專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人腎細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
促紅細(xì)胞生成素，(英文名Erythroporetin，簡(jiǎn)稱(chēng)EPO)是腎臟分泌的一種酸性糖蛋白激素，具有促進(jìn)紅細(xì)胞樣干細(xì)胞分化，起始血紅蛋白合成，刺激幼紅系祖細(xì)胞增殖等功能，是紅細(xì)胞生成的重要調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是治療慢性腎衰病人貧血癥的重要藥物，是近年來(lái)腎病治療中的一大突破。但由于目前從人尿中提取EPO價(jià)格十分昂貴，用基因工程方法生產(chǎn)EPO尚未投放市場(chǎng)，據(jù)悉價(jià)格也十分昂貴，影響了它的廣泛應(yīng)用。
在已有技術(shù)中，美國(guó)Amegen公司和日本Chugai藥廠已先后通過(guò)基因工程手段在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)生產(chǎn)EPO，純度129000Iu/mg蛋白，并在美國(guó)得到將rEPO用于腎透析病人進(jìn)行臨床試驗(yàn)的許可，預(yù)期1990年產(chǎn)品可投放市場(chǎng)。歐洲瑞士、法國(guó)、意大利等國(guó)預(yù)期在1988年底將基因工程產(chǎn)品EPO投放市場(chǎng)。但至今國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)有正常人腎細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)EPO的報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明的目的是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)意外死亡人腎細(xì)胞大量生產(chǎn)EPO，再經(jīng)生化方法純化后，作為腎性貧血及其它貧血病人的治療用藥。
本發(fā)明的技術(shù)方案是，取意外死亡胎兒腎臟進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，從EPO分泌高峰期的換出液中經(jīng)phenyl-sepharose和DEAE纖維素分離純化得到一定比活的EPO。其制備流程為無(wú)菌取出腎臟，剔除腎孟，制成腎組織塊。
產(chǎn)品EPO的體外活性測(cè)定取骨髓細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，在35mm直徑的培養(yǎng)皿中加入1.2ml培養(yǎng)液(細(xì)胞2×105、胎牛血清20%、牛血清白蛋白1%、α-
基乙醇10-5M)，0.4ml待測(cè)樣品，甲基纖維素30%，培養(yǎng)皿置CO2培養(yǎng)箱中，溫度37℃孵育3天，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)整個(gè)培養(yǎng)皿，規(guī)定8個(gè)以上細(xì)胞組成的集落為一個(gè)紅系集落(CFU-E)與標(biāo)準(zhǔn)品集落數(shù)比較測(cè)出其活性單位，根據(jù)Folin-酚法測(cè)得蛋白濃度計(jì)算EPO的比活。
利用本發(fā)明所得EPO，保持了糖蛋白分子的完整性，含糖30%左右，比活15000-20000Iu/mg蛋白，體內(nèi)外均具高生物活性、無(wú)熱源、無(wú)過(guò)敏源、無(wú)毒性、一般藥理無(wú)不良反應(yīng)。且生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品價(jià)格便宜。
下面是本發(fā)明的實(shí)施例。
四月齡胎腎組織塊加入RPMI1640培養(yǎng)液在37℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，一星期換培養(yǎng)液兩次，收集分泌高峰期培養(yǎng)液1.2升對(duì)緩沖液A透析平衡，經(jīng)phenyl sephorose CL-4B層析，依次以緩沖液A、B、C洗脫，收集c峰，可得蛋白質(zhì)150mg左右比活為6600單位/mg蛋白，總活力為99萬(wàn)單位，將峰c對(duì)DEAE纖維素層析的起始緩沖液平衡，層析，收集PH6.5，0.25M NaCl，10mMPBS洗脫峰2，對(duì)蒸餾水透析后除菌，凍干，可得EPO 33毫克左右，比活為20000lu/mg蛋白，總活力為66萬(wàn)單位。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征是利用意外死亡人胎腎組織塊培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素，制備符合臨床應(yīng)用規(guī)格的促紅細(xì)胞生成素的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是人胎腎組織塊，加入RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集EPO分泌高峰期的培養(yǎng)液，對(duì)緩沖液A(PH6.8，4MNaCl，10mMPBS)透析平衡，經(jīng)phenylsephoroseCL-4B層析，依次以緩沖液A、B(PH7.1，0.5MNaCl，10mMPBS)C(20%乙醇，4M鹽酸胍，10mMPBS)洗脫，收集c峰，將峰c對(duì)DEAE纖維素層析的起始緩沖液(PH6.5，0.1MNaCl，10mMPBS)平衡，層析，用緩沖液(PH6.5，0.25MNaCl，10mMPBS)洗脫，收集該洗脫峰，對(duì)蒸餾水透析后除菌，凍干。
全文摘要
本發(fā)明屬于人腎細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明的目的是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)意外死亡人腎細(xì)胞大量生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素(EPO)，再經(jīng)生化方法純化后，作為腎性貧血及其它貧血病人的治療用藥。本發(fā)明的技術(shù)特征是取意外死亡胎兒腎臟進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，從EPO分泌高峰期的換出液中經(jīng)phenyl-sepharose和DEAE纖維素分離純化得到一定比活的EPO。
文檔編號(hào)C12N5/22GK1044496SQ8910538
公開(kāi)日1990年8月8日 申請(qǐng)日期1989年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1989年1月19日
發(fā)明者金以豐, 張鶴云, 朱家珍, 湯國(guó)枝, 李敏薏 申請(qǐng)人:南京大學(xué)