專利名稱：一種魔芋多糖固定化微生物細(xì)胞和酶的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物細(xì)胞和酶的固定化技術(shù)。
微生物細(xì)胞和酶的固定化是一項(xiàng)生物工程技術(shù)，以前的固定化方法，一般是用聚丙烯酰胺、瓊脂、明膠、K-菜膠、海藻酸鈣凝膠等載體包埋微生物和酶。但以往的固定化方法往往存在這樣或那樣的缺點(diǎn)，如資源貧乏，或價(jià)格昂貴、或單體有毒、或制作過(guò)程繁瑣，條件苛刻，或化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度差，限制其使用范圍，降低了使用效果和使用壽命。為了克服上述缺點(diǎn)，近年來(lái)，有人提出用魔芋多糖(葡甘露聚糖，簡(jiǎn)稱KGM)作載體固定化酶。日本沖增哲二人用魔芋精粉或以精粉純化得到的KGM為原料，使用濃度為0.3～3.0%，用堿調(diào)pH10～12，在室溫至80℃溫度范圍內(nèi)使其凝固成膠狀，破碎成粗粒，水洗至中性，用膠溶劑把凝膠溶化，中和，透析，過(guò)濾得溶液，加入酶，混合后凍干，或混合后加入乙醇、丙酮脫水，乙醚洗后，真空干燥得固定化酶(特公昭56～9119，1981，2，27);松元信也二人在含有糊化淀粉分解性和生淀粉分解性葡萄糖淀粉酶的酶液中浸漬KGM，然后從溶液中分離吸附了葡萄糖淀粉酶的葡甘露聚糖，用水洗后，風(fēng)干或噴霧干燥得固定化葡萄糖淀粉酶(特公昭59～98691，1984，4，7)。還有在精粉中加NaOH和丙烯酰胺，反應(yīng)后中和，稀釋，透析，再用甲醇、丙酮沉淀，再在沉淀物中加NaOH、次氯酸鈉進(jìn)行霍夫曼反應(yīng)，生成魔芋多糖的異氰酸脂，調(diào)pH9.8，加入堿性磷酸酶，凝膠化后水洗，丙酮脫水，真空干燥，得固定化堿性磷酸酶(日本魔芋協(xié)會(huì)研究報(bào)告書，1979年，15頁(yè))。
由此可見，上述方法在固定化過(guò)程中都要經(jīng)過(guò)透析、真空冷凍干燥或丙酮脫水干燥，實(shí)際操作很不方便，不便在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)。另外，未用于微生物細(xì)胞固定化。
本發(fā)明的目的就是為了解決上述方法中存在的缺點(diǎn)，用新的簡(jiǎn)便易行的方法，制備既可適用于酶的固定化，又可用于活的微生物細(xì)胞固定化，具有酶活高，機(jī)械強(qiáng)度好，化學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)良，抗酸抗堿，耐有機(jī)溶劑，外形規(guī)則，適于長(zhǎng)期使用和反復(fù)再生使用的固定化方法。
本發(fā)明采用魔芋精粉(主要含葡甘露聚糖)為原料，先在精粉中加入重量比為4∶0～1的聚乙烯醇，即魔芋精粉重量∶聚乙烯醇重量為4∶0～1，加水制成5～15%(W/V)的魔芋精粉堿性溶液(溶液中NaOH濃度達(dá)0.1N，使pH13～14)，放在沸水浴中煮30～60分鐘，令其膠凝硬化，再經(jīng)機(jī)械加工成一定形狀后于0～-30℃溫度范圍內(nèi)冷凍處理12～36小時(shí)，使其泡沫化，再置于30～60%(V/V)堿性乙醇溶液中，40～65℃浸泡處理10～24小時(shí)，水洗成中性。在固定微生物細(xì)胞和酶時(shí)，將上述已制好的載體在含有50～100mM對(duì)苯醌的溶液中，或0.5～2.5%(W/V)的四氯化鈦、四氯化錫溶液中，在室溫～65℃溫度范圍內(nèi)活化2～20小時(shí)，用水沖洗后，加需要固定化的微生物細(xì)胞或酶，進(jìn)行固定化。
本發(fā)明制備的不溶性微孔凝膠載體，根據(jù)需要可干燥保存，長(zhǎng)期備用;經(jīng)活化的載體可在4℃左右溫度下長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?。載體在0.5N強(qiáng)酸，0.5N強(qiáng)堿液中浸泡達(dá)一年無(wú)形變，在低溫到100℃下凝膠穩(wěn)定，在0.1～0.5M不同pH的各種緩沖液中長(zhǎng)期操作和在多種有機(jī)溶劑中長(zhǎng)期操作都很穩(wěn)定;在2000轉(zhuǎn)/分的速度搖瓶震蕩三個(gè)月凝膠無(wú)形變。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是載體無(wú)毒，原料來(lái)源豐富，價(jià)格便宜，制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，外型規(guī)則而有彈性，機(jī)械強(qiáng)度高，化學(xué)穩(wěn)定性好，能抗酸抗堿，耐壓耐溫，在各種pH的緩沖液中反復(fù)使用，微生物細(xì)胞和酶的固定化過(guò)程簡(jiǎn)單，固定化效果好。
本發(fā)明可廣泛用于食品、飲料、醫(yī)藥工業(yè)的微生物細(xì)胞和酶的固定，可改進(jìn)傳統(tǒng)工藝，提高生產(chǎn)率。
實(shí)施例例一將啤酒酵母按上述方法進(jìn)行固定化，在瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)增殖。酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)109個(gè)/ml載體時(shí)，進(jìn)行啤酒批式發(fā)酵，前酵由原來(lái)的7天縮短至1.5～2天，后酵由原來(lái)的22～30天縮短至11～14天。制品純正。
例二將釀酒酵母按上述方法進(jìn)行固定，置瓶?jī)?nèi)增殖，細(xì)胞數(shù)達(dá)0.8～2×109個(gè)/ml載體。用批式連續(xù)發(fā)酵300天，在15～30%糖濃度下，乙醇濃度達(dá)7.6～14%(V/V)，乙醇產(chǎn)率達(dá)20ml/l載體·小時(shí)。
例三將濃度為10mg蛋白/ml葡萄糖淀粉酶按上述方法固定化。酶蛋白結(jié)合量30～40mg/g載體，酶活性保持50%以上，45℃柱式連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)操作，半衰期151天，固定化酶在4℃左右貯存6個(gè)月，酶活力保持95%。
權(quán)利要求
1.用魔芋多糖(即魔芋精粉，主要含魔芋葡甘露聚糖KGM)作載體的微生物細(xì)胞和酶的固定化方法，其特征是，固定微生物細(xì)胞和酶的載體是由堿溶脹的魔芋精粉，經(jīng)沸煮、冷凍泡沫化和不溶性處理而制成的外型規(guī)則的各種凝膠，并經(jīng)對(duì)苯醌溶液或四氯化鈦、四氯化錫溶液作共價(jià)修飾固定化微生物細(xì)胞和酶。
2.按權(quán)利要求1所述的固定化微生物細(xì)胞和酶的方法，其特征是，作載體的魔芋多糖(魔芋精粉)在制成溶液前加入聚乙烯醇，魔芋精粉與聚乙烯醇重量比為4∶0～1，溶液濃度在5～15%(W/V)之間，堿溶脹是用0.1N NaOH，其pH為13～14。
3.按權(quán)利要求1或2所述的固定化微生物細(xì)胞和酶的方法，其特征是，所說(shuō)的泡沫化是用低溫冷凍法，溫度為0～-30℃，時(shí)間12～36小時(shí);不溶性處理是用堿性乙醇，乙醇濃度為30～60%(V/V)，堿濃度為0.05～0.25N，溫度為40～65℃，時(shí)間為10～24小時(shí)。
4.按權(quán)利要求2或3所述的固定化微生物細(xì)胞和酶的方法，其特征是，所說(shuō)的共價(jià)修飾所用對(duì)苯醌濃度為50～100mM，四氯化鈦、四氯化錫濃度為0.5～2.5%(W/V)，處理溫度為室溫～65℃，時(shí)間為2～20小時(shí)。
5.按權(quán)利要求4所述的固定化微生物細(xì)胞和酶的方法，其特征是，微孔凝膠的外型為方型、柱型、膜狀、顆?；蚍勰?br> 全文摘要
用魔芋多糖載體固定化微生物細(xì)胞和酶的方法，是以魔芋精粉為原料，經(jīng)堿溶脹，沸煮、冷凍泡沫化和不溶性處理，制備出各種外形的規(guī)則的微孔凝膠載體，并置于對(duì)苯醌溶液或四氯化鈦或四氯化錫溶液中經(jīng)共價(jià)修飾后固定微生物細(xì)胞和酶。它的特點(diǎn)是載體無(wú)毒、來(lái)源方便、價(jià)格便宜、載體制備工藝簡(jiǎn)單、外形規(guī)則而有彈性、機(jī)械強(qiáng)度高、化學(xué)穩(wěn)定性好、抗酸堿、耐壓耐溫，可在各種pH緩沖液中反復(fù)使用。微生物細(xì)胞和酶的固定化過(guò)程簡(jiǎn)單，效果好。
文檔編號(hào)C12N11/10GK1053089SQ89109710
公開日1991年7月17日 申請(qǐng)日期1989年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1989年12月30日
發(fā)明者陳家任, 賈成禹 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所