專利名稱：溶菌酶生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及溶菌酶的生產(chǎn)方法，對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)。溶菌酶是專門溶解細(xì)菌的酶類。目前，溶菌酶的制備采用雞蛋清為原料，在生產(chǎn)過(guò)程中采用鹽析法或酒精沉淀除去蛋白，或用樹脂層析純化技術(shù)。因此，增加了脫鹽工序及在洗脫過(guò)程中將蛋清大量稀釋，使干燥時(shí)耗費(fèi)能源。
本發(fā)明以柞蠶蛹為原料，蠶蛹經(jīng)人工誘導(dǎo)提高溶菌酶的活力;加熱除蛋白，DEAE-纖維素層析分離，甲殼質(zhì)包裹的纖維素層析純化，真空干燥而成。溶菌酶得率高，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，纖維素層析可半自動(dòng)化調(diào)控，纖維素可再生使用。柞蠶蛹除提取溶菌酶外，還可生產(chǎn)大量有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)品，如蛹油、蛹蛋白等，其工藝互相銜接。
生產(chǎn)流程如框

圖1生產(chǎn)流程的實(shí)施一、柞蠶蛹的收集用活蛹繅絲后的蠶蛹，剔除死、破蛹體后供用;削繭蛹應(yīng)保持蛹體完好，受傷或損破者棄去。
二、人工誘導(dǎo)誘導(dǎo)方法有三種。
1、注射大腸桿菌菌種分別為E.coli K12D31或HB101，劑量為108菌/ml，每蛹注射50μl，注射后在25℃放置72小時(shí)以上供用。
2、熱空氣誘導(dǎo)將活蛹置50℃～55℃熱空氣箱中處理30～60分鐘，處理后在25℃放置48～72小時(shí)供用。
3、超聲波誘導(dǎo)將活蛹浸入流水中，用超聲波發(fā)生器處理，頻率20仟赫茲，功率150瓦，時(shí)間5-10分鐘。處理后在25℃放置72～96小時(shí)供用。
三、收集蛹血用刺輥將蛹體刺破，投入籃式離心機(jī)中，3000轉(zhuǎn)/分離心，收集蛹血，殘余蛹體供綜合利用。
四、蛹血除蛋白加入苯基硫脲0.02%～0.05%，水浴中快速拌攪加熱至60℃，并速冷至室溫，離心除去蛋白沉淀，收集清液即溶菌酶組分。剩余的蛹血?dú)堅(jiān)┚C合利用。
五、調(diào)整pH溶菌酶組分加入等體積0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液，攪拌均勻后進(jìn)行柱層析。
六、DEAE-纖維素柱層析DEAE-纖維素離子交換層析，按常規(guī)活化，裝柱。柱直徑與高比例為1∶10～12，柱內(nèi)先用堿性緩沖液使柱內(nèi)充分飽和，可選用0.1M，pH8.0磷酸鹽，將上述溶菌酶組分注入柱內(nèi)作離子交換，控制流速2ml/cm2·分鐘，用0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液洗脫溶菌酶組分。DEAE-纖維素柱回收蛹血蛋白后再生供用。
七、甲殼質(zhì)包裹纖維素柱層析甲殼質(zhì)包裹纖維素活化后裝柱，先用0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液將柱內(nèi)充分飽和后，再用無(wú)離子水洗至微堿性，將DEAE-纖維素柱層析后洗脫的溶菌酶組分注入甲殼質(zhì)包裹纖維素柱內(nèi)作親和層析，控制流速2ml/cm2·分鐘，待充分親和吸附后，用0.1M，pH2～2.5乙酸緩沖液洗脫溶菌酶組分，甲殼質(zhì)包裹纖維素再生供用。
八、真空濃縮、透析及干燥收集溶菌酶組分，在60℃600mmHg下用真空薄膜濃縮器濃縮到粘稠狀，移入透析袋中，在4℃下流水透析除去鹽分，內(nèi)容物在60℃600mmHg下真空干燥，即為溶菌酶制品。
實(shí)例一活柞蠶蛹1kg作原料，將大腸桿菌K12D31接種于液體LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g，加水至1升，pH7.2)中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)液，達(dá)到108菌/ml的水平，每蛹注射50μl，放置于25℃72小時(shí)。
蠶蛹穿刺后離心取蛹血，籃式離心機(jī)3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，收集蛹血約150ml。加入0.02%苯基硫脲，在水浴中攪拌加熱至60℃，速冷至室溫，離心3000轉(zhuǎn)/分鐘。10分鐘以除去蛋白，清液為溶菌酶組分。
溶菌酶組分中加入等體積0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液，用DEAE-纖維素柱層析，收集流出的溶菌酶組分，約250ml，用甲殼質(zhì)包裹纖維素作親和層析，柱內(nèi)用0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液飽和。吸附層析后，用0.1M，pH2.0～2.5乙酸鹽緩沖液洗脫，收集洗脫的溶菌酶組分，約150ml。
將溶菌酶組分在60℃600mmHg真空濃縮至粘稠狀，用半透膜透析去鹽，內(nèi)容物在60℃，600mmHg下抽干，即為成品，約100mg，酶活力達(dá)到20000單位/mg蛋白水平。
實(shí)例二活柞蠶蛹1kg作原料，將蠶蛹置52℃烘箱內(nèi)處理30分鐘，置25℃48小時(shí)。
蠶蛹穿刺后離心取蛹血，收集蛹血約150ml，加入0.02%苯基硫脲，在水溶中攪拌加熱至60℃，速冷至室溫，離心3000轉(zhuǎn)/分，10分鐘以除去蛋白，清液為溶菌酶組分。
溶菌酶組分中加入等體積0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液，用DEAE-纖維素離子交換柱層析，收集流出的溶菌酶組分，約250ml。
市售甲殼質(zhì)50g，用40%NaOH液充分浸泡，搗碎，37℃浸漬3小時(shí)，用水沖洗，抽濾以除去余堿，使轉(zhuǎn)化為去乙酰甲殼質(zhì)。在堿性(pH10)條件下，加入100g纖維素，充分拌攪，然后用冰乙酸調(diào)至酸性，使甲殼質(zhì)沉淀，水洗去余酸，用0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液浸泡，裝柱后將DEAE-纖維素洗脫的溶菌酶組分注入其中進(jìn)行親和層析，最后用0.1MpH2～2.5乙酸鹽緩沖液洗脫溶菌酶組分，約收集150ml。
將溶菌酶組分在60℃600mmHg真空濃縮至粘稠狀，用半透膜透析去鹽，內(nèi)容物在60℃600mmHg下抽干，即為成品，約得85mg，酶活力達(dá)到18000單位/mg，蛋白水平。
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權(quán)利要求
1.溶菌酶的生產(chǎn)方法其特征在于以削繭后完好的蠶蛹為原料，于蠶蛹中注射大腸桿菌E·ColiK12D31或HB101，劑量為108菌/ml，50μl/頭，在25℃下放置72小時(shí)以上，或?qū)⑿Q蛹置50～55℃熱空氣箱內(nèi)30～60分鐘，在25℃下放置48～72小時(shí)，或?qū)⑿Q蛹浸入流水中，用頻率20～22仟赫茲，功率150瓦超聲波處理5～10分鐘，于25℃放置72-96小時(shí)，將人工誘導(dǎo)后的蠶蛹刺破收集蛹血，蛹血中加入0.02～0.05%苯基硫脲，在水浴中快速攪拌加熱至60℃，速冷至室溫，離心除蛋白，上清液即溶菌酶組分，用0.1M磷酸鹽調(diào)整至pH8.0，將溶菌酶組分注入經(jīng)用堿性溶液充分飽和后的DEAF-纖維素柱內(nèi)作層析分離，離子交換完成后，用0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液洗脫溶菌酶組分并注入經(jīng)用0.1M，pH8.0磷酸鹽緩沖液充分飽和后，再用無(wú)離子水洗至微堿性(pH7.2)的甲殼質(zhì)包裹纖維素柱內(nèi)作親和層析，用0.1M，pH2～2.5乙酸鹽緩沖液洗脫溶菌酶組分，洗脫后的溶菌酶組分真空濃縮、干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的溶菌酶生產(chǎn)方法，其特征在于所說(shuō)的DEAE-纖維素柱，其園柱直徑與高度比例為1∶10～12，溶菌酶組分在園柱內(nèi)流速為2ml/cm2·分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所說(shuō)的溶菌酶生產(chǎn)方法，其特征在于所說(shuō)的溶菌酶濃縮條件，在60℃600mmHg下用真空薄膜濃縮器濃縮至粘稠狀，移入透析袋中，在4℃下用流水透析除去鹽分，內(nèi)容物在60℃600mmHg真空干燥。
全文摘要
一種以柞蠶蛹為原料生產(chǎn)溶菌酶的生產(chǎn)方法。柞蠶蛹含有豐富的溶菌酶，經(jīng)人工誘導(dǎo)后提高酶活力10倍以上。收集蛹血、加熱、直接用DEAE—纖維素及甲殼質(zhì)包裹纖維素柱層析，洗脫后真空濃縮，透析，真空干燥而得到產(chǎn)品，酶的回收率高。有關(guān)纖維素可再生使用，本方法的工藝可與蠶蛹綜合利用的其他工藝(如提取蛹蛋白等)相銜接。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1043740SQ8910880
公開日1990年7月11日 申請(qǐng)日期1989年11月22日 優(yōu)先權(quán)日1989年11月22日
發(fā)明者黃自然, 陳夙珍, 姚汝華, 呂建秋 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)