專利名稱：用嗜酸鏈霉菌生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用嗜酸鏈霉菌(Streptomyces acidophilus)生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的方法，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
1965年Tsumura(津村)Takasaki(高崎)等分別發(fā)現(xiàn)了適于工業(yè)生產(chǎn)的葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)生菌種-暗色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces phaeochromogenes)和白色鏈霉菌(Streptomyces albus)。
1970年以來(lái)，我國(guó)對(duì)玫瑰暗黃鏈霉菌Kc-13，玫瑰紅鏈霉菌336，嗜熱放線菌M1033以及米蘇里游動(dòng)放線菌等生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的條件、人工誘變育種和固定化技術(shù)作了研究。
張樹(shù)政主編“酶制劑工業(yè)”(科學(xué)出版社，1984)一書(shū)中，特別是其中由胡學(xué)智編寫(xiě)的第十一章“葡萄糖異構(gòu)酶”已對(duì)當(dāng)前國(guó)內(nèi)外這一領(lǐng)域的工業(yè)生產(chǎn)包括菌種、發(fā)酵工藝、固定化技術(shù)、檢測(cè)方法等進(jìn)展做了詳述。
1984年Song H.Bok等報(bào)道從嗜酸性鏈霉菌(Acidophilic strep tomyces)耐酸鏈霉菌(Streptomyces acidodurans)篩選葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)生菌的方法(Appl.Environ.Microbiol.471213-1215，1984;U.S.patent 4，399，222，1983)。
本發(fā)明是一種用嗜酸鏈霉菌生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的方法，其目的在于用我們分離獲得的嗜酸鏈霉菌菌種，通過(guò)發(fā)酵及固定化工藝制備葡萄糖異構(gòu)酶制劑。本發(fā)明包括(1)依據(jù)pH值分段模式從土壤中分離嗜酸鏈霉菌，對(duì)于能夠在pH5乃至pH4培養(yǎng)基上生長(zhǎng)之菌株進(jìn)行分析鑒別篩選出葡萄糖異構(gòu)酶產(chǎn)生菌株。(2)經(jīng)純化的產(chǎn)酶菌株，在適宜培養(yǎng)條件下，依次經(jīng)斜面孢子，搖瓶種子逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)于含有適當(dāng)碳源、氮源的接種培養(yǎng)基上，使種子生長(zhǎng)旺盛。(3)生長(zhǎng)良好的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在控制條件下進(jìn)行發(fā)酵，從中收獲葡萄糖異構(gòu)酶，該酶經(jīng)固定化后用于制備高果糖漿。
本發(fā)明中產(chǎn)生葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌與其它已知的產(chǎn)生異構(gòu)酶鏈霉菌迥然不同之處在于其原始菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的培養(yǎng)基應(yīng)保持在pH5.2以下，甚至低達(dá)pH4.0。其中一些產(chǎn)酶菌株，經(jīng)過(guò)系列人工誘變之后，其適應(yīng)pH范圍為5.5-7.0。
凡在pH4.8培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，又在pH4.0培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，從中篩選酶活較高者。測(cè)定酶活的方法為間苯二酚法，初篩時(shí)做定性測(cè)定，復(fù)篩時(shí)做定量測(cè)定。最終由高壓液相色譜分析測(cè)定酶活。
最初分離出的原始菌株，酶活高的可達(dá)5，000國(guó)際單位/升，經(jīng)過(guò)一系列人工誘變和發(fā)酵工藝方面的改進(jìn)，酶活提高到20，000國(guó)際單位/升。
下面為本發(fā)明產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的嗜酸鏈霉菌株(Streptomyces acidophilus 10-168)CGMCC No.0142的微生物學(xué)特征。
1、形態(tài)學(xué)特征察氏培養(yǎng)基菌絲體生長(zhǎng)迅速，并產(chǎn)生分枝，氣生菌絲為白色，基絲由白色漸變?yōu)辄S灰色。兩周后氣絲由頂端開(kāi)始斷裂，形成灰色孢子，形狀橢園形，孢子絲彎曲，呈波浪狀，菌落表面皺褶，邊緣整齊。
高氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)較弱，氣生菌絲為白色，基內(nèi)菌絲灰色，無(wú)可溶性色素產(chǎn)生，菌落表面絨狀，邊緣整齊，呈同心園狀，兩周后，菌落中心凹下，菌落表面皺褶，中央灰色，孢子呈灰色，橢園形至園形。
2、培養(yǎng)特征(1)淀粉瓊脂生長(zhǎng)較弱，氣絲白色，基絲由白色至淺灰色，未觀察到可溶性色素。
(2)馬鈴薯浸汁生長(zhǎng)良好，氣絲由白色漸變?yōu)榛疑?，基絲褐色，觀察到褐色可溶性色素。
(3)馬鈴薯塊生長(zhǎng)良好，氣絲由白色至灰色，基絲褐色，產(chǎn)生褐色可溶性色素。
(4)Emerson培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好，氣絲由白至灰色，基絲為褐色，產(chǎn)生大量深褐色可溶性色素。
3、生理特征(1)生長(zhǎng)溫度范圍(采用酵母-麥芽浸汁瓊脂培養(yǎng)基)可生長(zhǎng)溫度為18-38℃最適宜溫度為28-32℃(2)淀粉水解瓊脂產(chǎn)生淀粉酶，可以水解利用淀粉。
(3)明膠的液化作用陽(yáng)性。
(4)脫脂奶的凝結(jié)和胨化作用有胨化現(xiàn)象。
(5)纖維素利用可分解利用纖維素，并有少量褐色素產(chǎn)生。
(6)Tresner培養(yǎng)基在生長(zhǎng)過(guò)程中有H2S產(chǎn)生。
(7)碳源機(jī)用可利用淀粉、葡萄糖、木糖、蔗糖、檸檬酸、麥芽糖、麩皮浸漬液、馬鈴薯浸汁、落葉松木屑水解液。
此外，嗜酸鏈霉菌所需氮源營(yíng)養(yǎng)成分種類范圍很寬。
有機(jī)氮源黃豆粉、黃豆餅粉、黃豆餅粉水解液、蛋白胨、玉米漿、酵母膏、牛肉膏、麥芽浸汁、蠶蛹粉。
無(wú)機(jī)氮源硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、氫氧化銨、磷酸銨、醋酸銨。
嗜酸鏈霉菌其生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的溫度范圍在24-36℃之間，較適宜的溫度為27-33℃，其中以30-32℃為最適溫度。
發(fā)酵時(shí)間依據(jù)菌種及培養(yǎng)基種類而變化，在本發(fā)明菌種試驗(yàn)范圍為24-96小時(shí)，其中比較適宜時(shí)間為24-60小時(shí)，以36-56小時(shí)為最適發(fā)酵時(shí)間。過(guò)度延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間會(huì)導(dǎo)致酶活下降，菌絲斷裂和自溶，為后工序一固定化工藝造成困難。當(dāng)發(fā)酵周期超過(guò)48小時(shí)，碳源以分次加入對(duì)產(chǎn)酶較為有利。
現(xiàn)在，本發(fā)明將在有關(guān)實(shí)施例中進(jìn)一步予以詳細(xì)說(shuō)明，但是，應(yīng)該理解到本發(fā)明決不只限于這些特殊實(shí)施例。
例1從石家莊效區(qū)玉米地土壤中(pH6.4)采取土樣，在無(wú)菌操作條件下，將土樣稀釋至滅菌無(wú)離子水中，在搖瓶機(jī)上振蕩1小時(shí)，然后接種于如下分離培養(yǎng)基上(克/100毫升)淀粉 2.0KNO30.1K2HPO40.05NaCl 0.05MgSO4·7H2O 0.05FeSO4·7H2O 0.001
瓊脂 1.8pH 6.5用無(wú)離子水配制。
將于pH6.5分離培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，再接種于pH4.8分離培養(yǎng)基上，將長(zhǎng)出的菌落再轉(zhuǎn)接于pH4.0分離培養(yǎng)基上。
pH4.0分離培養(yǎng)基成分(克/100毫升)淀粉 2.0NaNO30.1K2HPO40.05NaCl 0.05MgSO4·7H2O 0.05FeSO4·7H2O 0.001瓊脂 1.8用無(wú)離子水配制。
在一批分離獲得的228個(gè)菌株中統(tǒng)計(jì)其生長(zhǎng)率為1.3%。從多批分離菌株中篩選出S10-168，S10-170，S13-219等酶活較高的菌株。在分離培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為1周。將生長(zhǎng)于平皿的菌落分別挑選移植到斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4-6天，挖塊接種到搖瓶種子培養(yǎng)基中，再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。以上三株菌均達(dá)到5，000國(guó)際單位/升水平。
例2將S10-168菌種經(jīng)過(guò)多次純化后培養(yǎng)在下述斜面孢子培養(yǎng)基上(克/100毫升)
麥芽浸漬物 0.3酵母膏 0.4NaCl 0.5MgSO4·7H2o 0.05CoCl2·6H2o 0.001瓊脂 2.0pH 5.830℃培養(yǎng)4天后，將斜面孢子挖塊接種到搖瓶種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24-36小時(shí)，其成分為(克/100毫升)黃豆餅粉 1.5(NH4)2SO40.5葡萄糖 2.0KH2PO40.04NaCl 0.5pH 6.4將生長(zhǎng)稠厚的搖瓶種子以5%接種量(體積/體積)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分(克/100毫升)玉米漿 2.0檸檬酸 0.2K2HPO40.5(NH4)2SO40.5NaCl 0.5MgSO4·7H2O 0.05
D-木糖 0.40pH 6.8接種后，于30℃，在搖瓶機(jī)(G-25型，N.B.S.公司產(chǎn)品)上，300轉(zhuǎn)/分，振蕩培養(yǎng)48-56小時(shí)，酶活達(dá)15，000國(guó)際單位/升。
例3嗜酸鏈霉菌的原始菌株S10-168在初篩階段表現(xiàn)出穩(wěn)定的酶活，所以以此為出發(fā)菌株進(jìn)行系統(tǒng)誘變育種。
其方法是將原始菌株的斜面孢子，首先挖取一小塊(約為斜面孢子的1/5)接種到搖瓶種子及發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)及發(fā)酵，當(dāng)酶活超過(guò)對(duì)照組時(shí)，即以此斜面孢子為誘變育種的出發(fā)材料。
將經(jīng)過(guò)檢測(cè)酶活的斜面孢子用接種針輕輕刮下，將孢子懸浮于無(wú)菌蒸餾水中，用30W紫外燈，照射距離為35厘米，照射時(shí)間1-3分鐘，然后涂布于分離平皿上，再挑選不同類型菌落接種于斜面孢子培養(yǎng)基上。
存活率在10%-15%，涂布密度以在每個(gè)培養(yǎng)皿上50-100個(gè)菌落為宜。將挑選的單個(gè)菌落分別接種于斜面培養(yǎng)基上，一一進(jìn)行測(cè)試，從中篩選出酶活較高的嗜酸鏈霉菌菌株。
將嗜酸鏈霉菌的菌種，經(jīng)配方為3%葡萄糖，2%黃豆餅粉，0.6%(NH4)2SO4，0.05%KH2PO4，0.5%NaCl的種子培養(yǎng)基(30毫升裝入150毫升三角瓶中)，于300轉(zhuǎn)/分搖瓶機(jī)上，30℃培養(yǎng)36-48小時(shí)，再經(jīng)配方為0.2%檸檬酸鈉，0.5%(NH4)2SO4，0.5%NaCl，0.5%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.01%CoCl2·6H2O，0.001%FeSO4·7H2O，4%土豆浸汁(將土豆4克在100毫升水中煮沸30分鐘，濾去渣子備用)，2%麩皮浸漬液，1.0%玉米漿，于pH6.8，在300轉(zhuǎn)/分搖瓶機(jī)上，30℃培養(yǎng)48-56小時(shí)，收獲菌絲體，測(cè)定酶活可達(dá)20，000國(guó)際單位/升。
例4嗜酸鏈霉菌種(S.10-168 CGMCC No.0142)經(jīng)配方同例3的種子培養(yǎng)基，在300轉(zhuǎn)/分搖瓶機(jī)上，30℃培養(yǎng)36小時(shí)，再經(jīng)配方為0.2%檸檬酸鈉，0.5%(NH4)2SO4，0.5%NaCl，0.5%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.01%CoCl2·6H2O，0.001%FeSO4·7H2O，4%土豆浸汁，2%麩皮浸漬液，1.0%玉米漿，0.06%稀土化合物，pH6.8，(30毫升培養(yǎng)基裝入150毫升三角瓶中)，在300轉(zhuǎn)/分搖瓶機(jī)上，30℃發(fā)酵56小時(shí)，測(cè)定酶活達(dá)22，500國(guó)際單位/升。
＊葡萄糖異構(gòu)酶國(guó)際單位(G.I.U.)在pH6.6，65℃反應(yīng)條件下，1分鐘能轉(zhuǎn)化生成1微克分子果糖的酶量，定義為1葡萄糖異構(gòu)酶國(guó)際單位。
＊實(shí)施例中培養(yǎng)基滅菌條件蒸汽壓為0.8-1.0公斤/平方厘米，30分鐘。
權(quán)利要求
1.一種用嗜酸鏈霉菌生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的方法，它包括(1)依據(jù)pH值分段模式從土壤中分離嗜酸鏈霉菌，對(duì)分離出的菌株進(jìn)行分析鑒別，在含有適當(dāng)碳、氮源分離培養(yǎng)基上篩選出產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的原始菌株。這些菌株在pH低于5.2條件下培養(yǎng)并產(chǎn)生葡萄糖異構(gòu)酶。(2)經(jīng)純化的產(chǎn)酶菌株，在適宜培養(yǎng)條件下，依次經(jīng)斜面孢子，搖瓶種子逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)于含有適當(dāng)碳源、氮源的培養(yǎng)基上，使種子生長(zhǎng)旺盛。(3)生長(zhǎng)良好的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入含有適當(dāng)碳、氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在控制條件下進(jìn)行發(fā)酵并從中收獲葡萄糖異構(gòu)酶，該酶經(jīng)固定化后用于制備高果糖漿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1嗜酸鏈霉菌包括從土壤中分離獲得的原始菌株及經(jīng)過(guò)理化因子處理的人工誘變菌株。其特征在于所說(shuō)的嗜酸鏈霉菌是寄存在中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，寄存號(hào)為CGMCC No.0142的嗜酸鏈霉菌(Streptomyces acidophilus 10-168)。所說(shuō)明菌其微生物學(xué)特征為(1)、形態(tài)學(xué)特征察氏培養(yǎng)基菌絲體生長(zhǎng)迅速，并產(chǎn)生分枝，氣生菌絲為白色，基絲由白色漸變?yōu)辄S灰色。兩周后氣絲由頂端開(kāi)始斷裂，形成灰色孢子，形狀橢園形，孢子絲彎曲，呈波浪狀，菌落表面皺褶，邊緣整齊。高氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)較弱，氣生菌絲為白色，基內(nèi)菌絲灰色，無(wú)可溶性色素產(chǎn)生，菌落表面絨狀，邊緣整齊，呈同心園狀，兩周后，菌落中心凹下，菌表面皺褶，中央灰色，孢子呈灰色，橢園形至園形。(2)、培養(yǎng)特征①淀粉瓊脂生長(zhǎng)較弱，氣絲白色，基絲由白色至淺灰色，未觀察到可溶性色素。②馬鈴薯浸汁生長(zhǎng)良好，氣絲由白色漸變?yōu)榛疑?，基絲褐色，觀察到褐色可溶性色素。③馬鈴薯塊生長(zhǎng)良好，氣絲由白色至灰色，基絲褐色，產(chǎn)生褐色可溶性色素。④Emerson培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好，氣絲由白色至灰色，基絲為褐色，產(chǎn)生大量深褐色可溶性色素。(3)、生理特征①生長(zhǎng)溫度范圍(采用酵母-麥芽浸汁瓊脂培養(yǎng)基)可生長(zhǎng)溫度為18-38℃最適宜溫度為28-32℃②淀粉水解作用產(chǎn)生淀粉酶，可以水解利用淀粉。③明膠的液化作用陽(yáng)性。④脫脂奶的凝結(jié)和胨化作用有胨化現(xiàn)象。⑤纖維素利用可分解利用纖維素，并有少量褐色素產(chǎn)生。⑥Tresner培養(yǎng)基在生長(zhǎng)過(guò)程中有H2S產(chǎn)生。⑦碳源利用可利用淀粉 葡萄糖、木糖、蔗糖、檸檬酸、麥芽糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)pH分段模式，是將從土壤中分離獲得的鏈霉菌，依據(jù)pH6.5，pH4.8，pH4.0依次遞降的模式，將于pH6.5分離培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落接種于pH4.8分離培養(yǎng)基上，依次再接種于pH4.0分離培養(yǎng)基上，從中選出嗜酸鏈霉菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所用的碳源為淀粉、葡萄糖、木糖、蔗糖、檸檬酸鹽、麥芽糖、麩皮浸漬液、馬鈴薯浸汁、落葉松木屑水解液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所用的氮源為有機(jī)氮源黃豆粉、黃豆餅粉、黃豆餅粉水解液、蛋白胨、玉米漿、酵母膏、牛肉膏、麥芽浸汁、蠶蛹粉。無(wú)機(jī)氮源硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、氫氧化銨、磷酸銨、醋酸銨。
6.根據(jù)權(quán)利要求1其中玉米漿需經(jīng)過(guò)氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH7.0-7.2，過(guò)濾除去沉淀。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)分離培養(yǎng)基成分為1.5-2.0%淀粉，0.1%NaNO3，0.05%K2HPO4，0.05%NaCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.001%FeSO4·7H2O，1.8-2.0%瓊脂，無(wú)離子水配制。pH3.5-4.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)斜面孢子培養(yǎng)基成分為0.25-0.40%麥芽浸漬物，0.3-0.5%酵母膏，0.5%NaCl 0.05%MgSO4·7H2O，0.001%CoCl2·6H2O，1.8-2.0%瓊脂，無(wú)離子水配制。pH5.2-6.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)搖瓶種子培養(yǎng)基成分為1.5-2.0%黃豆餅粉，0.4-0.6%(NH4)2SO4，1.5-3.0%葡萄糖0.04-0.06%KH2PO4，0.5%NaCl。pH5.5-6.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)發(fā)酵培養(yǎng)基成分為1.0-3.0%玉米漿，0.2-0.3%檸檬酸鹽，0.5-0.6%K2HPO4，0.4-0.6%(NH4)2SO4，0.5%NaCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.2-0.5%D木糖，3-6%馬鈴薯浸汁，1.5-2.5%麩皮浸漬液，pH5.8-6.8。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入稀土化合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11稀土化合物為以輕稀土為主的硝酸鹽及氯化物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11發(fā)酵培養(yǎng)基中稀土化合物的濃度為0.01-0.1%。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。嗜酸鏈霉菌(Streptomyces acidophilus)具有生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的潛力。本發(fā)明是依據(jù)pH值分段模式從土壤中分離篩選能產(chǎn)生葡萄糖異構(gòu)酶的嗜酸鏈霉菌。通過(guò)對(duì)原始菌株一系列人工誘變并結(jié)合種子制備工藝及發(fā)酵過(guò)程的控制以提高酶活水平的方法。嗜酸鏈霉菌最適pH值為4-6，在發(fā)酵過(guò)程中不易為細(xì)菌污染。嗜酸鏈霉菌發(fā)酵終結(jié)，選擇合適載體和固定化技術(shù)制備固定化葡萄糖異構(gòu)酶，用于生產(chǎn)高果糖漿。
文檔編號(hào)C12N9/92GK1050407SQ8910766
公開(kāi)日1991年4月3日 申請(qǐng)日期1989年10月10日 優(yōu)先權(quán)日1989年10月10日
發(fā)明者陸維新, 張紹鎮(zhèn), 靳慶生, 王忠秋, 王曉東, 田竹 申請(qǐng)人:河北省科學(xué)院生物研究所