專利名稱：人體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是發(fā)明專利申請?zhí)?9108848·2的繼續(xù)，有些步驟方法等繼用前者專利所記。本發(fā)明涉及一種抗病毒干擾素的制造方法。
近年來在世界醫(yī)學(xué)發(fā)展中形成了一種新的干擾素學(xué)，它的研究已成為涉及病毒學(xué)、分子生物學(xué)、腫瘤學(xué)和免疫學(xué)等許多學(xué)科的一門新興邊緣科學(xué)。
干擾素是一類高活性、多功能的誘生蛋白，用于臨床治療常用的有兩類一類是“自然干擾素”(h jFN);另一類是“重組干素”(yiFN)。臨床已證實(shí)干擾素具有抗腫瘤、抗病毒的作用。
目前研究和使用的干擾素是在人體外誘導(dǎo)制造的，它的生產(chǎn)是利用正常人的血分離白細(xì)胞，進(jìn)行人體外誘導(dǎo)產(chǎn)生一種人白細(xì)胞干擾素。這種干擾素制造工藝復(fù)雜、設(shè)備多，需用大量健康人的血。收集來的血如有某種傳染病，制成的干擾素用于病人必會(huì)招來新的疾病，而且這樣制成的干擾素效價(jià)低，在病人血液中濃度低，治療病毒感染和腫瘤效果不滿意。成本高、價(jià)格貴、社會(huì)效益差。
本發(fā)明的任務(wù)是克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足而提供一種人體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素的制造方法，用這種方法可在人體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素，不經(jīng)取出即可生產(chǎn)作用而治療病毒疾病和腫瘤疾病。
國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索尚未發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素及其制造方法。
本發(fā)明是將對(duì)人無易感性的新城雞瘟弱活病毒(NDV)作誘導(dǎo)劑，給乙肝等病毒所引起的病人，每天肌肉注射NDV即可在人體內(nèi)產(chǎn)生大量的干擾素從而治療病毒所引起的乙型肝炎等疾病。
根據(jù)本發(fā)明的方法，每天給病人注射2-8mNDV。
根據(jù)本發(fā)明的方法，誘導(dǎo)劑NDV必須大量增殖，其增殖方法是將貯存的誘導(dǎo)劑(NDV)用PH7.5PBS緩沖劑將血凝效價(jià)為320HA/ml、640HA/ml、1280HA/ml、2560HA/ml、稀釋5-20倍。在無菌條件下，接種于9-11日齡雞胚胚尿囊中，每個(gè)雞胚種植稀釋液0.2ml，繼續(xù)孵化48-72小時(shí)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，誘導(dǎo)劑(NDV)在需用時(shí)必須是一次快速融解，即在20±1℃溫水溶，不斷搖動(dòng)一次性融解誘導(dǎo)劑(NDV)。
根據(jù)本發(fā)明的方法在效價(jià)1280HA/ml以上的誘導(dǎo)劑，每毫升必須加入保護(hù)劑核酸酶(DNaSe200μg、RNaSe100μg)和人蛋白200μg。
實(shí)施例選用三代F系、效價(jià)為320HA/ml新城雞瘟弱病毒為人體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素的誘導(dǎo)劑。
將上述誘導(dǎo)劑(NDV)活化后，用0.85%鹽水或PH7.5磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)稀釋成20-30倍，每只雞胚用稀釋液0.2ml接種于9-11日齡雞胚尿囊內(nèi)，繼續(xù)孵化48-72小時(shí)。然后放入4℃冰箱內(nèi)12小時(shí)凍死，無菌條件下收獲尿囊液，測定血凝效價(jià)，作無菌試驗(yàn)陰性者，貯存為大量增殖用。
為供應(yīng)臨床誘導(dǎo)劑(NDV)必須大量增殖，其增殖方法有二種。①雞胚尿囊培養(yǎng)法將貯存的誘導(dǎo)劑(NDV)用7.5PBS緩沖劑將血凝效價(jià)為320HA/ml、640HA/ml、1280HA/ml、2560HA/ml稀釋5-20倍，在無菌條件下，接種于9～11日齡雞胚尿囊中，每個(gè)雞胚種植稀釋液0.2ml繼續(xù)孵化48-72小時(shí)，讓誘導(dǎo)劑充分增殖。②雞胚單層原代細(xì)胞培養(yǎng)法在無菌的條件下，采取9～10日齡雞胚。置于無菌平皿中，除去頭(或只除去嘴和眼)、爪和內(nèi)臟后，將其剪成直徑3-4毫米的組織塊，并用HahKS或其它洗液充分沖洗，放入無菌的50毫升注射器筒內(nèi)，不裝針頭，塞入筒芯，用力將雞胚組織壓入另一無菌玻璃瓶內(nèi)，再用HahKS液沖洗兩次，吸棄上清液，于沉淀組織塊內(nèi)加入約4倍量的0.25%胰酶，并調(diào)整PH值至7.6-7.8，振蕩搖勻后置于37℃水洛感作30分鐘，每10分鐘輕輕搖一次，取出后小心吸棄上層胰酶溶液，用HahKS輕洗兩次后，即在洗液內(nèi)大口吸管吹打數(shù)次或數(shù)十次，此時(shí)即見大量細(xì)胞游離、液體變渾，經(jīng)用雙層細(xì)亞麻布或72孔不銹鋼紗網(wǎng)過濾，收集于離心瓶(管)中，以每分鐘600轉(zhuǎn)的速度離心沉淀5-10分鐘，吸棄上清液，按每個(gè)雞胚加入5毫升的營養(yǎng)液，并用吸管充分吹打，直至形成均勻的細(xì)胞懸液，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，再用營養(yǎng)液將細(xì)胞懸液進(jìn)一步稀釋為每毫升50萬個(gè)細(xì)胞的濃度，即可裝瓶培養(yǎng)。每1000毫升溶量長方形培養(yǎng)瓶裝100ml，置于36-37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)，雞胚細(xì)胞在1-2小時(shí)內(nèi)貼壁，幾小時(shí)至十幾小時(shí)后開始生長，24-48小時(shí)長成單層，此時(shí)更換維持液接種誘導(dǎo)劑(NDV)，每個(gè)瓶內(nèi)接種稀釋液0.5ml繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，收獲備用。
收獲的誘導(dǎo)劑(NDV)經(jīng)無菌檢查陰性，血凝效價(jià)為1280HA/ml以上，病毒滴度lOgEID508以上，即可在-30℃以下保存。
需用時(shí)，在無菌條件下，一切用品經(jīng)過除熱原處理，快速20±1℃溫水溶，不斷搖動(dòng)一次性融解誘導(dǎo)劑(NDV)，待完全融解后，經(jīng)過封閉式雙層府綢袋和0.22μ微孔濾膜的濾菌器除去雞胚尿囊液或雞胚組織營養(yǎng)液的雜質(zhì)、蛋白、細(xì)菌及部分尿酸鹽。
經(jīng)過濾過的誘導(dǎo)劑(NDV)每毫升加入保護(hù)劑核酸酶(DNaSe200μg、RNaSe100μg)和人蛋白200μg，無菌灌封安瓿，或制成凍干制劑，供臨床用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)不用其他健康人的血，避免上述他人血中有某種傳染病而導(dǎo)致新的疾病。
(2)制成的人體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素制造工藝簡單、成本低廉。
(3)通過上述方法制造的人體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素為三種干擾素①人白細(xì)胞干擾素;②人成纖維細(xì)胞干擾素;③人類淋巴細(xì)胞干擾素。
(4)生產(chǎn)的干擾素在人血中濃度高、療效高。
權(quán)利要求
1.一種人體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素的制造方法，其特征在于該方法制造干擾素是將對(duì)人無易感性的新城雞瘟弱活病毒作誘導(dǎo)劑(NDV)，每天給病毒引起的病人進(jìn)行肌肉注射而在人體內(nèi)產(chǎn)生的。
2.如權(quán)利要求1所述的人體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素的制造方法，其特征在于每天給病毒引起的病人注射2-8毫升。
3.如權(quán)利要求1所述的人體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素的制造方法，其特征在于誘導(dǎo)劑(NDV)必須大量增殖，方法是將貯存的誘導(dǎo)劑(NDV)用PH7.5 PBS緩沖劑，將血凝效價(jià)為320HA/ml、640HA/ml、1280HAml、2560HA/ml稀釋5-20倍，在無菌條件下，接種于9-11日齡雞胚尿囊中，每個(gè)雞胚種植稀釋液0.2ml，繼續(xù)孵化48-72小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述的人體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素的制造方法，其特征在于誘導(dǎo)劑(NDV)在需用時(shí)，必須是一次性快速融解，即在20±1℃溫水溶上，不斷搖動(dòng)一次性融解誘導(dǎo)劑。
5.如權(quán)利要求1所述的人體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素的制造方法，其特征在于在效價(jià)1280HA/ml以上的誘導(dǎo)劑(NDV)每毫升必須加入保護(hù)劑核酸酶DNaSe200μg。RNa100μg)和人蛋白200μg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人體內(nèi)誘導(dǎo)干擾素的制造方法。它是將對(duì)人無易感性的新城雞瘟弱活病毒(NDV)作誘導(dǎo)劑，每天給病人肌肉注射一定量的誘導(dǎo)劑(NDV)即可不斷的在人體內(nèi)產(chǎn)生大量的三種干擾素(人白細(xì)胞干擾素、人成纖維干擾素、人淋巴細(xì)胞干擾素)。增加了干擾素的種類和活性，擴(kuò)大了抗病毒的范圍，療效好，且無明顯的副作用。
文檔編號(hào)C12N7/01GK1054192SQ9010103
公開日1991年9月4日 申請日期1990年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1990年2月26日
發(fā)明者張炳團(tuán) 申請人:張炳團(tuán)