.1841-845，1982)將克隆的DNA順序導入培養(yǎng)的哺乳動物細胞中。選擇標記一般與所研究的順序一起導入細胞中，以便鑒定基因組中整合有克隆的DNA的轉染子。優(yōu)選的選擇標記包括使其具有抗藥性的基因，如新霉素、潮霉素和氨甲喋呤抗性。選擇標記可與所研究的順序同時以不同的表達載體導入細胞，或使它們在相同的表達載體中導入細胞。
當使用某些選擇標記如使其具有氨甲喋呤抗性的DHFR時，通過藥物選擇進行擴增可提高整合的DNA順序的拷貝數(shù)。使藥物濃度逐步增加，在每一步都選擇抗性細胞。通過對克隆順序拷貝數(shù)的上升進行選擇，可顯著提高表達水平。
例如，Miyajima等人(Gene58273-282，1987)、Isa和Shima(J.CellSci.88219-224，1987)和Kretsovali等人(Gene58167-176，1987)公開了在其他高等真核生物細胞中表達克隆的DNA順序的方法。
表達多肽的宿主細胞可在適合于特定宿主的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本領域的普通技術人員應該明白，可得到各種各樣的培養(yǎng)基，并可根據(jù)宿主細胞的營養(yǎng)要求、質粒選擇等選擇合適的培養(yǎng)基(關于培養(yǎng)基配方，可參見例如CatalogsoftheAmericanTypeCultureCollection，Rockville，Md.)。
一般說來，根據(jù)上述從組織進行提取的方法從細胞基質或透明的細胞溶解產物中純化重組肽。一般，通過高效液相層析和凝膠過濾的配合分離含有本發(fā)明肽的樣品。通過免疫測定或生物活性測定檢測峰部分。也可用其他常規(guī)分離法，包括免疫親和層析和離子交換層析。
本發(fā)明的多肽可用作治療劑以促進溫血動物中骨的生長。這些多肽可用于預防和治療骨質疏松癥、Paget氏病和牙周病以及用于促進骨折的愈合，特別可用于正常情況下不能愈合的病人。一般，將該多肽與一種生理上可接受的載體或稀釋劑如無菌水或無菌鹽水相混合。或者，將該多肽以凍干形式封裝，在用藥前再與載體或稀釋劑混合。長度約短于32個氨基酸的多肽適于從鼻內給藥。從鼻內給藥的方法是公知的。簡單地說，將所研究的肽溶于一種生理上可允許的緩沖液中，并噴在鼻膜上。不宜從鼻內給藥的較長和較短的多肽可通過注射，最好為皮下注射給藥。該多肽也可以栓劑給藥。合適的劑量一般約為0.2μg-2mg/Kg(病人體重)/天，約為2μg-2mg/Kg/天更好，約為20-200μg/Kg/天最好，這取決于待治療狀況的確切性質。若該多肽從鼻內給藥，最好在一天的進程中劃分劑量。很大的劑量會導致增生活性的減小。該肽也可與其他治療劑相混合而給藥。關于這一點，添加劑最好包括雌激素、降鈣素和磷酸氫鹽，已知這些添加劑能減少骨的消溶，因此對本發(fā)明的多肽具有互補作用。此外，已發(fā)現(xiàn)將該多肽與生長因子結合可增強其活性。特別是，在生長因子劑量等于或低于具有一般的促生長作用時可觀測到這種增強。所用的生長因子包括胰島素、類胰島素生長因子(促生長因子)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、轉化生長因子(TGFα和TGFβ)和表皮生長因子(EGF)、尤其優(yōu)選的是有或沒有IGF-I載體蛋白的類胰島素生長因子I(IGF-I，也稱為促生長因子C)。這些生長因子的制備方法是公知技術。例如，可參見Murray等人，US4766073;Derynck等人，EP200341;Derynck等人，US4742003;Gregory等人，US3883497;Eaton等人，EP46039;Jansen等人，Nature306609-611，1983;和Bell等人，Nature310775-777，1984。將生長因子與本發(fā)明的多肽相混合時，其用量為實驗中顯示能加強肽的增生活性而對軟組織影響最小的量。生長因子的用量一般等于或低于它們單獨產生臨床效果的用量。在一個最佳實施方案中，本發(fā)明的肽是與IGF-I混合施用的，IGF-I的劑量為0.02-2mg/天/Kg病人體重。
下述實例是為了說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
實例1大鼠N-proCT的鑒別A.免疫測定方法用制備的針對合成肽(得自Peninsula Laboratories)的抗血清通過免疫檢測法在正常和贅生性組織中檢測N-proCT，所述合成肽相應于降鈣素原氨基端和羧基端區(qū)域中的順序(如表1所示)。NCAP抗血清是用NCAP免疫兔子產生的，該NCAP通過1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺結合有鑰孔
血藍蛋白，(Birnbaum等人，1982，同上;Goodfriend等人，Science 1441344-1346，1964)。二個NTP抗血清是用結合有鑰孔
血藍蛋白的合成的NTP-Tyr免疫兔子產生的(Goodfriend等人，同上)。
用放射性碘標記的合成的〔Tyr0〕-NCAP作示蹤劑和標準進行NCAP放射免疫測定。碘化作用都通過氯胺-T法進行，并用Quso-32二氧化硅吸附進行純化(Roos和Deftos，Methods of Hormone Radioassay，第2版，Jaffe和Behrman編，New York，Academic Press，1978，p.401-418)。所設計的檢測法特異于N-proCT順序的游離羧基端部分。用含有修飾氨端(酪氨酸或Bolton-Hunter加合物)的放射性標記的NCAP類似物篩選抗血清，從而選擇出針對NCAP羧端部分的抗血清。放射免疫測定均在含1mM乙二胺四乙酸二鈉、0.005%鈉硫柳汞、0.1%牛血清清蛋白(Pentex組分V)和0.03%Brij-35洗滌劑的0.020M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中進行。每次測定所用標準為10-10000pg〔Tyr0〕-NCAP。加入最后稀釋度為1∶3500的NCAP抗血清(來自兔“Odessa”)、示蹤劑和標準或樣品，每管的最終體積為500μl，在4℃保溫過夜。加入1ml/管的0.1%(W/V)Iggsorb(The Enzyme Center)以實現(xiàn)相分離。對于合成的Tyr-NCAP和NCAP的檢測極限約為0.20pmol/管，在大約1.8pmol/管時結合的示蹤劑有50%被取代。NCAP的Bolton-Hunter衍生物的取代曲線與Tyr-NCAP和未修飾NCAP肽的很相似。相反，對于proCT46-55〔它缺少NCAP(和N-proCT)的最后兩個氨基酸〕，實質上未觀察到示蹤劑的取代。羧基端擴展的含NCAP的肽proCT46-59，其免疫活性比NCAP小1000倍，這表明在這種NCAP測定中需要一種游離羧基端絲氨酸以使含有NCAP的肽進行交叉反應。雖然NCAP免疫測定可識別N-proCT(proCT1-57)，但它不能檢測出降鈣素原或其他具有擴展羧基端的含NCAP的肽。
在CGRP前體的氨端中還發(fā)現(xiàn)一種NTP-Tyr片段(Amara等人，J.Biol.Chem.2572129-2132，1982;Gkonos等人，同上)，其抗血清可用于檢測N-proCT的氨基端區(qū)。所用的來自兔“Vanessa”的抗血清其最終稀釋度為1∶1000。加入抗血清、示蹤劑、標準或樣品以及緩沖劑，使每管的最終體積為500μl，在4℃下保溫過夜。采用抗血清Vanessa時，NTP-Tyr標準的檢測極限一般為150pg、(0.08pmol)/管，在1.2ng(0.74pmol)/管時取代率為50%。在這種NTP測定中，降鈣素、C-proCT、CGRP、生長激素抑制素和NCAP沒有交叉反應。由于數(shù)量為10-20μl/管的6M胍-HCl會干擾Vanessa放射免疫測定，所以用另一種NTP抗血清(來自兔“Peggy”)分析含胍的凝膠過濾組分。選擇這種Peggy抗血清是由于當6M胍-HCl的用量高達40μl/管時它仍可使用。在上述的500μl標準測定中所用的Peggy NTP抗血清的最終稀釋度為1∶20000。NTP-Tyr標準的檢測極限為12pg(7fmol)/管，在185pg(0.11pmol)/管時取代率為50%。
用降鈣素抗血清R-2(它特異于酰胺化的羧基端)以及一種能識別降鈣素中區(qū)的抗血清進行大鼠降鈣素的放射免疫測定(Roos等人，1979，同上;Birnbaum等人，1984，同上)。根據(jù)前人所述的方法，用以人CGRP抗血清RB-2035為基礎的免疫測定法來測定大鼠CGRP(Gkonos等人，同上;Haller-Brem等人，Endocrinology1211272-1277，1987)。
B.細胞提取物的制備將WAG/Rij大鼠飼養(yǎng)在AAALAC認可的動物設備中。所有標準食物都是嚙齒動物實驗食物＃5001(TekLad Co.，Harlan Sprague Dawley，Inc.)。這種食物含有4.5%脂肪、23%蛋白質、6%纖維及所有普通維生素和礦物添加物。處死6-9月齡的雌性大鼠，切除其甲狀腺以得到正常的甲狀腺組織。為誘導C細胞增生(Miller等人，Program of the Seventh Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research，Abstr.366，Washington，D.C.，1985)，選出幾組出生后4-7周的雌性WAG/Rij大鼠，然后用特定的高脂肪食物(在TekLad公司定制的高脂肪食物＃82376)喂養(yǎng)。這種食物含有45%脂肪、23%蛋白質和5%纖維及所有正常量的維生素和礦物添加物;這種高脂肪食物與普通食物(＃5001)的明顯差別是其脂肪含量高10倍。當這些大鼠組的年齡為7-10月時將其處死，取其甲狀腺用于分析。按下述方法制備組織提取物。
根據(jù)前人報道的方法，通過將一系列囊下腎(subcapsularrenal)移植到同源幼鼠中以導致富降鈣素系1-2-4髓甲狀腺癌(Roos等人，1979，同上)。用外科手術切除10-40克腫瘤，按下述方法進行提取。
為制備組織提取物，將10倍體積(ml/g)的2N乙酸/1%TFA加到精細切碎的組織中，然后將懸浮液煮沸20分鐘。用BirnkmannPolytron以10檔使樣品充分勻漿，然后置于冰上冷卻。以15000×g離心所得到的勻漿15分鐘，從沉淀中吸出上清液。為使降解減至最少并得到可重復的層析圖，用分批式反相法從上清液中提取多肽，在該方法中，將上清液加到2-5克的乙腈活化的、Vydac218TPB30C-18、大孔徑二氧化硅顆粒的柱(0.5×2cm)中。先用0.1%TFA洗滌柱子，再用20%乙腈/0.1%TFA洗滌。然后用少量90%乙腈/0.1%TFA洗滌樣品，并在SavantSpeedVac系統(tǒng)中干燥。
已建立的CA-77髓甲狀腺癌細胞系的單層培養(yǎng)物按常規(guī)在無血清的介質中生長，該介質由DMEM/營養(yǎng)混合物F-10(Ham′s)(1∶1)組成，并添加有1.28g/1 NaHCO3，5μg/ml轉鐵蛋白，30nM亞硒酸和5μg/ml胰島素。將培養(yǎng)物保存在潤濕的空氣-8%CO2環(huán)境中。根據(jù)前人的方法，使來自150-155代的CA-77細胞以5×105細胞/25cm2燒瓶的密度進行傳代培養(yǎng)(Muszynski等人，J.Biol.Chem.25811678-11683，1983);然后每48小時更換一次介質。對于分泌試驗，細胞只在DMEM中培養(yǎng)，用100mM CaCl2調節(jié)該介質的鈣濃度。在平板培養(yǎng)10天后開始進行試驗，以使各瓶中大約都含有5×106個細胞。在測試和對照保溫結束時，以16000×g離心10分鐘以澄清組織培養(yǎng)基，制成0.3mg/ml PMSF的溶液，冷凍貯存以用于分析。將從瓶中取出的細胞加入1%TFA中，通過聲處理使其勻漿。用離心法除去細胞碎片;將上清液制成0.3mg/ml的PMSF，冷凍貯存以用于分析。用同樣的方法使培養(yǎng)基和澄清的細胞提取物如組織提取物一樣通過VydacC18柱。
C.C細胞提取物中N-proCT的鑒定來自甲狀腺和贅生性C細胞的系列稀釋提取物的示蹤劑競爭曲線與NCAP和〔Tyr0〕-NCAP產生的相平行(圖2)。用純化的降鈣素原、NTP-Tyr和各種其他多肽，包括C細胞產物如降鈣素、C-proCT、CGRP和生長激素抑制素都未觀測到交叉反應性。
在NTP免疫測定中，系列稀釋的C細胞提取物的示蹤劑取代曲線與合成的NTP-Tyr標準的相平行(圖3)。
D.腫瘤細胞提取物中N-proCT的鑒定用反相高效液相層析分離腫瘤多肽。將來自1-2-4系髓甲狀腺癌的干燥的熱酸提取物重新懸浮在1%TFA(200-600μl)中，用WatersU6K注射器和標準的Spectra-physicsHPLC體系，將其注入WhatmanProtesil300Octyl-25分析柱中(Birnbaum等人，1984，同上)。用0.1%TFA水溶液中的乙腈梯度進行肽分離。在最初10分鐘中，乙腈濃度從30%增加到35%;此后，在其余的70分鐘內乙腈濃度從35%線性增加到40%。在48-49分鐘洗脫主要峰重合的免疫活性NCAP和NTP(圖4)。這些組分沒有降鈣素免疫活性。免疫活性NCAP和免疫活性NTP的洗脫比降鈣素原早(60分鐘)，比降鈣素晚(18分鐘)。在主要的免疫活性峰中，免疫活性NCAP對免疫活性NTP的摩爾比率為1.0，如對N-proCT的預期一樣。
通過在6M胍HCl中的凝膠過濾測定免疫活性多肽的大小。以6M胍HCl/0.01%牛血清清蛋白平衡0.9×60cm的SephadexG-50(超細)柱(Birnbaum等人，1984，同上)。進行層析前，將冷凍樣品溶于柱緩沖液中，其中補充有5%2-巰基乙醇，加熱到70℃1小時。在進行層析前，在樣品中加入藍葡聚糖和酚紅標記。按常規(guī)收集460μl的組分。用藍葡聚糖(Vo)、細胞色素C(12800)、大鼠CGRP二聚物(7600)、人促腎上腺皮質激素(4500)、大鼠CGRP(3800)、大鼠降鈣素(3450)、γ內啡肽(1860)和酚紅(Vs)進行大小的校準。
對凝膠過濾峰進行高效液相層析和對高效液相層析峰進行凝膠過濾證實，高效液相層析和凝膠過濾的主峰是相等的。
在1-2-4腫瘤中，降鈣素比CGRP多30倍，主峰含有洗脫的免疫活性NCAP和NTP二者(其表觀大小為7.4KDa)，即所預測的N-proCT大小(圖5)。未觀察到免疫活性NCAP的其他明顯峰，但對應于13KDa和4KDa處可觀察到洗脫的免疫活性NTP的小峰。在7.4KDa峰中，免疫活性NCAP對免疫活性NTP的摩爾比率高是由于胍干擾了放射免疫測定的緣故。而在降鈣素中區(qū)放射免疫測定中，降鈣素原(13KDa)峰與降鈣素發(fā)生交叉反應，而7.4KDa和4KDa的免疫活性NTP峰都不。4KDa免疫活性NTP可能是較大的免疫活性NTP的片段，因為部分純化的7.4KDa免疫活性NTP的貯存(在1%TFA中，在-20℃下)會產生少量的4KDa形式。貯存在0.3mg/mlPMSF和6M胍-HCl中時，會減少所產生的小的免疫活性NTP。在70℃用6M胍-HCl代替冷的1%TFA來提取組織也可以減少4KDa免疫活性NTP的量。
CA-77髓甲狀腺癌細胞分泌含7.4KDaNCAP的肽，其高效液相層析圖與在1-2-4腫瘤和甲狀腺中觀察到的細胞N-proCT難以區(qū)分。在基本培養(yǎng)基中存在的這種肽與降鈣素的摩爾比幾乎相等。使胞外鈣(一種已知的降鈣素促分泌素)由0.5mM上升至1.8或4mM，所刺激的免疫活性NCAP的分泌與降鈣素分泌的刺激相等。用4×10-7M的地塞米松處理這些培養(yǎng)物4天可增加NCAP和降鈣素的胞內含量以及NCAP和降鈣素分泌的基本比率。與未經處理的C細胞培養(yǎng)物一樣，鈣刺激類固醇處理的培養(yǎng)物可平行增加NCAP和降鈣素的分泌。
E.在正常甲狀腺和具C細胞增生的甲狀腺中的免疫活性多肽通過研究大鼠中食物誘發(fā)的C細胞增生可得到N-proCT和降鈣素在體內協(xié)同調節(jié)的證據(jù)。免疫活性NCAP和NTP含量的相應增加反映了長期食用高脂肪食物引起的甲狀腺中降鈣素含量的生理增加(表2)。發(fā)現(xiàn)這些甲狀腺中的免疫活性NCAP和NTP所具有的凝膠過濾和HPLC遷移率與正常甲狀腺和1-2-4腫瘤組織中的難以區(qū)分。在這種高效液相層析峰內的免疫活性NCAP與NTP的摩爾比為1.0。
用免疫測定法確定的正常甲狀腺中的免疫活性NCAP、NTP和降鈣素的摩爾量幾乎相等(表2)。正常大鼠甲狀腺中的免疫活性NCAP和免疫活性NTP的HPLC洗脫位置與1-2-4腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的相同。正常甲狀腺HPLC峰中的免疫活性NCAP與免疫活性NTP的表觀摩爾比為1.0，與從1-2-4腫瘤HPLC峰中觀察到的一樣。正常大鼠甲狀腺提取液的胍凝膠過濾證實存在一個7.4KDa免疫活性NCAP/NTP主峰，其大小與從1-2-4腫瘤中觀察到的免疫活性NCAP/NTP峰是基本一樣的。
表2降鈣素原產生的免疫活性的組織濃度＊免疫活性降鈣素免疫活性NCAP免疫活性NTP1-2-4腫瘤4.50±0.274.75±0.213.25±0.45正常甲狀腺0.98±0.290.96±0.320.88±0.29高脂肪喂養(yǎng)的大鼠甲狀腺4.63±0.394.25±0.534.25±0.57肝和肌肉＜0.01＜0.01＜0.01＊數(shù)值(±標準平均誤差)是以每mg組織的pmol當量表示的，并且為四次實驗的平均值。
NCAP抗血清的特異性表明，7.4KDa肽的羧基末端是絲氨酸，它緊接降鈣素原的第一個二元裂解位點之前(絲氨酸57)。NTP的免疫活性和CA-77細胞放射性標記肽的部分順序測定表明，其氨基末端與降鈣素原的一樣。因此，含有免疫活性NTP和免疫活性NCAP的肽的生化性質表明它是57殘基的N-proCT分子。
實例2N-proCT的分離大鼠髓質甲狀腺癌組織經稱重、切碎后，加到10倍體積(每克濕重)的1.5N乙酸中。將該混合物加熱至沸后，再沸騰20分鐘。熱混合物在BrinkmannPolytron中以10檔勻漿化。勻漿產物用冰水快速冷卻，并在4℃左右保持20分鐘，然后于20000×g離心20分鐘。小心吸取上清液以便不擾亂沉淀或漂浮的類脂層。
將上清液裝入用0.1%TFA平衡過的VydacC-18、寬孔的30微米二氧化硅的5g柱內，柱子預先已用90%乙腈/0.1%TFA活化。接著，該柱用25ml0.1%TFA洗滌，繼之用20%乙腈/0.1%TFA50ml洗滌。再用45%乙腈/0.1%TFA洗脫N-proCT，并于不加熱的SavantSpeedVac內干燥。
將干燥過的N-proCT溶于6M胍中，再裝入用6M胍-HCl(pH5.5)平衡過的Sephadex G-50柱內。合并含有7.4KDaNTP和NCAP的物質(圖5)。通過使肽吸附于1g的Vydac C-18柱上然后洗脫，以從合并的胍組分中回收肽，然后如上述在SpeedVac中干燥。
將干的凝膠過濾的N-proCT峰物質再懸浮于300μl的0.1%TFA中，再注入WhatmanC-8二氧化硅、10微米(孔徑300A)的反向樹脂0.6×25cm柱內。N-proCT肽用37%乙腈由柱上洗脫下來，它能夠通過用35-40%乙腈/0.1%TFA梯度流洗80多分鐘而使其與其他蛋白質分離(圖4)。選擇具有恒定的特異免疫活性的峰進行氨基酸分析和順序測定。
使用離子交換層析進行進一步純化，使用不同的離子配對劑和HPLC基質進行進一步HPLC純化，和/或使用適當?shù)母叩味瓤寡迕庖呶綄游鲞M一步純化。
實例3氨基端降鈣素原肽的生物活性A.大鼠N-proCT用來產生RIAs(實例1)的NTP-Tyr(代表57殘基大鼠N-proCT的最初十二肽片段)，被用來測定可能的骨消溶作用和/或骨細胞的增殖活性。顱蓋取自16天的雞胚和新生大鼠，并用膠原酶處理以制備骨細胞。將該細胞懸浮于無血清的BGJb培養(yǎng)基(得自Gibco，Grand Island，N.Y.的Fitton-Jackson Modification)中，并于平板上培養(yǎng)24小時以上。培養(yǎng)板經漂洗以除去成纖維細胞和其他的非成骨細胞。在22小時內，以0.001-100μM范圍的濃度加入合成的NTP-Tyr，并用氚標記的胸苷標記細胞4小時。通過可用TCA沉淀的氚化胸苷測定DNA合成，并作為細胞增殖的指數(shù)。DNA的合成相對于未處理培養(yǎng)物的給出。用合成的N-proCT片段時，在10μM濃度下能看到很強的有絲分裂反應，在1μM濃度下即能觀察到顯著的效應。降鈣素和CGRP都沒有促有絲分裂的效應(圖6)。解釋這些實驗的重要性在于這一事實，即采用這種特殊的平板培養(yǎng)法培養(yǎng)的骨細胞幾乎都是骨生成細胞(成骨細胞)及其前體(前成骨細胞)。
通過沸酸提取法和反相C-18二氧化硅純化法的聯(lián)用，將起始的組織勻漿濃縮100倍左右，從而由1-2-4腫瘤組織中部分純化出N-proCT。使N-proCT再懸浮于BGJb培養(yǎng)基中，中和后基本如上述加到大鼠或小雞顱蓋成骨細胞的培養(yǎng)物中。小雞(圖7A)和大鼠(圖7B)兩種骨細胞培養(yǎng)物的胸苷摻入量都有增加。在這兩種情況中，部分純化的N-proCT制劑誘發(fā)2-3倍的促有絲分裂應答，在10-7-10-8M下則觀察到最大應答。完整的N-proCT的靈敏度似乎比合成肽片段(NTP-Tyr)大100-1000倍。大鼠成骨細胞和前成骨細胞對大鼠肽似乎比小雞細胞(圖7)的敏感性更大一些。用量低至10-10M時還對鼠成骨細胞培養(yǎng)物有刺激效應。在血鈣過少癥檢測和骨消溶檢測中都有活性的降鈣素和CGRP，在10-4-10-6M濃度下，在平行的小雞成骨細胞促有絲分裂檢測中都沒有效應。
作為骨細胞的對照培養(yǎng)物，由剛出生的大鼠制備皮膚細胞培養(yǎng)物，并在無血清的情況下平板培養(yǎng)24小時。當把N-proCT加入鼠片膚細胞時，即使在最高濃度下(圖8)也只有輕微的促有絲分裂效應，盡管同樣的制劑在成骨細胞和前成骨細胞上有很強的效應。在對成骨細胞和前成骨細胞有最大刺激作用的濃度下，N-proCT對成骨細胞和前成骨細胞的促有絲分裂效應總是在成纖維細胞中觀察到的2-3倍。因此，N-proCT的促有絲分裂效應似乎是細胞特異的(成骨細胞和前成骨細胞而不是成纖維細胞)和肽特異的(天然肽和合成NTP，而不是降鈣素或CGRP)。這種促有絲分裂效應的效力與胰島素和促生長因子類似。
B.人N-proCT人N-proCT是通過AppliedBiosystems(FosterCity，Calif.)合成的，并以不純的制劑形式提供。
人肽的純化先通過Vydac C-4反相柱的高效液相層析純化，然后，HPLC主峰在Lichroprep RP-18(C-18反相二氧化硅)柱中純化。Lichroprep柱(0.5g)用10ml含0.1%三氟乙酸(TFA)的90%CH3CN活化。然后用20ml的0.1%TFA洗滌，再將N-proCT樣品(0.5ml)裝入柱中。該柱先后用10ml的0.1%TFA和10ml含0.1%TFA的20%CH3CN洗滌。N-proCT用40%CH3CN/0.1%TFA洗脫。用40%CH3CN洗脫的N-proCT高于90%。
分析合成肽的順序發(fā)現(xiàn)與天然的人N-proCT一樣(圖1)。
如上所述，檢測合成的人N-proCT對小雞成骨細胞和前成骨細胞的促有絲分裂活性。檢測結果以每一實驗組的平均值±標準平均誤差(n＝6)列于圖9，所示結果相對于對照組的平均值給出?！皩φ铡迸囵B(yǎng)物只接受BGJb培養(yǎng)基;“胰島素”培養(yǎng)物含10μg/ml胰島素(大約1.5μM)作為陽性對照。
還檢測合成的人N-proCT對人成骨細胞和骨肉瘤細胞的效應。富集人成骨細胞的培養(yǎng)物是由一名老年男子和兩名老年女子的手術股骨破片制得的。骨碎片用膠原酶消化。由消化液收集細胞，然后用PBS洗滌，再于盛有15%胎牛血清的無鈣MEM的組織培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。所得到的富集成骨細胞的培養(yǎng)物在培養(yǎng)皿中受胰蛋白酶作用，用PBS洗滌，再懸浮于含5%胎牛血清的BGJb培養(yǎng)基中，在每孔為50000細胞的密度下，于48孔微量滴定板(Costar，Inc)中培養(yǎng)。16小時后，移去培養(yǎng)基，用PBS洗滌培養(yǎng)物2次，再加入無血清的BGJb培養(yǎng)基。培養(yǎng)物生長6小時后除去培養(yǎng)基，再往每孔加200μl含檢測劑的BGJb培養(yǎng)基。16-18小時后，往每孔加50μl含1或2μC3H-胸苷的BGJb培養(yǎng)基。4小時后移去培養(yǎng)基，用PBS洗滌每個孔2次后干燥。用濕潤有12.5%TCA的棉簽括每個孔。再用12.5%的TCA洗棉簽2次，每次10分鐘，最后用95%乙醇洗10分鐘一次，干燥后放于4ml的Ecolume(ICN.Irvine.Calif.)內，之后用閃爍計數(shù)器計數(shù)。結果表明，10nM的人N-proCT對胸苷摻入DNA能產生最大的刺激(接近兩倍)，1nM左右時能產生最大效應的一半(圖10a)。在這些培養(yǎng)物中，胰島素的最大有效用量(10μg/ml或2μM)也使胸苷摻入增至2倍。還用人U-2OS骨肉瘤細胞(ATCC HTB96)進行了類似實驗。細胞被培養(yǎng)在BGJb培養(yǎng)基中，通過胰蛋白酶的作用由匯合后的瓶中收獲細胞，用PBS洗滌2次，于盛有含1%胎牛血清的BGJb培養(yǎng)基的48孔微量滴定板中培養(yǎng)過夜。將細胞轉移到無血清的BGJb培養(yǎng)基中，6小時后按上述方法測定3H-胸苷的摻入量。人N-proCT在濃度＞10μM時，刺激胸苷摻入DNA的效應最大(近兩倍)，而在5nM時則減半(圖10b)。用30ng/ml IGF-I(由人血清純化)或10μg/ml胰島素可觀察到差不多大的最大效應。
人N-proCT對鼠成骨細胞也有刺激作用，但對鼠皮膚細胞沒有。
結合胰島素測定了人N-proCT對人U-20S細胞的效應。這些細胞如前所述在48孔微量滴定板中培養(yǎng)，然后在N-proCT、胰島素或N-proCT加胰島素的存在下保溫48小時。結束時，胰蛋白酶和EDTA分別加到25mg/ml和1mM的最終濃度，然后使培養(yǎng)物在37℃下保溫至細胞能夠通過肉眼觀察分離。加入15%最終濃度的胎牛血清使胰蛋白酶純化。通過重復吸取使叢生的細胞分散，取等分試樣用血球計直接計數(shù)。結果列于表3，它表明N-proCT和胰島素之間具有協(xié)同效應。
表3處理每孔細胞數(shù)比對照增長的倍數(shù)BGJb(對照) 4，838(±796) 1(±0.12)1μMN-proCT13，201(±1，462)2.72(±0.30)10μg/ml胰島素12，900(±796)2.62(±0.16)5μg/ml胰島素8，235(±667)1.70(±0.14)5μg/ml胰島素+1μMN-proCT15，400(±1，054)3.20(±0.22)C.人N-proCT肽合成的人N-proCT用賴氨酰肽鏈內切酶(WakoChemicalsUSA.Inc.，Dallas，Tex.)消化。使345μg凍干的N-proCT溶于110μ18M脲中。加入10μlpH9的500mMTris，于37℃下使混合物保溫30分鐘。再往混合物中加入150μlpH9的50mMTris。加入賴氨酰肽鏈內切酶(3mg/ml儲備液)以使酶底物比為1∶100?；旌衔镉?7℃下保溫過夜，然后冷凍儲存。所得到的肽N-proCT(1-37)和N-proCT(38-57)用0%-70%乙腈的0.1%TFA梯度溶液由VydacC-4柱層析回收。
使用碘化的人N-proCT作為示蹤物，用競爭結合法測定人N-proCT(1-37)和N-proCT(38-57)與U-20S細胞的結合。結合測定法基本上按實例1所述進行。發(fā)現(xiàn)5μM的N-proCT(1-37)在結合競爭中至少與相同濃度的完整人N-proCT的效果一樣。片段(38-57)幾乎沒有顯示出結合競爭的能力，即使有也很小。
如上所述測定合成的NCAP(表1)對小雞和大鼠成骨細胞的促有絲分裂活性。肽在0.1μM-0.1mM濃度范圍內不顯示促有絲分裂活性。而且，NCAP不與完整的人N-proCT競爭結合骨肉瘤細胞。
實例4大鼠N-proCT在酵母中的表達A.N-proCT編碼順序的合成57氨基酸的大鼠N-proCT的編碼順序是由列于表4的6個合成寡核苷酸構建的。所設計的寡核苷酸應當提供為便于表達載體的構建分別在5′和3′末端上的EcoRⅠ和XbaⅠ限制位點;最適于酵母的轉譯起始位點;ATG起始密碼子;為便于以后的順序操作，根據(jù)酵母密碼子的偏愛、多重限制位點的清除及限制位點的引入而挑選密碼子;和TAA終止密碼子。在AppliedBiosystems380A型DNA合成儀中合成寡核苷酸，并用變性凝膠的電泳純化。寡核苷酸經激酶活化，以等摩爾比例混合并退火。然后使退火對連接起來，所得到的混合物用EcoRⅠ和XbaⅠ消化。使用天然聚丙烯酰胺平板凝膠電泳分離190bp編碼順序(圖11)，再從凝膠中提取。編碼順序的裝配舉例說明于圖12。
B.用ADH2-4c啟動子表達為了在酵母中表達，將N-proCT片段與ADH2-4c啟動子和TPI1終止密碼子連接。所得到的表達單位再插入含有POT1選擇標記的載體中。
Russell等人(Natare 304652-654，1983)描述的ADH2-4c啟動子是由野生型ADH2(乙醇脫氫酶Ⅱ)啟動子的下游部分與ADH2-4c啟動子的上游部分結合而構建的。ADH2-4c啟動子的上游順序決定其增強功能。該啟動子的構建說明于圖12。含有野生型ADH2結構基因的2.2Kb BamHI片段和pBR322-ADR2-Bsa(Williamson等人，Cell23605-614，1981)的5′鄰接順序與M13mp19連接，然后用BamHI使其線性化。插段的取向取決于限制性分析。寡核苷酸ZC237(5′GCC AGT GAA TTC CAT TGT GTA TTA 3′)在Applied Biosytems 380A型DNA合成儀中合成，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。為了分離啟動子，用ZC 237作為誘變引物和Zc 87(5′TCC CAG TCA CGA CGT 3′)作為第二引物，對在M13mp19中的ADH2插段進行離體的位點特異性誘變(Zoller等人，DNA3479-488，1984)。在陽性克隆中，寡核苷酸ZC 237使ADH2基因的結構部分成環(huán)，同時使含有轉譯起始信號的5′鄰接順序與M13mp19多人工接頭的EcoRⅠ位點融合。制備復制形式的誘變噬菌體，再用Bam HI和EcoRⅠ切割以分離1.2Kb的啟動子片段。該片段與用BamHI和EcoRⅠ線性化的pUC13相連接，以產生質粒p237-Wt。為了使p237-Wt啟動子變成“向上啟動子”突變體ADH2-4c啟動子，將含有發(fā)現(xiàn)能影響啟動子功能的變化的YRP7-ADR3-4C(Russell等人，同上)的1.1Kb BamHⅠ-SphⅠ片段，亞克隆至P237-Wt的載體片段中，該質粒已先用BamHⅠ和SphⅠ切開。所得到的質粒稱為p237-4C(圖13)。
克隆的ADH2-4C啟動子通過加入末端限制性核酸內切酶切割位點而修飾。為了方便起見，這一步是通過使啟動子與質粒pAT-1中的成熟型人α-1-抗胰蛋白酶(AAT)第一氨基酸的密碼子相融合完成的。質粒pAT-1包括來自p237-Wt的ADH2啟動子表達單位和α-1-抗胰蛋白酶cDNA-TPI1終止子順序。這些順序被插入載體PCPOT(圖14)的一部分中。(質粒PCTPOT作為大腸桿菌HB101轉化株在ATCC寄存，寄存號為39685。它包括整個2微米質粒DNA、leuZ-d基因、pBR322順序和粟酒裂殖酵母POT1基因)。質粒PCPOT用BamHI和SalⅠ切開以分離約10Kb的線性載體片段。1.2kb ADH2啟動子片段由P237-Wt中作為BamHI-EcoRⅠ片段而分離，并與1.5kbα-1-抗胰蛋白酶cDNA-TPI1終止子片段(EcoRI-XhoⅠ)和線性化的pCPOT作三段連接，產生稱為PAT-1的質粒。
質粒PAT-1在ADH2轉譯起始密碼子和成熟AAT的第一氨基酸密碼子之間含有三個額外的氨基酸密碼子。這三個密碼子通過離體的位點特異性誘變而除去。質粒pAT-1用SphⅠ和BamHⅠ切開后，分離出190bp ADH2啟動子片段。這種片段連到已為BamHI和SphⅠ線性化的M13mp18中。使用ZC411(5′TAATACACAATAGGAGGATCCC3′)作為誘變引物，以ZC87作第二引物，使所獲得的構建體進行離體誘變，以使ADH2轉譯起始信號與成熟的α-1-抗胰蛋白酶的第一密碼子相融合。陽性克隆已通過從170bp處的ATG至融合點的雙脫氧順序測定所證實。為便于操作，使175bp的誘變啟動子片段SphⅠ-EcoRⅠ與已被SphⅠ和EcoRⅠ線性化的PUC19連接。所獲得的質粒稱為p411，它包括ADH2啟動子3′頂端的170bp和ADH2轉譯起始密碼子，該起始密碼與載體PUC19中成熟AAT的第一氨基酸密碼子相融合。
為了產生與成熟AAT的第一氨基酸密碼子融合的完整的ADH2-4c啟動子，將含有由Russell等人發(fā)現(xiàn)影響啟動子功能變化的ADH2-4C啟動子的5′頂端順序，加到存在于質粒p411中的啟動子片段中。為了分離175bp啟動子片段，質粒p411用SphⅠ和EcoRⅠ消化。質粒p237-4C用EcoRⅠ和SphⅠ切開，以分離出含pUC載體順序和賦予“向上啟動子”表型的啟動子5′頂端順序的3.71kb片段。來自p411的175kb啟動子片段連接于p237-4C載體片段中。所得到的質粒定名為p234-4CM，它含有與成熟AAT第一氨基酸密碼子相融合的完整ADH2-4C啟動子。
由質粒pAT-1產生的ADH2啟動子，通過除去ADH2轉譯起始部位和在PAT-1中發(fā)現(xiàn)的PUC18多人工接頭順序，修飾成“通用型”啟動子，質粒PAT-1用SphⅠ和BamHⅠ切開，以分離190bp的部分的ADH2啟動子片段。該片段與已為BamHⅠ和SphⅠ線性化的M13mp18連接。采用ZC410(5′CGTAATACAGAATTCCCGGG3′)作誘變引物，ZC87作第二引物，使所得到的構建體經受離體誘變，從而用融合于M13mp18多人工接頭的SmaⅠ位點處的單一EcoRⅠ位點代替ADH2轉譯起始信號和pUC18多人工接頭順序。陽性克隆借助于直至融合點的雙脫氧順序測定而得到證實。為了便于操作，誘變的部分ADH2啟動子片段作為175bp SphⅠ-EcoRⅠ片段被亞克隆入由SphⅠ和EcoRⅠ線性化的pUC19中。所得到的質粒定名為p410ES，它含有ADH2啟動子3′頂端的175bp。通過使P410ES啟動子片段(SphⅠ-EcoRⅠ)與來自p237-4C的1.1kb BamHⅠ-SphⅠ ADH2-4C啟動子片段相連接，從而將ADH2-4C啟動子修飾成含有此3′順序。使這兩種啟動子片段與BamHⅠ和EcoRⅠ切開的PUC13作三段連接。通過限制分析證實，所獲得的質粒含有完整的ADH2-4C啟動子，其3′端通過誘變由EcoRⅠ位點取代了轉譯起始密碼。該質粒命名為P410-4C(圖13)。
來自P410-4C的BamHⅠ-EcoRⅠ ADH2-4C啟動子片段和EcoRⅠ-XbaⅠ N-proCT片段連到BamHⅠ和XbaⅠ消化的M13mp18中。測定含有插段的M13克隆的順序，并由含有完整插段的克隆制備復制型(RF)DNA。噬菌體載體用BamHⅠ和XbaⅠ消化，并分離啟動子-N-ProCT片段。該片段再與來自PKP10(一種含有來自PSB1〔Marray等人，US4766073〕的TPI1啟動子-α因子-VSB-TPI1終止子表達單位的質粒，它被插入缺失EcoRⅠ位點的pBR322載體中)的XbaⅠ-BamHⅠ TPI1終止子片段和BamHI消化的PUC19相連接。含有合適插段的克隆再用BamHⅠ消化，并分離表達單位。
然后構建最終的表達載體。質粒PCPOT用SphⅠ和BamHⅠ切開以除去2微米的750bp和PBR322順序。之后將線性載體與由PBR322四環(huán)素抗性基因產生的186bp SphⅠ-BamHⅠ片段連接。所獲得的質粒命名為PDPOT(圖12)，此質粒再用BamHⅠ消化并與BamHⅠ表達單位相連接，然后確定所得到的克隆的插入方向。選擇出含有鄰近POT1基因的ADH2-4c啟動子的質粒，命名為PM271-9。
表達載體PM271-9被用于轉化啤酒酵母ZM118株(leu2-3，112 ura 3 tpilURA3+barl pep4URA3+〔cir0〕的MATa/MATα二倍體純合子)、ZM134株(MATa △tpiURA3 pep4URA3 leu2ura3 sir3-8〔cir+〕)和XB13-5B株(MATa ura3 leu2-3，112barl gal2 tpilURA3)。選出TPI+菌落后于30℃下在富含葡萄糖的培養(yǎng)基中生長2天。制備粗溶胞產物并于-80℃下貯存。溶胞產物經融化后澄清，再從澄清的溶胞產物中基本按實例2所述制備N-proCT。溶胞產物中的N-proCT濃度用NCAP放射免疫檢測法檢測。結果列于表5。
第二套表達載體是將N-proCT表達單位插入載體PMPOT2中而構建的，該載體含有REP1、REP2、REP3和由酵母2微米質粒產生的ori順序、氨芐青霉素抗性標記和粟酒裂殖酵母磷酸丙糖異構酶(POT1)基因。PMPOT2作為大腸桿菌HB101轉化株寄存于美國典型培養(yǎng)物收集中心，保藏號為67788。質粒p271-9用BamHⅠ消化后分離出N-proCT表達單位。使此片段與BamHⅠ消化的pMPOT2相連接以構建載體pM274-4和PM274-15(圖20)。
用質粒pM274-4和pM274-15轉化啤酒酵母ZM118株。轉化株于30℃下用含28μg/ml亮氨酸的酵母培養(yǎng)基Ⅰ(2%酵母膏，6%葡萄糖，0.5%硫酸銨)20ml或200ml培養(yǎng)過夜。細胞通過離心與培養(yǎng)基分離，再懸浮于PBS中，再于玻璃珠存在下用渦流溶解。將得到的粗溶胞產物冷凍貯存以備檢測用。
重組N-proCT的活性檢測是用22小時齡的小雞顱骨細胞增殖檢測法進行，采用天然N-proCT(100nM，來自鼠髓甲狀腺癌)和胰島素(10μg/ml)作為陽性對照。融化的酵母溶胞產物以16，800×g離心15分鐘。然后利用Vydac大孔珠通過C-18二氧化硅反向分批層析濃縮澄清的溶胞產物。用30%-50%乙腈/0.1%三氟乙酸由Vydac珠洗脫的組分在SpeedVac中干燥后，再懸浮于1ml的BGJb培養(yǎng)基中。每一批樣品的N-proCT濃度通過NCAP RIA測定。將肽制劑用于細胞培養(yǎng)物。18小時后，向每一培養(yǎng)物中加入3H-胸苷，自此4小時后，測定每一試驗條件下的相對未處理(對照)培養(yǎng)物的可由TCA沉淀的氚。結果列于圖15。樣品(克隆和N-proCT濃縮物)如下A.p274-4克隆1，16nM;B.p274-4克隆2，3nM;C.pMPOT2對照;D.p274-15克隆1，135nM;E.p274-15，克隆2，＞5nM。
C.用溫度調節(jié)型雜交啟動子進行的表達部分TPI1啟動子片段是由質粒PTPIC10(Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1410-434，1982)獲得的。質粒PTPIC10在單一KpnⅠ位點上切開，用Bal 31核酸外切酶除去TPI1編碼區(qū)，并且往啟動子的3′末端加入EcoRⅠ人工接頭(順序GGAATTCC)。用BglⅡ和EcoRⅠ消化后產生具有BglⅡ和EcoRⅠ粘性末端的TPI1啟動子片段。該片段再與用BglⅡ和EcoRⅠ(部分)切開的質粒YRp7′(Stinchcomb等人，Nature 28239-43，1979)相連接。所得到的質粒TE32用EcoRⅠ(部分)和BamHⅠ切開以除去一部分四環(huán)素抗性基因。線性質粒通過加入EcoRⅠ-BamHⅠ人工接頭環(huán)化，從而產生質粒TEA32。質粒TEA32用BglⅡ和EcoRⅠ消化，用凝膠純化大約900bp的部分TPI1啟動子片段。質粒PIC19H(Marsh等人，Gene 32481-486，1984)用BglⅡ和EcoRⅠ切開，載體片段用凝膠純化。TPI1啟動子片段與線性化的PIC19H連接，所獲得的混合物用于轉化大腸桿菌RR1。制備質粒DNA，選擇大約900bp的BglⅡ·EcoRⅠ片段。篩選出的合適質粒命名為PICTPIP(圖17)。
然后裝配完整的TPI1啟動子。用EcoRⅠ消化質粒pIC7(Marsh等人，同上)，片段末端用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)平整，并用T4DNA連接酶再成環(huán)。獲得的質粒被用于轉化大腸桿菌RR1。由轉化株制備質粒DNA，并篩選EcoRⅠ位點的喪失。具有正確限制模式的質粒定名為pIC7RI＊。質粒PIC7RⅠ＊用HindⅢ和NarⅠ消化，用凝膠純化2500bp片段。用NarⅠ和SphⅠ使部分TPI1啟動子片段(大約900bp)由PICTPIP切下，再用凝膠純化。由質粒PFATPOT(Kawasaki和Bell，EP171，142)制得TPI1啟動子的其余部分。用PFATPOT轉化的啤酒酵母E18株(定名為ZYM-3)保藏于美國典型培養(yǎng)物收集中心，保藏號為20699。PFATPOT用SphⅠ和HindⅢ消化，包括一部分TPI1啟動子的1750bp片段用凝膠純化。pIC7RI＊片段，由PICTPIP產生的部分TPI1啟動子片段和由PFATPOT產生的片段進行三段連接，以產生PMVR1(圖18)。
然后將MATα2操縱基因順序插入TPI1啟動子中。質粒pSXR101的構建是通過使PUC9的2.7kb SalⅠ-BamHⅠ片段與TPI1啟動子的0.9kb XhoⅠ-BamHⅠ片段連接而完成的，后一片段是由質粒PMVR1產生的。然后，將質粒PSXR101中TPI1啟動子的SphⅠ位點改變成單一的XhoⅠ位點。根據(jù)標準方法(Maniatis等人，同上)，用SphⅠ切開PSXR101 DNA并脫磷酸。SphⅠ-XhoⅠ轉接體(GCTCGAGCCATG)于37℃下在20μl反應混合物中激活30分鐘，該混合物包括20pmole轉接體、50mM Tris-HCl，pH7.6，10mM MgCl2，5mM DTT，0.1mM亞精胺、1mM ATP和5單位多核苷酸激酶。激活的SphⅠ-XhoⅠ轉接體與SphⅠ切開的PSXR101相連接，連接混合物用于轉化大腸桿菌RR1。用限制分析法鑒定具有插入轉接體的質粒，并命名為PSXR102(圖18)。合成MATα2操縱基因的寡核苷酸(5′TCGAG TCA TGT ACT TAC CCA ATT AGG AAA TTT ACA TGG 3′和3′C AGT ACA TGA ATG GGT TAA TCC TTT AAA TGT ACC AGCT 5′)，并按上述激活。質粒pSXR102用XhoⅠ切開并按標準方法脫磷酸。建立三個不同的連接反應，質粒DNA與寡核苷酸的摩爾比分別為1∶1、1∶3和1∶6。得到的連接混合物用于轉化大腸桿菌RR1。具有插入寡核苷酸的質粒通過菌落雜交和限制分析鑒定。隨后的DNA順序測定表明，PSXR103含有一個拷貝的MATα2操縱基因、PSXR104含有兩個拷貝、而PSXR108含有4個拷貝(圖19)。
在下一步驟中，質粒PSXR102、PSXR103、PSXR104和PSXR108用BamHⅠ切開、脫磷酸并與3.2kb BamHⅠ-BamHⅠ片段連接，該片段來自含有大腸桿菌lac Z基因的質粒plac7。該連接混合物被用于轉化大腸桿菌RR1。含有適當?shù)腡PI1-lacZ融合體的質粒用限制分析法鑒定，并命名如下PSXR109，無MATα2操縱基因;PSXR110，一個MATα2操縱基因;PSXR111，兩個拷貝的MATα2操縱基因;以及PSXR112，四個拷貝的MATα2操縱基因順序(圖20)。
然后，構建由溫度調節(jié)型的TPI1啟動子、N-proCT順序和TPI1終止了組成的表達單位。質粒PM271-9用EcoRⅠ和BamHⅠ消化以切下ADH2-4C啟動子。質粒PSXR111用BglⅡ和EcoRⅠ消化，之后分離SXR111啟動子片段，再與線性PM271-9連接。根據(jù)插入的方向將得到的質粒定名為PM275-4和PM275-5(圖15)。
用質粒PM275-4和PM275-5轉化啤酒酵母ZM134株。轉化株在20ml的YEPD(1%酵母膏、2%蛋白胨，2%葡萄糖和40mg/l腺嘌呤)的培養(yǎng)液中，于30℃下培養(yǎng)過夜，以使細胞密度達到8×107細胞/ml左右。將溫度降至23°-25℃，培養(yǎng)液再保溫2小時。使細胞沉淀，再懸浮于20ml新鮮的YEPD中，于23°-25℃下培養(yǎng)24小時。如上所述制備粗溶胞產物，并于-80℃下冷凍。
D.用野生型ADH2啟動子表達用來自P410ES的部分ADH2啟動子片段再生野生型ADH2啟動子。質粒P410ES用SphⅠ和EcoRⅠ消化以分離175bp部分的ADH2啟動子片段。該片段與來自PBR322-ADR2-Bsa的1kb BamHⅠ-SphⅠ片段分三段連接結合于PUC13中，PUC13預先用BamHⅠ和EcoRⅠ的消化而線性化。來自PBR322-ADR2-Bsa的1kb片段含有與野生型ADH2啟動子順序同源的順序。由三段連接得到的質粒為限制分析所證實，并定名為P410-Wt。
質粒pM271-9用BamHⅠ和EcoRⅠ消化，然后將來自P410Wt的BamHⅠ-EcoRⅠ ADH2啟動子片段插入ADH2-4C啟動子的位置中。根據(jù)插入的方向，所得到的質粒定名為PM277-15和PM277-16(圖14)。
質粒PM277-15和PM277-16用于轉化啤酒酵母ZM118株。20ml YEPD培養(yǎng)液于30℃下培養(yǎng)大約48小時。制備粗溶胞產物并于-80℃下冷凍。
使用合成的NCAP作為標準，通過放射免疫檢測法檢測溶胞產物中的N-proCT濃度。重復測定的結果列于表5。
表5質粒株%胞質蛋白12平均PM271-9 ZM134 2.07 2.52 2.29ZM1180.540.690.62XB13-5B0.190.640.41PM227-15 ZM118 0.48 0.41 0.44PM277-16 ZM118 0 0.18 0.09PDPOT ZM134 0 0 0ZM11800E.大鼠N-proCT的分泌表達基本如上述裝配大鼠N-proCT的編碼順序，只是用寡核苷酸ZC2041(5′AGCTTGGACAAGAGAGTTCCCTTAAGATCTACCTTGGAATCTTCTCCAGGTATGGCTACCTTGT3′)和ZC2042(5′CTTCAGACAAGGTAGCCATACCTGGAGAAGATTCCAAGGTAGATCTTAAGGGAACTCTCTTGTCCA3′)分別代替ZC1791和ZC1792。這樣裝配的編碼順序包括在其5′末端上的HindⅢ“粘性末端”。
為了表達載體構建物，將裝配的編碼順序與來自pkp10的TPI1終止子片段(XbaⅠ-BamHⅠ)連接。得到的HindⅢ-BamHⅠ片段與ADH2-4C啟動子(來自PM271-9的BamHⅠ-EcoRⅠ)、α因子前原順序(EcoRⅠ-HindⅢ)和BamHⅠ切開的PDPOT連接。得到的表達載體定名為PM294-1(與POT1標記方向相反的N-proCT表達單位)和PM294-4(與POT1方向相同的N-proCT表達單位)。
用載體PM294-1和PM294-4轉化啤酒酵母XB13-5B株。兩份20ml培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)基樣品稀釋至1∶1000，并檢驗N-proCT免疫活性物質。結果(調節(jié)至完整強度的培養(yǎng)基)列于表6中。
表6質粒N-proCT(μg/ml)PM294-1 3844PM294-4 7046實例5人N-proCT的表達由寡核苷酸(表7)、5′末端的EcoRⅠ位點和3′末端的Xba.Ⅰ位點構建人的N-proCT順序，這些寡核苷酸被設計為用酵母優(yōu)選的密碼子編碼肽。編碼順序包括起始的甲硫氨酸殘基，它在體外被甲硫氨酸氨肽酶切除以產生合適的肽。

為了進行胞質表達，合成由A至F的寡核苷酸，并純化、激活、以相同比例混合并退火。連接所得到的寡核苷酸對(A+F、B+F、C+D)，混合物用EcoRⅠ和XbaⅠ消化。通過天然聚丙烯酰胺平板凝膠電泳分離編碼順序并且從凝膠中提取。
然后基本按實例4所述構建表達載體。ADH2-4C啟動子(BamHⅠ-EcoRⅠ片段)、野生型ADH2啟動子(BamHⅠ-EcoRⅠ片段)或SXR111啟動子(BglⅢ-EcoRⅠ片段)與PKP10的TPI1終止子一起和N-proCT順序連接。將所獲得的表達單位插入PMPOT2或PDPOT中，并測定插入的方向。
為了進行表達，用人N-proCT表達載體轉化適當?shù)慕湍杆拗髦?。用含ADH2-4C或野生型ADH2啟動子的載體轉化ZM118、XB13-5B和ZM134株。用含SXR111啟動子的載體轉化ZM134。通過在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以選擇轉化株。為了肽的調節(jié)表達或組成表達，使細胞在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)。然后溶解細胞，制備無細胞的溶胞產物用于檢測。
質粒PM286-7是以PDPOT為基礎的質粒，它的N-proCT表達單位中含有ADH2-4C啟動子，其方向與POT1基因相同，用此質粒轉化ZM134。轉化的細胞基本如上述進行培養(yǎng)。收集細胞后，在1M乙酸中溶解，并離心。所獲得的澄清的溶胞產物使用抗-NCAP抗血清通過放射免疫檢測法檢測N-proCT的產生。用檢測緩沖液(0.02M NaPO4pH7.4，0.05%NaN3，0.05%NP-40，1mM EDTA)稀釋澄清的溶胞產物樣品。兩份樣品(100μl)加到盛有200μl檢測緩沖液的管中。往每根管中添加100μl用檢測緩沖液稀釋1∶7(1∶3500總稀釋度)的抗體。將100μl含20，000cpm125Ⅰ-標記的人N-proCT的檢測緩沖液加到每個管中，各管于室溫下保溫4小時。金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)細胞(Pansorbin;Sigma Chemical Co.)用檢測緩沖液稀釋1∶200，在每管中加入1ml所獲得的懸浮液，各管經混合后于室溫下保溫20分鐘。各管以3000rpm離心15分鐘，倒出上清液，測量沉淀中的放射活性。N-proCT水平的測定采用與標準曲線的對比進行，該曲線是用合成的人N-proCT稀釋至500、250、125、62.5、31.25、15.6和7.8ng/ml繪制的。發(fā)現(xiàn)大約0.025%總的可溶蛋白質是N-proCT。
為了通過酵母分泌人的N-proCT，寡核苷酸B、C、D、E、G和H如上述進行退火，以獲得對G+H、B+H和C+D對。連接各對，用HindⅢ和XbaⅠ消化混合物，再用凝膠純化片段。
裝配用于分泌表達的載體。連接N-proCT片段(HindⅢ-XbaⅠ)和來自PKP10的α因子前原片段(EcoRⅠ-HindⅢ)，并插入含有上述的TPI1啟動子和終止子的表達載體中，以構建質粒PM285-13(與POT1相同取向的表達單位)和PM285-15(相反取向的表達單位)。第二套分泌型表達載體的構建采用來自P410-4C的ADH2-4C啟動子和來自PKP10的TPI1終止子進行。這些載體被命名為PM284-3(與POT1取向相同的表達單位)和PM284-4(取向相反的表達單位)。
用質粒PM284-3轉化啤酒酵母XB13-5B株。用質粒PM285-13和PM285-15轉化XB13-5B和ZM134株。按前述培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)物經0.45微米濾器無菌過濾，并如上述采用抗NCAP抗血清的放射免疫檢測法檢測N-proCT。兩套實驗結果列于表8表8質粒宿主株輸出的N-proCT(μg/ml)12平均PM284-3 XB13-5B 6.71 5.97 6.34PM285-13 XB13-5B 5.19 3.63 4.41PM285-15 XB13-5B 2.96 4.80 3.88PM285-15 ZM134 3.51 3.33 3.42重組N-proCT通過往培養(yǎng)基中添加1%(按體積)乙酸和30%(按體積)乙腈從酵母培養(yǎng)基中純化?；旌衔锪鬟^VydacC-4反向柱后，用在水中的30%-50%乙腈梯度洗脫。在215nm下監(jiān)測洗脫液的吸光度，收集含有N-proCT的峰值組分。
實例6N-proCT的體外活性SwissWebster幼鼠(21天齡，平均體重16克，n＝8)皮下注射10μg合成的人N-proCT(溶解于0.01M乙酸中)14天，每日兩次。對照小鼠(n＝7)注射載體。在處理和對照小鼠之間存在的體重差別不明顯。因此，N-proCT對小鼠無毒。動物在實驗第2天和第13天注射四環(huán)素，以標記用于組織形態(tài)測量的骨骼。使動物在14天時處死，將解剖除去軟組織的骨骼固定于中性緩沖甲醛水溶液中。用每只動物制備脛腓骨的脛節(jié)斷面(50μm)，然后通過成象分析法測定四環(huán)素標記。骨內四環(huán)素標記的平均面積在N-proCT處理動物中比對照組大得多(+46%，P＜0.02)(圖21)。用N-proCT處理的小鼠的第二海綿區(qū)中，每平方毫米表面上的成骨細胞數(shù)比對照組有顯著下降(-34.4%，p＜0.001)。這些數(shù)據(jù)因此證實，N-proCT在體外影響骨的形成，并認為這種C細胞產物是骨生長的重要調節(jié)劑。
實例7成骨細胞上N-proCT受體的證據(jù)為了闡明N-proCT對類成骨細胞的作用機理，用放射性碘標記的人N-proCT檢測與培養(yǎng)的U-20S細胞結合的高親和力，這些細胞是由人的骨肉瘤制成的。合成的人proCT(用反相HPLC純化)用氯胺T法進行放射碘標記，之后通過Quso G-32二氧化硅/Dowex AG1-X8(Bio-Rad Laboratories，Richmond，Calif.)的洗脫純化。用這種標記的人N-proCT(60000cpm/ng)在這些研究中作為示蹤化合物。人U-2OS細胞以每孔20，000個細胞的密度在48孔微量滴定板中培養(yǎng)。在實驗開始前的6小時，以及在整個結合研究的過程中，細胞均置于無血清的BGJb組織培養(yǎng)基內。加入大約0.5%的示蹤物與這些細胞特異性結合(特異結合被定義為，在沒有合成的N-proCT的情況下，少于存在有高濃度〔5-8μM〕的未標記N-proCT情況下保溫后殘留的放射活性的結合量)。5μM人降鈣素和胰島素不與125I-N-proCT競爭與細胞的結合。與未標記人N-proCT的競爭結合的表觀密度kd(最大結合的一半)為10nM，而與合成的人NTP-Tyr的競爭則有200nM的Kd。這些確定的解離常數(shù)，與每種肽誘發(fā)U-20S細胞增殖的最大刺激一半所必需的濃度非常吻合。假設在結合實驗結束時達到平衡和每孔有大約20，000個細胞，那么每個細胞至少有3000個結合部位。這些結果進一步證實，N-proCT是通過直接作用于成骨細胞而促進骨形成的一種C細胞肽激素。
雖然為清楚理解本發(fā)明而詳細并舉例進行了說明，然而在本發(fā)明權利要求的范圍內，顯然可對本發(fā)明進行某些變化和修飾。
權利要求
1.一種分離的肽，它具有如下特征其長度至少為12個氨基酸；至少與一部分大鼠N-proCT基本同源；在最大刺激成骨細胞和前成骨細胞的濃度下，與成纖維細胞相比，使成骨細胞和前成骨細胞中的DNA合成至少增加二倍。
2.權利要求1的分離肽，其特征為該肽由大約52-57個氨基酸組成。
3.權利要求1的分離肽，其特征為該肽含有的氨基酸順序選自下列構成的一組(a)VPLRSTLESSPG;(b)APFRSALESSPA;(C)APVRPGLESITD，和(d)APARTGLESMTD。
4.權利要求1的分離肽，其特征為該肽具有的氨基酸順序選自大鼠、人、雞和鮭魚N-proCT以及大鼠、人和雞的N-proCGRP順序，如圖1所示。
5.權利要求1的分離肽，其特征為該肽的長度少于32個氨基酸。
6.一種分離的肽，它含有選自下列一組的順序(a)VPLRSTLESSPG;(b)APFRSALESSPA;(c)APVRPGLESITD;和(d)APARTGLESMTD。
7.一種刺激成骨細胞和前成骨細胞的細胞分裂的肽的分離方法，包括制備能表達降鈣素或降鈣素相關基因的細胞的一種含水提取物;分離該含水提取物以富集分子量約小于15000的多肽;和用疏水層析和/或陰離子交換層析分離富集組分，以從該富集組分中分離該肽。
8.權利要求7的方法，其特征為含水提取物的分離步驟包括該含水提取物的反相高效液相層析和凝膠過濾。
9.一種分離的DNA順序，它具有如下特征為36-180個堿基對;和編碼權利要求1-6中的任一種肽。
10.一種用表達載體轉染或轉化的宿主細胞，該表達載體含有以可操作方式連接于編碼權利要求1-6中的任一種肽的DNA順序的轉錄啟動子。
11.權利要求10的宿主細胞，其特征為該宿主細胞是一種酵母細胞。
12.一種刺激成骨細胞和前成骨細胞的細胞分裂的肽的制造方法，包括在合適的條件下，培養(yǎng)權利要求10或11的宿主細胞，和從該宿主細胞中分離肽。
13.一種治療組合物，它含有權利要求1-6的任一種肽和與肽混合的一種生理上可接受的載體或稀釋劑。
14.權利要求13的治療組合物，它進一步包含一種生長因子，其量足以使成骨細胞和前成骨細胞中的DNA合成進一步增加，其特征為該生長因子選自由下列構成的一組胰島素、類胰島素生長因子、血小板衍生的生長因子、轉化生長因子α、轉化生長因子β和表皮生長因子。
15.權利要求13的治療組合物，它進一步包含類胰島素生長因子I，其量足以使成骨細胞和前成骨細胞中的DNA合成進一步增加。
全文摘要
本發(fā)明公開了刺激成骨細胞和前成骨細胞增生的多肽。本發(fā)明還公開了該多肽的分離方法或通過采用重組DNA技術制造該多肽的方法。該多肽可用于治療組合物中，尤其可用于促進病人骨的生長。
文檔編號C12N15/09GK1040221SQ8910441
公開日1990年3月7日 申請日期1989年5月3日 優(yōu)先權日1988年5月3日
發(fā)明者伯綱德·A·羅斯, 多哥拉斯·M·布恩, 蓋·A·赫華德, 加利·L·麥克耐特 申請人:華盛頓大學董事會, 津莫吉尼蒂克斯公司