專利名稱：提高了熱酸和/或堿穩(wěn)定性的突變微生物α淀粉酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域并提供了新的DNA分子，該分子含有編碼有α淀粉酶活性酶的DNA順序。具體地說(shuō)，即公開(kāi)了有改善了在降解淀粉、紡織物脫漿及其他工業(yè)加工中之應(yīng)用特性的突變型微生物α淀粉酶。所公開(kāi)的α淀粉酶顯示增加了對(duì)熱、酸和堿的穩(wěn)定性，使之能適于在迄今尚未使用過(guò)的工藝條件下完成其功能活性。
淀粉由直鏈淀粉(15-30%W/W)和支鏈淀粉(70-85%W/W)的混合物組成。直鏈淀粉由分子量約為60，000到800，000、以α-1，4鍵連接之葡萄糖單位的線性鏈組成。支鏈淀粉則是在每24-30個(gè)葡萄糖單位上含有α-1，6分支點(diǎn)的分支聚合物，其分子最可高至100×106。
目前用酶催化法由淀粉生產(chǎn)濃縮右旋糖漿形式的糖包括(1)用α淀粉酶將固態(tài)淀粉液化成平均聚合度約7-10的糊精，(2)用淀粉葡糖苷酶(也稱葡糖淀粉酶或AG)使所得的已液化淀粉(即淀粉水解物)糖化。所得糖漿有高葡萄糖含量。商業(yè)上生產(chǎn)的大多數(shù)葡萄糖糖漿均被酶促異構(gòu)化成右旋糖/果糖混合物(即所謂異構(gòu)糖漿)。
α淀粉酶(EC3，2，1，1)借助隨機(jī)裂解內(nèi)部α-1，4-葡糖苷鍵而水解淀粉、糖原和相關(guān)的多糖。該酶具有許多重要的工業(yè)用途，如用于制糖、釀造、酒精及紡織工業(yè)。α淀粉酶是從多種細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源分離的。工業(yè)上最重要的α淀粉酶是從細(xì)菌中分離的。
在淀粉降解工藝的第一個(gè)步驟中，是于相對(duì)高溫度高達(dá)110℃下加熱使淀粉漿凝膠化。接下來(lái)的兩個(gè)連續(xù)步驟是用熱穩(wěn)定的α淀粉酶使凝膠化的淀粉液化及糊精化。主要的工藝變量是淀粉濃度、α淀粉酶劑量、溫度及pH。在液化-糊精化反應(yīng)中，工藝變量必須保持在很窄的范圍內(nèi)，以達(dá)到良好轉(zhuǎn)化率，因?yàn)榉駝t會(huì)引起嚴(yán)重的過(guò)濾問(wèn)題(參見(jiàn)L.E.Coker and K.Venkatasubramanian，Biotechnology，P.165-171，Ed.P.N.Cheremisinoff，P.B.Quellette，Technicom.Publ.Corp.Lancaster Renn.1985)。在降解過(guò)程初始階段常常遇到的一個(gè)問(wèn)題是適當(dāng)調(diào)節(jié)溫度的問(wèn)題過(guò)度加熱常常造成α淀粉酶變性，使最終的稀薄度不足。為避免這一問(wèn)題，一個(gè)辦法是使用對(duì)熱更為穩(wěn)定的α淀粉酶。
為此目的，已提出加入鈣離子或兩親性離子(如參見(jiàn)EP-A-0189838)，但這一辦法似乎也不能令人滿意。
因此，仍要試圖提供一種提高了熱穩(wěn)定性的α淀粉酶。
EP-A-057976描述了從脂肪嗜熱桿菌(B.stearother-mophilus)中分離編碼熱穩(wěn)定性α淀粉酶的基因，將該基因克隆到含有芽孢桿菌或大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn)的質(zhì)粒中。為得到用以生產(chǎn)α淀粉酶的嵌合質(zhì)粒，而分離并不加修飾地使用了α淀粉酶基因。
EP-A-0134048描述了α淀粉酶本身之商業(yè)化生產(chǎn)的方法，特征是克隆并在工業(yè)芽孢桿菌菌株中表達(dá)一個(gè)或多個(gè)α淀粉酶基因。
EP-A-252666描述了結(jié)構(gòu)通式為Q-R-L的嵌合α淀粉酶，其中Q是有55-60個(gè)氨基酸殘基的N末端多肽，其至少有75%同源于淀粉液化桿菌(B.amyloliquefaciens)α淀粉酶的37個(gè)N末端殘基，R是已知的多肽，L是有390至400個(gè)氨基酸殘基的C末端多肽，其至少有75%同源于地衣形芽孢桿菌(B.licheniformis)α淀粉酶的395個(gè)C末端殘基。
Gray等人(J.Bacteriol.，1986，166，635)描述了由脂肪嗜熱芽孢桿菌α淀粉酶之NH2末端部分和地衣形芽孢桿菌α淀粉酶之COOH末端部分形成的嵌合α淀粉酶。大多數(shù)雜合酶分子都顯示比親代野生型酶的穩(wěn)定性差。另外，所有已知的雜合分子都不具有改善的穩(wěn)定性。
上面列出的文獻(xiàn)都沒(méi)有述及通過(guò)單個(gè)氨基酸置換來(lái)得到新的α淀粉酶。
EP-A-0285123公開(kāi)了核酸順序完全誘變的方法。其中作為例子描述了脂肪嗜熱芽孢桿菌α淀粉酶的誘變。雖然其中提到可用該方法得到改善了穩(wěn)定性的脂肪嗜熱芽孢桿菌突變株，但沒(méi)有給出有關(guān)實(shí)施例。
本發(fā)明提供了突變的α淀粉酶及得到該突變型的方法。所說(shuō)的突變型α淀粉酶的特征在于，它們至少有一個(gè)氨基酸不同于野生型酶。此外，還提供了編碼這些突變型的DNA，含有這些可表達(dá)之DNA的載體及含有這些載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的一個(gè)方面公開(kāi)了對(duì)已克隆的α淀粉酶基因的隨機(jī)誘變。使用適當(dāng)?shù)妮d體系統(tǒng)在適當(dāng)宿主微生物中表達(dá)突變的基因。
本發(fā)明的另一個(gè)方面描述并應(yīng)用了篩選突變型α淀粉酶的方法。所說(shuō)的方法可得到對(duì)熱和酸更為穩(wěn)定的α淀粉酶。此外，使用該方法稍加修飾而得到對(duì)堿更穩(wěn)定的α淀粉酶。然后可分離并純化得到如此確定的克隆表達(dá)產(chǎn)物。
本發(fā)明的再一個(gè)方面提供了有較高熱穩(wěn)定性的α淀粉酶，這些突變型α淀粉酶在淀粉降解的應(yīng)用條件下減少了過(guò)濾問(wèn)題。
本發(fā)明的再一個(gè)方面提供了有較高酸穩(wěn)定性的α淀粉酶，從而可在與淀粉葡糖苷酶反應(yīng)之前，降低所加酸的量，同時(shí)降低不利的副產(chǎn)物的生成。該新的α淀粉酶最好就熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性兩者來(lái)說(shuō)具有改善了的性質(zhì)，或者就熱穩(wěn)定性和堿穩(wěn)定性兩者來(lái)說(shuō)具有改善的性質(zhì)。
本發(fā)明的再一個(gè)方面是顯示突變型蛋白質(zhì)在淀粉液化的應(yīng)用條件下具有更好的性能。堿穩(wěn)定性對(duì)于在織物脫漿中的應(yīng)用是特別有宜的。
在對(duì)發(fā)明的詳細(xì)描述及下文的實(shí)施例中將進(jìn)一步述及這些方面。


圖1pMa5-8的核苷酸順序Stanssens等人，1987，EMBO Laboratory Course Martin-sried，July 1987。有關(guān)不同結(jié)構(gòu)元件的描述詳見(jiàn)該文獻(xiàn)。
圖2質(zhì)粒pPROM SPO2插入段的核苷酸順序EP-A-0224294中已描述了該載體的構(gòu)建。下面的三聯(lián)體描述α淀粉酶氨基酸順序。順序編號(hào)由成熟蛋白質(zhì)(Kuhn et al.1982，J.Bacteriol，149，372)的第一個(gè)氨基酸開(kāi)始。由61至344位是SPO2啟動(dòng)子插入部分。
圖3pMaTLia6的核苷酸順序由pMa5-8、pPROM SPO2的插入段和編碼TAC啟動(dòng)子的合成DNA。片段構(gòu)建該載體。TAC啟動(dòng)子DNA片段由位置3757至3859。α淀粉酶氨基酸順序用下面的三聯(lián)子表示。
圖4pMaTLia6的限制性酶切圖下列獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)用于α淀粉酶基因中的缺口構(gòu)建BamHⅠ、SpeⅠ、SacⅡ、KpnⅠ、ClaⅠ、NarⅠ、SalⅠ、Tht111Ⅰ、XmaⅢ和BstE11。為了能夠容易地確定突變，已合成了適于所有可能之缺口的順序測(cè)定引物。質(zhì)粒pMcTLia6與pMaTLia6大致相同，不同的是在氨芐青霉素基因中存在琥珀密碼子(除去ScaⅠ位點(diǎn))，而在氯霉素基因中則沒(méi)有琥珀密碼子(與存在PvuⅡ位點(diǎn)有關(guān))。
圖5芽孢桿菌/大腸桿菌穿梭載體pBMa/c的簡(jiǎn)略圖解(左側(cè))pMa/c部分能夠容易地在大腸桿菌中誘變。(右側(cè))枯草芽孢桿菌基因盒含有α淀粉酶基因(或其他芽孢桿菌基因)加上在枯草芽孢桿菌中增殖的最小復(fù)制子。在大腸桿菌中成功地誘變后，枯草芽孢桿菌基因盒可成環(huán)，從而使SPO2啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)化到芽孢桿菌后移到α淀粉酶基因的前面。
圖6pBMa/cl的限制性酶切圖該載體是圖5所示誘變表達(dá)載體的一個(gè)特定例子。
(1)和(2)多克隆位點(diǎn)。靶基因被插入(2)中。借助改變(1)和(2)處的位點(diǎn)，可以構(gòu)建適于形成缺口之雙鏈的方便的限制性位點(diǎn);
FDT轉(zhuǎn)錄終止密碼子Fl.ORI來(lái)源于噬菌體F1的復(fù)制原點(diǎn)E.coliORI來(lái)自pBR322的復(fù)制原點(diǎn)BLA氨芐青霉素抗性基因CAT氯霉素抗性基因BAC ORIpUB110的復(fù)制原點(diǎn)KANAMYCINpUB110的卡那霉素(新霉素)抗性基因SPO2噬菌體SPO2的啟動(dòng)子圖7pBMa/c6Lia6的限制性酶切圖將地衣形芽孢桿菌α淀粉酶基因于圖6所示的多克隆位點(diǎn)(2)切接到pBMa/cl中。該圖中的(2)標(biāo)示SPO2啟動(dòng)子，(4)標(biāo)示E.Coli ORI。
圖8pMa/c TPLia6中phoA信號(hào)順序片段的順序給出了從TAC-啟動(dòng)子上游之EcoRI位點(diǎn)至成熟α淀粉酶第一個(gè)氨基酸的順序。phoA氨基酸順序在DNA順序的下面示出。
圖9WT和2D5 α淀粉酶的米氏(Michaelis-Menten)方程圖該圖顯示酶活性的初始速率對(duì)WT和2D5α淀粉酶之底物濃度的作圖。檢測(cè)條件如實(shí)施例8所述。
圖10WT和D7α淀粉酶的熱失活該圖顯示于pH5.5及90.5℃時(shí)，作為Ca2+濃度的函數(shù)之WT和D7α淀粉酶半衰期的變化。
圖11WT和D7α淀粉酶的熱失活其大致同圖10，不同的是pH為7.0。
圖12WT和2D5α淀粉酶的熱失活該圖顯示于pH7.0和95℃時(shí)，作為Ca2+濃度的函數(shù)，WT和2D5α淀粉酶的半衰期變化情況。
圖13顯示作為pH的函數(shù)，WT和D7α淀粉酶的熱失活。
圖14顯示作為pH的函數(shù)，WT和2D5α淀粉酶的熱失活。
圖15顯示DE對(duì)110℃液化后測(cè)得之最終pH的作圖。
本說(shuō)明書中，所說(shuō)的突變型α淀粉酶“表現(xiàn)出改善的性質(zhì)”是指該酶在淀粉液化、紡織物脫漿及其他工業(yè)加工條件下具有較高的酶促活性或較長(zhǎng)的半衰期。
有“改善了的熱穩(wěn)定性”是指該突變酶在較高的加工溫度下保留其活性，或者與產(chǎn)生該酶的野生型酶相比，在同一溫度下能較長(zhǎng)時(shí)間地維持其活性。
有“改善了的酸(或堿)穩(wěn)定性”是指突變酶在較低(或較高)pH值可比衍生它的野生型酶更好地完成其功能。
應(yīng)明確的是，這種改善的特性是經(jīng)置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸所導(dǎo)致的。
可由含α淀粉酶的微生物中分離染色體DNA。較好使用芽孢桿菌屬的微生物，更好是地衣形芽孢桿菌，最好是地衣形芽孢桿菌T5(參見(jiàn)EP-A-134048)。用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶旧wDNA并克隆到載體中。可用多種方法選擇，如雜交、免疫檢測(cè)和測(cè)定酶促活性?？筛鶕?jù)所利用的篩選方法來(lái)選擇用于克隆被消化之染色體DNA的載體。如用雜交法篩選時(shí)，沒(méi)有特殊的要求。但如果進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)或基于酶促活性進(jìn)行測(cè)定，載體應(yīng)含有適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)信號(hào)。實(shí)際檢測(cè)含α淀粉酶的克隆是在含淀粉的瓊脂平皿上進(jìn)行的。生長(zhǎng)并通入碘蒸汽保溫后檢測(cè)陽(yáng)性克隆。下一步是測(cè)定基因的順序。將所衍生的氨基酸順序同其他已知的α淀粉酶順序相比較，以得到有關(guān)其重要氨基酸的第一個(gè)印象(如活性部位、Ca2+結(jié)合、可能的S-S鍵)。當(dāng)測(cè)定其3D結(jié)構(gòu)時(shí)，可得到更明確的指征。因?yàn)檫@項(xiàng)工作很繁復(fù)，所以常常要采用另一方法。在沒(méi)有3D結(jié)構(gòu)檢時(shí)，可成功地使用確定二級(jí)結(jié)構(gòu)單元(如α螺旋、β片層)的檢測(cè)程序來(lái)最后測(cè)得三級(jí)結(jié)構(gòu)單元(如β套桶結(jié)構(gòu)，β-barrel)。(參見(jiàn)Janin，J.and Wodack.S.J.，Prog.Biophys.molec.Biol.，1983，42，21-78)。
可以預(yù)見(jiàn)有價(jià)值的氨基酸置換蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是由蛋白質(zhì)之折迭與伸展構(gòu)象之間自由能的凈差決定的。由于脯氨酸殘基被限制于比其他氨基酸有較少構(gòu)象，所以當(dāng)用脯氨酸取代某氨基酸時(shí)，就降低了伸展蛋白質(zhì)的構(gòu)型熵(從而提高了穩(wěn)定性)。另一個(gè)有用的置換是用某氨酸取代丙氨酸。蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸等殘基具有分支的β碳，所以可比非分支殘基更多地限制骨架構(gòu)象。
因?yàn)槟承┑鞍踪|(zhì)之部分熱穩(wěn)定性是基于形成鹽橋，故引入賴氨酸和精氨酸可能是有利的(Tomozic S.J.and Klibanov A.M.，J.Biol.Chem.，1988，263，3092-3096)。另外，由精氨酸殘基取代賴氨酸時(shí)，由于精氨酸能夠形成另一個(gè)氫鍵，故可改善鹽橋的穩(wěn)定性(如參見(jiàn)Wigby，D.B.et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.1987，149，927-929)。該文述及天冬酰胺和谷氨酰胺脫氨基化可導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重破壞，而用非酰胺殘基取代則可避免之。氨基酸置換是在DNA水平上進(jìn)行誘變的最好方式。
原則上可直接對(duì)分離的克隆進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)。但更好是將插入段克隆到誘變/表達(dá)載體中。隨機(jī)誘變是可能的，而且可能造成定點(diǎn)誘變。鑒于用前述方法得到了大量突變的克隆，并且由于不知道α淀粉酶的三維結(jié)構(gòu)以對(duì)其完成可能的定點(diǎn)誘變，所以我們決定在特定區(qū)域中進(jìn)行“隨機(jī)”誘變。
下面是實(shí)施本發(fā)明的可能手段。
首先通過(guò)引入“沉默”限制性位點(diǎn)來(lái)修飾基因。也可以引入非沉默限制性位點(diǎn)。從而有可能缺失基因的特定區(qū)域。然后將基因克隆到質(zhì)粒中。噬菌體與質(zhì)粒的這種結(jié)合便容易產(chǎn)生單鏈DNA。也可使用其他方法得到單鏈DNA。使熔解的雙鏈載體(加插入段)DNA與插入段中含有缺口的載體/插入段結(jié)合物雜交，即得到有缺口的異源雙鏈DNA(詳見(jiàn)Morinaga，Yet al.1984，Biotechnology，2，636)。
利用缺口進(jìn)行化學(xué)或酶促誘變。我們優(yōu)選亞硫酸氫鹽法(Folk and Hofstetter，cell，1983，33，585)和酶促錯(cuò)誤摻入法(Lehtovaara等人的改良法，Prot.Eng.，1988，2，63)。使用這些方法應(yīng)使缺口中的每個(gè)單個(gè)核苷酸都能被所有三個(gè)其他核苷酸取代(飽和誘變)。后一種方法可以幾種方式完成。其中之一是將合成引物雜交到缺口上。然后進(jìn)行延伸反應(yīng)，其中丟失了互補(bǔ)于來(lái)自引物之第一個(gè)脫氧核苷酸3′的脫氧核苷酸。原則上所有三個(gè)其他脫氧核苷酸均可被摻入。此可使用三個(gè)脫氧核苷酸的混合物或者使用分別只含一個(gè)脫氧核苷酸的三個(gè)分離的反應(yīng)來(lái)完成。實(shí)施該方法的另一個(gè)方式是產(chǎn)生隨機(jī)克隆。這里，四個(gè)分立的反應(yīng)中每個(gè)都包含一個(gè)限速脫氧核苷酸。如此便產(chǎn)生了在每一單個(gè)核苷酸之前終止的第二鏈。可按上述方法進(jìn)行繼后的步驟。使用亞硫酸氫鹽法和酶促誘變法都能得到突變型。
為了檢驗(yàn)酶促特性，可使用誘變實(shí)驗(yàn)期間使用的同一宿主來(lái)表達(dá)已克隆的基因。原則上其可以是任何宿主細(xì)胞，條件是可得到這些細(xì)胞所適用的誘變/表達(dá)載體系統(tǒng)。大部分大腸桿菌均可適用，例如大腸桿菌WK6。菌落在微量滴定板中生長(zhǎng)之后，將這些滴定板之小井中的樣品點(diǎn)在添加了淀粉并以不同pH值緩沖的瓊脂板上?？筛鶕?jù)暈環(huán)的形成來(lái)確定陽(yáng)性克隆。可用適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行篩選，以選擇熱穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性、堿穩(wěn)定性、鹽水穩(wěn)定性或任何其他穩(wěn)定性的克隆。
用于生產(chǎn)突變型α淀粉酶的適當(dāng)宿主菌株包括可在其中表達(dá)α淀粉酶的可轉(zhuǎn)化微生物。特別適用的是由其中衍生α淀粉酶的同一種或?qū)俚奈⑸?，如芽孢桿菌菌株。較好是α淀粉酶陰性芽孢桿菌菌株，更好是α淀粉酶和蛋白酶陰性芽孢桿菌菌株。
例如已使用地衣形芽孢桿菌產(chǎn)生高水平的突變型α淀粉酶。
所產(chǎn)生的α淀粉酶最好能分泌到培養(yǎng)基中(在發(fā)酵期間)，從而有利于產(chǎn)物回收。可使用適當(dāng)?shù)男盘?hào)順序達(dá)到分泌目的。
由細(xì)胞中分泌表達(dá)的α淀粉酶并以任何適當(dāng)方法純化之(如使用凝膠過(guò)濾法和Mono Q層析法)。于不同的Ca2+濃度(0.5-15mM)和寬pH范圍(5.5-8.0)下試驗(yàn)已分離之α淀粉酶的熱失活作用。也可于實(shí)用條件下進(jìn)行試驗(yàn)。特別是在pH5.5和5.25的淀粉液化條件下試驗(yàn)突變的α淀粉酶。此外也試驗(yàn)了其在紡織物脫漿中的應(yīng)用。
被選擇的某些突變型特性使之能更好地在實(shí)用條件下使用。
本發(fā)明公開(kāi)了有較好熱穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性和堿穩(wěn)定性的α淀粉酶。一般說(shuō)來(lái)，只要突變蛋白質(zhì)與其野生型酶的活性相同或較之更好，氨基酸取代的數(shù)目并不是很重要的。突變型α淀粉酶至少有一個(gè)且更好有1至10個(gè)氨基酸不同于野生型酶。改善了性能的特定突變型包括在位置111、133和149(按地衣形芽孢桿菌α淀粉酶的序號(hào))處含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的突變型α淀粉酶。較好的氨基酸取代是Ala-111-Thr、His-133-Tyr和Thr-149-Ile。
這些突變酶在低于6.5和/或高于7.5的pH條件下表現(xiàn)有改善的性能。這種性能也可在高溫度下得以提高，從而在例如高達(dá)110℃時(shí)具有較長(zhǎng)的半衰期。
許多適用的α淀粉酶產(chǎn)物系得自于細(xì)菌來(lái)源，特別是芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌、脂肪嗜熱芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和淀粉液化芽孢桿菌。這些酶顯示有高度的同源性和相似性(Yuuki et al.，J.Biochem.，1985，98，1147;Nakajima et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1986，23，355)。因此可利用由這些α淀粉酶之一獲得的有利突變的知識(shí)來(lái)改善其他淀粉酶。本發(fā)明提供了獲得這種知識(shí)的途徑。
以下是對(duì)所用實(shí)驗(yàn)方法的描述及舉例闡明本發(fā)明的實(shí)施例。實(shí)施例旨在進(jìn)一步闡明而不是限定本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)材料和方法1.一般克隆技術(shù)所使用的克隆技術(shù)可參見(jiàn)T.Maniatis et al.，1982，Molecular cloning，Cold Spring Harbor Laboratory;F.M.Ausubel et al.，1987，Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley & Sons Inc.，New York;B.Perbal，1988，Apractical Guide to Molecular Cloning，2nd edition，John Wiley & sons Inc.，New York等手冊(cè)。這些手冊(cè)詳細(xì)描述了構(gòu)建和增殖重組DNA分子的方法，制備基因庫(kù)的方法，順序分析和誘變DNA的方法以及酶學(xué)手段處理DNA分子的方法。
2.化學(xué)誘變可在體外用化學(xué)試劑處理已克隆的DNA，以在該DNA中引入突變。如果這些突變是針對(duì)編碼氨基酸之三聯(lián)體的，即可由突變的克隆DNA產(chǎn)生突變蛋白質(zhì)。Shortle和Botstein(Methods Enzymol.，1983，100，457)描述了借助亞硫酸氫鈉進(jìn)行化學(xué)誘變的方法。Folk和Hofstetter(cell 1983，33，585)描述了一種改良方法。Smith(Ann.Rev.Genet.，1985，19，423)描述了誘變的其他方法。Ausubel等人(文獻(xiàn)出處同上)則描述了一種特別有用的方法。
3.對(duì)形成缺口之雙鏈DNA的誘變使用一種基于造成雙股缺口的方法(Kramer et al.，1984，Nucl.Acids Res.，12，9441)及所謂噬質(zhì)體(phasmid，一種質(zhì)粒/噬菌體雜合體)。該方法基本上是建立在一種形成缺口的雙股DNA中間體基礎(chǔ)上，所說(shuō)的中間體由含有野生型抗生素抗性標(biāo)志的缺口鏈(負(fù)鏈)及攜帶琥珀突變(在貢獻(xiàn)抗生素抗性的基因中)的模板鏈(正鏈)組成。退火后，在體外缺口填補(bǔ)及封閉反應(yīng)期間，使誘變寡核苷酸摻入有缺口的鏈中。用所得分子轉(zhuǎn)化錯(cuò)配修復(fù)缺陷性(Muts)宿主，并在其中保留有預(yù)定突變與抗生素抗性標(biāo)志之間的連結(jié)。由該菌株中分離混合的噬質(zhì)體群，然后使之在抑制基因陰性宿主菌株中分離。將轉(zhuǎn)化體鋪敷在含抗生素培養(yǎng)基上，從而得以選擇由形成缺口鏈衍生的子代。
1.Stanssens等人(Nucl.Acids Res.，1989，17，4441)所述的雙載體系統(tǒng)pMa/c5-8由下列單元組成pos 11-105噬菌體fd，終止子pos 121-215噬菌體fd，終止子pos 221-307質(zhì)粒pBR322(pos2069-2153)pos 313-768噬菌體f1，復(fù)制原點(diǎn)(pos 5482-5943)pos 772-2571質(zhì)粒pBR322，復(fù)制原點(diǎn)和β內(nèi)酰胺酶基因pos 2572-2685轉(zhuǎn)座子Tn903pos 2519-2772色氨酸終止子(雙股)pos 2773-3729轉(zhuǎn)座子Tn9，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因
pos 3730-3803多克隆位點(diǎn)該順序如圖1所示。
在pMa型載體中，核苷酸3409由G改變?yōu)锳;而在pMc型載體中，核苷酸2238由G改變?yōu)镃，從而分別在乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和β內(nèi)酰胺酶基因中產(chǎn)生琥珀終止密碼子，使所說(shuō)的基因失活。
提到的所有順序均得自Genbank(TM)(release 54)，National Nucleic Acid Sequence Data Bank，NIH USA。質(zhì)粒pMc5-8已以保藏號(hào)DSM4566保藏。為了完成誘變，將靶DNA片段克隆到pMa5-8的多克隆位點(diǎn)中。然后在含有靶DNA的pMa5-8和pMa5-8之間構(gòu)建一個(gè)形成缺口的雙鏈。
可用誘變寡核苷酸、長(zhǎng)的合成寡核苷酸、低水平錯(cuò)誤摻入的核苷酸，化學(xué)物質(zhì)或核苷酸的酶促錯(cuò)誤摻入含靶DNA的單股缺口致突變，但也可使用隨機(jī)誘變PCR(詳見(jiàn)Ausubel等人，和Perbal的前述文獻(xiàn))。作為體外誘變的一個(gè)替代方法是借助紫外光或化學(xué)試劑或用大腸桿菌致突變菌株進(jìn)行體內(nèi)誘變(Fowler et al.，J.Bacteriol.，1986，167，130)。
可使用得自Applied Bio Systems的裝置合成誘變核苷酸。
4.借助核苷酸的酶促錯(cuò)誤摻入隨機(jī)誘變可對(duì)pMa/PMC缺口雙鏈進(jìn)行引物延伸和錯(cuò)誤摻入誘變，該方法最初是由Shortle等人(Proc，Natl、Acad.Sci.USA，1982，79，1588)、B.C.Cunningham和J.A.Wells(Prot.Eng.，1987，1，319)描述的，Lehtovaara等人(Prot.Eng.，1988，2，63)則描述了相應(yīng)的改良方法。
該方法是基于控制地使用聚合酶。首先經(jīng)pMa/pMc之缺口雙鏈的引物延長(zhǎng)而產(chǎn)生四個(gè)DNA分子群體，使它們?cè)谌笨谥校挚偸窃谝阎愋蛪A基的前面(分別在A、C、G或T之前)隨機(jī)終止。然后在分離的錯(cuò)誤摻入反應(yīng)中誘變各個(gè)群體，這樣即可刪去正確的堿基。以這種方法，可在缺口的每個(gè)位置產(chǎn)生所有類型的堿基置換突變。使用順序(TM)(U.S.Biochemical Corporation)時(shí)，最好使用Klenow聚合酶。而且可使用Lehtovaara等人(文獻(xiàn)出處同上)用過(guò)的MoMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶代替A.M.V.逆轉(zhuǎn)錄酶。
為了確保單個(gè)位點(diǎn)置換，我們對(duì)Lehtovaara等人(文獻(xiàn)出處同上)所述的方法作了如下改動(dòng)在逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液中不是有三種而是只有一種錯(cuò)誤摻入核苷酸。例如在三個(gè)分離的反應(yīng)中使A特異性有限堿基延長(zhǎng)混合物分別與250μM dCTP、250μM dGTP和250μMdTTP進(jìn)行反應(yīng)。對(duì)于整組4堿基特異性有限延長(zhǎng)混合物，總共要完成12次分離的錯(cuò)誤摻入反應(yīng)。于42℃保溫1.5小時(shí)后，加入所有四種濃度為0.5mM的脫氧核苷酸，并繼續(xù)于37℃下保溫至少20分鐘。然后按Lehtovaara等人(文獻(xiàn)出處同上)的方法進(jìn)一步加工處理，所作改動(dòng)是沒(méi)有對(duì)含尿嘧啶DNA鏈作反選擇，而是基于pMa/c載體進(jìn)行反選擇。
5.突變型α淀粉酶的生產(chǎn)在TB培養(yǎng)基(10ml)中30℃下接種含攜帶任何一種α淀粉酶構(gòu)建物之表達(dá)載體的大腸桿菌菌株WK6(Zell，R.and Fritz，H.J.，EMBO J.，1987，6，1809)的轉(zhuǎn)化株。TB培養(yǎng)基包含0.017M KH2PO4、0.072M K2HPO4、12g/L Bactotryptone、24g/L Bacto酵母浸膏、0.4%甘油和抗生素(對(duì)pMa用氨芐青霉素，對(duì)pMc構(gòu)建物用氯霉素)。用培養(yǎng)物樣品在2升燒瓶?jī)?nèi)接種250ml TB。在OD600為10-20時(shí)加入0.1mM IPTG(異丙基-β-d-硫代半乳吡喃糖苷)并繼續(xù)保溫12-16小時(shí)。
6.突變型α淀粉酶的純化離心收獲細(xì)胞并再懸浮于含有20%蔗糖的緩沖液中(0℃)。第二次離心后將細(xì)胞再懸浮于水中。第三次離心除去細(xì)胞碎片并用20mM TRIS緩沖液將上清液調(diào)至pH8.0。加入CaCl2至終濃度為50mM。將材料于70℃加熱處理15分鐘并離心除去不溶性物質(zhì)。通過(guò)0.22μ微孔過(guò)濾器過(guò)濾上清液并濃縮至原體積的1/10。
使用凝膠過(guò)濾法(TSK HW-55-Merck柱)和Mono Q層析法進(jìn)一步純化。在MonoS上層析前用乙酸鈉將含酶活性部分的pH調(diào)到4.8。用250mM NaCl洗脫α淀粉酶。為避免失活而將pH直接調(diào)到8.0。
實(shí)施例1地衣形芽孢桿菌α淀粉酶基因的分子克隆用限制酶EcoRI消化由地衣形芽孢桿菌(EP-A-134048CBS470.83)分離的染色體DNA并連接到pUB110(Gryczan，T.J.，et al.，J.Bacteriol，1978，134，p.318)的EcoRI位點(diǎn)上。用連接混合物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌1A40(Bacillus Genetic Stock Center)。檢驗(yàn)在添加0.4g/L淀粉(Zulkowsky Starch，Merck)的HI瓊脂平皿(DIFCO)上產(chǎn)生α淀粉酶的新霉素抗性菌落。生長(zhǎng)并與I2蒸汽保溫后，選擇產(chǎn)生大的清晰暈環(huán)的陽(yáng)性菌落并作進(jìn)一步的定性分析。由該陽(yáng)性菌落分離的質(zhì)粒顯示含有來(lái)源于地衣形芽孢桿菌T5的3.4kb EcoRI-EcoRI片段。該質(zhì)粒被定名為pGB33(EP-A-134048;CBS466.83)。將編碼α淀粉酶的插入段連接到合成的Shine-Dalgarno順序和噬菌體SPO2啟動(dòng)子上，產(chǎn)生質(zhì)粒pProm SPO2(參見(jiàn)EP-A-0224294;CBS696.85)。用Sanger(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1977，74，6463)方法測(cè)得的pProm SPO2插入段的核苷酸順序如圖2所示。該順序顯示有一個(gè)編碼α淀粉酶的單一的大的開(kāi)放讀碼，它實(shí)際上相同于由Yuuki等人(文獻(xiàn)同上)測(cè)得的地衣形芽孢桿菌的α淀粉酶順序。前29個(gè)氨基酸是信號(hào)順序，其在α淀粉酶分泌期間被切掉。本說(shuō)明書中的氨基酸順序編號(hào)均參照成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序號(hào)。
在下列位置上與Yuuki的順序不同134位上以Arg代替了Leu，310位上以Ser代替了Gly，320位上以Ala代替了Ser。
實(shí)施例2誘變/表達(dá)載體pMaTLia6的構(gòu)建用EcoRI和BclI消化質(zhì)粒pPROM SPO2，純化18Kb EcoRI-BclI插入段并克隆到EcoRI-BamHI消化的pMa5-8中。此pMa5-8載體在使用前已經(jīng)過(guò)修飾，帶有多克隆位點(diǎn)。圖1中由位置3767到位置3786的Bam HI-HindⅢ片段被換成如圖3所示從位置5647至5660的合成DNA順序。完成這一步驟后即可使α淀粉酶基因內(nèi)的某些限制性位點(diǎn)變?yōu)楠?dú)有的。用EcoRI和BamHI消化所得含α淀粉酶的pMa5-8衍生物并連接到攜帶TAC啟動(dòng)子(De Boer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80，21)拷貝的合成DNA片段上該合成DNA片段的順序連同最后的α淀粉酶誘變/表達(dá)載體pMa TLia6一起示于圖3中(從位置3757至位置3859)。經(jīng)引入幾個(gè)沉默限制性位點(diǎn)以構(gòu)建成最后的α淀粉酶誘變表達(dá)載體，從而可在誘變實(shí)驗(yàn)期間在α淀粉酶基因中產(chǎn)生缺口(圖4)。為此目的，使用定點(diǎn)寡核苷酸誘變法造成下列突變經(jīng)沉默突變引入了SpeI位點(diǎn)
T49T 和 S50SACG→ACT AGC→AGT經(jīng)沉默突變引入了NarI位點(diǎn)A269TGCG→GCC在TAG終止密碼子下游引入了BstEⅡ位點(diǎn)TAGAAGAGC→TAGGTGACC該α淀粉酶誘變載體pMaTLia6適于用缺口雙鏈法進(jìn)行誘變。對(duì)用適當(dāng)限制酶消化所制得的雙鏈pMaTLia6 DNA作退火處理，使之成為單股pMcTLia6 DNA。
按實(shí)驗(yàn)部分所述對(duì)所得單鏈缺口進(jìn)行定點(diǎn)誘變、化學(xué)誘變、及隨機(jī)酶促誘變。
經(jīng)加入IPTG，使α淀粉酶基因前面的TAC啟動(dòng)子能夠用于誘導(dǎo)α淀粉酶在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)。
質(zhì)粒pMaTLia6(在大腸桿菌WK6中)已于1989年6月2日保藏，保藏登記號(hào)為CBS255.89。
實(shí)施例3用于誘變和表達(dá)的芽孢桿菌/大腸桿菌穿梭載體的構(gòu)建該載體可使被插入的基因在大腸桿菌中致突變并在芽孢桿菌中直接表達(dá)。適于載體構(gòu)建的戰(zhàn)略是以下列方式使pUB110衍生物(Gryczan，文獻(xiàn)出處同上)與pMa/c雙載體系統(tǒng)結(jié)合1.可經(jīng)單一限制/再連接實(shí)驗(yàn)除去枯草芽孢桿菌基因暗盒。
2.可很容易地將不同的α淀粉酶基因和不同的啟動(dòng)子克隆在該載體中。
3.重新連接成環(huán)形之后，已克隆的基因?qū)⑻幱谶m當(dāng)?shù)难挎邨U菌啟動(dòng)子的控制下。
4.在大腸桿菌中致突變期間，芽孢桿菌啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)α淀粉酶基因在物理上是分離的，以防止α淀粉酶在大腸桿菌內(nèi)可能造成的有害積聚。
圖5中顯示了穿梭載體的構(gòu)建程序。圖6中顯示了載體pBMa/cl之最后型式的結(jié)構(gòu)。載體pBMal已于1989年6月2日以保藏登記號(hào)CBS252.89保藏。已按下列步驟構(gòu)建了該載體。
-純化攜帶REP基因和NeoR基因之pUB110的EcoRI-SnaBI片段，并克隆到EcoRI-SmaI消化的pUC8中。
-將該pUC8衍生物的EcoRI-HindⅢ片段克隆到EcoRI-HindⅢ消化的pMa5-8中，得到質(zhì)粒pMa5-80。
-用編碼噬菌體SPO2之SPO2啟動(dòng)子(Williams et al.，J.Bacteriol.，1981，146，1162)加SacⅠ、ApaⅠ、XhoⅠ、SacⅠ、BglⅠ、MluⅠ和XbaⅠ之限制性識(shí)別位點(diǎn)的合成DNA片段取代BamHI-XbaI多聚接頭片段。
-使用pMa5-80的唯一EcoRI位點(diǎn)，以插入構(gòu)成下列識(shí)別位點(diǎn)的多聚接頭片段EcoRI、SmaI、SacI、EcoRV、SphI、KpnI、XbaI和HindⅢ。
為特定目的，已由pBMa/cl衍生得到了pBMa/c2和pBMa/c6。
-在pBMa/c2中，用pUC19的相應(yīng)多聚接頭置換了pBMa/cl的EcoRI-HindⅢ多聚接頭。
-在pBMa/c6中，除合理的SacⅡ位點(diǎn)外，已通過(guò)Klenow反應(yīng)除去pBMa/cl的多聚接頭。
構(gòu)建pBMa/c6 Lia6后，對(duì)地衣形芽孢桿菌α淀粉酶基因進(jìn)行定點(diǎn)誘變。該載體是將從pMaTLia6中分離的BamHI-HindⅢ片段連接到用BamHI和HindⅢ切割的上述pBMa/c6中而構(gòu)建的?？捎盟觅|(zhì)粒(圖7)構(gòu)建適于在大腸桿菌中誘變的造成缺口的雙鏈。
按Cnang和Cohen(Mol.Gen.Genet.，1979，168，111)所述方法用SacI限制性切割，重新連接并轉(zhuǎn)化后，已在枯草芽孢桿菌1A40(BGSC1A40)中表達(dá)了所得的突變型。
實(shí)施例4在大腸桿菌中表達(dá)正確成熟的地衣形芽孢桿菌α淀粉酶鑒定由pMaTLia6產(chǎn)生的α淀粉酶(實(shí)施例2)，表明α淀粉酶的一部分在分泌期間受到了不正確的加工。NH2末端順序分析顯示在大腸桿菌WK6中產(chǎn)生的α淀粉酶有一個(gè)多余的丙氨酸殘基。
雖然沒(méi)有證明這一改變使該淀粉酶產(chǎn)生了不同的特性，但我們還是用堿性磷酸酶PhoA信號(hào)順序取代了α淀粉酶信號(hào)順序。為此目的，進(jìn)行了一個(gè)誘變實(shí)驗(yàn)，以便在pMaTLia6中的信號(hào)肽和成熟α淀粉酶的接合處引入一個(gè)FspI限制性位點(diǎn)。經(jīng)EspI和BamHI消化后，插入一編碼phoA信號(hào)順序的合成DNA片段(Michaelis et al.J.Bacteriol.，1983，154，366)。該構(gòu)建物順序如圖8所示。顯示由pMa/cTPLia6產(chǎn)生的α淀粉酶具有正確的NH2-末端順序。
實(shí)施例5篩選穩(wěn)定的α淀粉酶A.篩選酸穩(wěn)定的α淀粉酶突變型可在用碘溶液使淀粉染色后，在以不同pH緩沖的淀粉平皿上比較各自的暈環(huán)，以選擇在低pH下比野生型α淀粉酶更好或更差的α淀粉酶突變型。
方法1.生長(zhǎng)使可能的突變體生長(zhǎng)于微量滴定板中。生長(zhǎng)培養(yǎng)基為250μl腦心灌注液(DIFCO)。同時(shí)加入下列成分氯霉素 50μg/mlI.P.T.G(SIGMA)0.2mMCaCl22mM用無(wú)菌牙簽由瓊脂平皿上采集菌落并接種在微量滴定板的各小井(96個(gè))內(nèi)。每個(gè)平板包括4個(gè)野生型菌落作為對(duì)照。
將這些微量滴定板置于37℃下保溫40小時(shí)(不振蕩)。
2.平皿試驗(yàn)保溫后產(chǎn)生α淀粉酶，由各小井取5μl樣品并點(diǎn)在兩種不同類型的瓊脂平皿(144×140mm)上。第一種類型的平皿是富心灌注液瓊脂平皿(DIFCO)+04%淀粉(Zulkowsky starch-Merck)+氯霉素50μg＜ml。37℃保溫16小時(shí)后，將該平皿作為突變的儲(chǔ)備物。
第二種類型平皿是實(shí)際篩選平皿，它含有Bacto瓊脂(DIFCO)1.5%+Zulkowsky淀粉0.2%。瓊脂和淀粉溶解于合成的自來(lái)水(STW)即軟化水+2mM CaCl2、1mM MgCl2、2.5mM NaHCO3和10μg/ml BSA中。
用100倍稀釋的5M醋酸鉀儲(chǔ)備緩沖溶液在該培養(yǎng)基中緩沖篩選平皿。儲(chǔ)備溶液的pH值為4.80、5.0和5.2(室溫)。測(cè)定時(shí)，瓊脂平皿的最后pH值稍低于儲(chǔ)備溶液的pH值。自各小井取5μl培養(yǎng)物點(diǎn)在3個(gè)有不同pH值的篩選平皿上。
所選用的pH值范圍應(yīng)使野生型α淀粉酶在有最低pH值的平皿上有很小或沒(méi)有活性。
3.顯色將篩選平皿于55℃下保溫2小時(shí)。然后將碘溶液滴加在平皿上。10X碘溶液含有30g碘和70gKI/L。
斑點(diǎn)的清除量與該pH值下的殘留α淀粉酶活性相關(guān)聯(lián)。選擇比野生型對(duì)照物有更好功能的突變型以進(jìn)行第二輪篩選。該實(shí)驗(yàn)中野生型的暈環(huán)有很好的再現(xiàn)性。
4.第二次篩選由富集平皿上采集陽(yáng)性突變體并在新鮮HI平皿+氯霉素上純化。由其中各采集4個(gè)菌落并按第一次篩選的相似方法再次檢驗(yàn)之。此外還用STW對(duì)這些培養(yǎng)物作一系列稀釋并將這些稀釋物點(diǎn)在中性pH篩選平皿(pH7.0)上。經(jīng)與野生型培養(yǎng)物比較，便可確定這種在低pH下表現(xiàn)出的更好性能是由于總體上產(chǎn)生了更好的α淀粉酶，還是由于產(chǎn)生了本質(zhì)上更為穩(wěn)定的α淀粉酶。
經(jīng)測(cè)定受到誘變的那部分基因的核苷酸順序來(lái)進(jìn)一步鑒定“經(jīng)受得住”第二輪篩選的突變型。
B.篩選堿穩(wěn)定性α淀粉酶按照篩選酸穩(wěn)定性α淀粉酶的相似方法來(lái)篩選堿穩(wěn)定性α淀粉酶。在微量滴定板上生長(zhǎng)后，由各小井中取出5μl樣品點(diǎn)在儲(chǔ)備平皿上及實(shí)際篩選平皿上。后者含有Bacto 瓊脂(DIFCO) 1.5%Zulkowsky 淀粉 0.2%并用加有2mM CaCl2、1mM MgCl2、2.5mM NaHCO3和10μg/ml BSA的軟化水補(bǔ)足體積。
用50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液緩沖篩選平皿，pH值為9.0、9.5和10.0。選擇的pH值范圍應(yīng)使野生型α淀粉酶在最高pH值時(shí)有很小或沒(méi)有活性。在55℃保溫2小時(shí)后，將碘溶液滴加到平血上。選擇那些能比野生型酶產(chǎn)生更好暈環(huán)的突變型，以進(jìn)行第二輪篩選。第二輪篩選也是按篩選酸穩(wěn)定性的相似方法進(jìn)行的。
C.篩選熱穩(wěn)定性α淀粉酶突變型也可比較于加熱后由培養(yǎng)液中殘留淀粉酶活性在淀粉平皿上造成的暈環(huán)，來(lái)選擇在高溫度下比野生型α淀粉酶有較好或較差性能的α淀粉酶突變型。
方法1.以進(jìn)行pH篩選的同樣方法培養(yǎng)突變體。
2.以進(jìn)行pH篩選的同樣方法在HI瓊脂平皿上復(fù)制突變體。
3.用隨意使用的帽(Flow Laboratories)封住微量滴定板的各小井，以防止加熱期間培養(yǎng)液的蒸發(fā)。
4.在95℃水浴中將微量滴定板加熱1小時(shí)。加熱后置于離心機(jī)中離心以收集微量滴定板底部的總樣品。
5.按下述方法篩選熱穩(wěn)定性突變酶由各小井取5μl培養(yǎng)物點(diǎn)在中性篩選平皿上(參見(jiàn)pH篩選程序)。然后于55℃保溫1小時(shí)。用碘溶液染色淀粉之后，比較斑點(diǎn)(暈環(huán))的清除率，篩選有不同殘留α淀粉酶活性的突變組和對(duì)照組。當(dāng)對(duì)照組的殘留活性太高時(shí)，須作系列稀釋并點(diǎn)在篩選平皿上，以能夠?qū)⒈纫吧兔赣懈脽岱€(wěn)定性的突變酶區(qū)別出來(lái)。
6.按進(jìn)行pH篩選的相似方法檢驗(yàn)期望得到的突變酶。
如期望有聯(lián)合特性，可將A或B型與C型篩選方法合用。例如可在第一輪篩選堿穩(wěn)定性α淀粉酶后，就熱穩(wěn)定性進(jìn)行第二輪篩選?？蛇x擇在兩次試驗(yàn)中記錄為陽(yáng)性的那些突變型作為表現(xiàn)有兩種預(yù)期特性的候選者。
實(shí)施例6pMaTLia6的亞硫酸氫鹽誘變使pMaTLia6的單鏈DNA與SacⅡ-ClaⅠ消化的pMcTLia6一起退火，以得到從4315位到4569位有缺口的異源雙鏈(圖3)。對(duì)該異源雙鏈進(jìn)行亞硫酸氫鹽誘變(見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分)。
轉(zhuǎn)化到大腸桿菌WK6mut S(Zell，R.and Fritz H.J.，文獻(xiàn)同上)中之后，分離在含氯霉素瓊脂平皿(50μg/ml)上選擇的質(zhì)粒庫(kù)并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌WK6中。大腸桿菌WK 6 Mut S和大腸桿菌WK6已分別以保藏登記號(hào)CBS472.88和CBS473.88保藏。使所得轉(zhuǎn)化株在含有2.0mM CaCl2、50μg/ml氯霉素和0.2mM IPTG(SIGMA)的培養(yǎng)基中于微量滴定板小井內(nèi)37℃下生長(zhǎng)40小時(shí)(不振蕩)。按實(shí)施例5所述方法篩選pH穩(wěn)定性突變體。
篩選到大約300個(gè)CmR轉(zhuǎn)化體。經(jīng)DNA順序分析確定突變頻率平均為每分子缺口上產(chǎn)生0.4個(gè)突變。經(jīng)pH篩選后鑒定一個(gè)酸穩(wěn)定的突變體D7。對(duì)該突變體的篩選順序分析揭示了起源于從CAC至TAC之編碼三聯(lián)子突變的突變H133Y。
發(fā)現(xiàn)突變體D7在熱穩(wěn)定性篩選試驗(yàn)(實(shí)施例5)中也是陽(yáng)性的。
用設(shè)計(jì)恰好定位在SacⅡ-ClaⅠ片段前面的特異寡核苷酸對(duì)單股DNA進(jìn)行DNA順序分析。在一分離的誘變實(shí)驗(yàn)中，篩選了1000個(gè)CmR轉(zhuǎn)化體。經(jīng)pH篩選后鑒定了另一個(gè)酸穩(wěn)定的突變體2D5。該突變體具有下列突變H133Y CAC→TACT149I ACA→ATA按已述的相似方法，在圖3所示從4569位至4976位的ClaI-SalI缺口上進(jìn)行亞硫酸氫鹽誘變。篩選出大約300個(gè)CmR轉(zhuǎn)化體(突變頻率為0.6個(gè)突變/分子)。沒(méi)有找到對(duì)酸穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體，但發(fā)現(xiàn)了許多對(duì)酸不穩(wěn)定的突變體。在這些對(duì)酸不穩(wěn)定的突變體中，有些可能有移動(dòng)的pH譜，而出現(xiàn)對(duì)堿更穩(wěn)定的表型。
實(shí)施例7對(duì)pMaTLia6的酶促誘變將單股pMaTLia6(圖4)與ClaI-SalI消化的pMcTLia6一起退火，以得到從4569位至4976位(圖3)的異源雙鏈。按實(shí)驗(yàn)部分所述對(duì)造成缺口的雙鏈進(jìn)行酶促錯(cuò)誤摻入誘變。
將經(jīng)過(guò)dATP限制的引物延長(zhǎng)之后得到的樣品切成三個(gè)部分，并在逆轉(zhuǎn)錄酶存在下分別與dCTP、dGTP和dTTP保溫。37℃保溫10分鐘后，用所有四種dNTP和Klenow聚合酶造成追擊摻入，加入T4DNA連接酶以完成延長(zhǎng)，得到完整的雙鏈分子。
將這些分子轉(zhuǎn)化到大腸桿菌WK 6 Mut S中并回收質(zhì)粒庫(kù)。然后將這些質(zhì)粒庫(kù)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌WK6中并在含氯霉素(50μg/ml)的瓊脂平皿上選擇菌落。按實(shí)施例5所述，根據(jù)α淀粉酶的穩(wěn)定性篩選所得突變體。
在另一實(shí)驗(yàn)中，分別用dATP、dCTP、dGTP和dTTP對(duì)SpeI-SacⅡ缺口進(jìn)行有限的引物延長(zhǎng)。用錯(cuò)誤摻入法(見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分)對(duì)這些引物庫(kù)進(jìn)行誘變。在pH平皿(實(shí)施例5)上檢驗(yàn)100個(gè)CmR轉(zhuǎn)化體，并鑒定出于低pH下更為穩(wěn)定的突變體M29。確定突變的順序?yàn)锳IIIT GCG→TCG。
實(shí)施例8穩(wěn)定突變體的特性對(duì)由亞硫酸氫鹽誘變實(shí)驗(yàn)得到的兩種突變體作進(jìn)一步的鑒定。如上所述，在DNA順序測(cè)定之前提示有下列氨基酸置換-D7之133位上含有的酪氨酸被組氨酸取代(D7＝H133Y)-2D5含有D7突變，另外149位的蘇氨酸被異亮氨酸取代(2D5＝H133Y，T149I)。
a)對(duì)酶促活性的檢測(cè)使用4-硝基苯基-麥芽戊糖苷(4NP-DP5)作底物檢測(cè)地衣形芽孢桿菌α淀粉酶WT和突變體的酶促活性，反應(yīng)中生成4-硝基苯酚和麥芽戊糖，然后即可檢測(cè)OD405的改變。該方法是在50mM MOPS、50mM NaCl、2mM CaCl2(pH7.15)和0-1mM 4NP-DP5中于35℃下進(jìn)行的。測(cè)定初始速率并以10，000l/M/cm收取4-硝基苯酚。圖9顯示了對(duì)WT和2D5α淀粉酶所作檢測(cè)的結(jié)果。表1中給出了計(jì)算的Vmax和Km值。
表1Vmax(μM/min./mg) Km(mM)WT 66.7±0.9 0.112±0.0052D5 66.3±0.7 0.119±0.004由表1可以看出，α淀粉酶2D5的突變并沒(méi)有以顯著的方式影響酶促活性。
b)Ca2+對(duì)熱失活作用的影響在不同的鈣濃度下對(duì)WT、D7和2D5進(jìn)行熱失活實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)程序如下1)去金屬化酶(2-3mg/ml)對(duì)3×1L20mM MOPS、5mM EDTA、5mM EGTA(pH7.0)和3×1L 20mM MOPS(pH7.0)透析24小時(shí)。
2)再金屬化-500μl緩沖液100mM(如MES、MOPS、EPPS)＊-145μl去金屬的酶(如2.15mg/ml)-100μl CaCl2(100、50、30、20、10、5或2.5mM)-Xμl K2SO4(100mM)-(25.5-X)μl H2O[CaCl2]終mM數(shù) [K2SO4]終mM數(shù)0.25 14.750.5 14.51 142 133 125 10
10 0＊-pH MES，如于室溫下為6.77，90℃將為6.0(pKa6.15pKa/℃＝-0.011)-pKa摘自Merck公司的表(Zwitterionische Puffersubstan-zen)3)熱失活1ml室溫預(yù)保溫的酶溶液以0.2mg/ml的濃度在密封的Pierce小瓶(特氟隆涂封)中90.5℃或95℃下加熱。于0至6小時(shí)之間以一定時(shí)間間隔用注射器取出50μl樣品，并在冰上冷卻。然后用4NP-DP5(0.5mM)作底物測(cè)定殘留活性。
使用單指數(shù)式衰變配合程序(GRAPHPAD)測(cè)定半衰期。
圖10和11分別給出了作為90.5℃下Ca2+濃度的函數(shù)，WT和D7α淀粉酶在pH5.5和7.0時(shí)的半衰期。只測(cè)定了2D5在pH7.0和95℃下的Ca2+依賴性(圖12)。從中還可看出突變型α淀粉酶的Ca2+依賴性不同于野生型。
C.突變型α淀粉酶在不同pH值條件下的熱穩(wěn)定性已使用上述緩沖液(Ca2+濃度為1mM)，分別測(cè)定了D7和2D5在90.5℃和95℃下熱失活作用的pH依賴性?？梢钥闯?，在整個(gè)pH范圍內(nèi)D7和2D5的熱穩(wěn)定性有很大提高(其中2D5提高兩倍，見(jiàn)圖13和14)。
實(shí)施例9芽孢桿菌中突變型酶的產(chǎn)生以下述兩種方式將地衣形芽孢桿菌α淀粉酶中的突變(其業(yè)已通過(guò)大腸桿菌WK6中表達(dá)得以鑒定)轉(zhuǎn)移到芽孢桿菌表達(dá)載體中。
a)借助α淀粉酶基因內(nèi)的獨(dú)特限制性位點(diǎn)(圖4)，自pMaTLia6突變體中分離攜帶突變的片段并再克隆到pBMa6.Lia6的同源位置中。然后用SacI消化后一質(zhì)粒(其可以在大腸桿菌或芽孢桿菌中復(fù)制)并用T4DNA連接酶重新連接成環(huán)形。轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌1A40中之后，得以在SPO2啟動(dòng)子的控制下大量產(chǎn)生α淀粉酶。重新連接成環(huán)的pBMa6.Lia6被定名為pB6.Lia6，以表明除去了載體的大腸桿菌部分。
b)由大腸桿菌中再次收集pBMa6.Lia6單股DNA，并與限制酶消化的pBMc6.Lia6雙鏈DNA一起退火，得到在α淀粉酶基因上有預(yù)定缺口的雙鏈。然后用編碼所需突變的寡核苷酸(如實(shí)驗(yàn)部分所述)對(duì)該缺口進(jìn)行定點(diǎn)誘變。按前述方法將pBMc6.Lia6載體轉(zhuǎn)化到pB6.Lia6型載體中。可借助方法a)使不同的單一位點(diǎn)突變結(jié)合起來(lái)，但如果突變發(fā)生在不同的缺口上，則較好使用方法b)。
借助方法a)通過(guò)交換SacⅡ-SalⅠ片段而將突變體D7和2D5的突變轉(zhuǎn)移到pBMa6.Lia6上，并由被轉(zhuǎn)化的枯草芽孢桿菌1A40的培養(yǎng)基中回收α淀粉酶。按前述實(shí)施例給出的程序篩選兩種突變體的上清液，從而進(jìn)一步證實(shí)兩種突變體所產(chǎn)生的α淀粉酶比野生型pB6.Lia6產(chǎn)生的α淀粉酶對(duì)酸和熱的穩(wěn)定性更好。
因此可見(jiàn)，芽孢桿菌中α淀粉酶突變的表型不同于大腸桿菌中的表型。
最后將pB6.Lia6突變體轉(zhuǎn)化到地衣形芽孢桿菌T9中，該菌株是地衣形芽孢桿菌T5的蛋白酶陰性、α淀粉酶陰性衍生株(EP-0253455，CBS470.83)。已在同源系統(tǒng)中用宿主T9產(chǎn)生了高含量水平的α淀粉酶突變型。除去染色體α淀粉酶基因后，因沒(méi)有野生型α淀粉酶污染，故使該菌株很適于生產(chǎn)突變型α淀粉酶。已將由該菌株產(chǎn)生的酶用于工業(yè)應(yīng)用試驗(yàn)，并證明了突變體pB6.Lia6.2D5和pB6.Lia6.D7的工業(yè)實(shí)用性。
實(shí)施例10突變型α淀粉酶在淀粉液化條件下的應(yīng)用試驗(yàn)為了在更實(shí)際的環(huán)境下試驗(yàn)突變型α淀粉酶2D5，我們用超濾法純化了發(fā)酵液(實(shí)施例9)并將酶與50%丙二醇配在一起。
試驗(yàn)了三種樣品893701WT地衣形芽孢桿菌T5α淀粉酶1530TAU/g8937032D5按WT制備的突變體 2820TAU/gMaxamy10819 商業(yè)樣品 7090TAU/g1 TAU(熱穩(wěn)定性α淀粉酶單位)是指在與碘反應(yīng)后，在620nm處與參考顏色有相等吸光率的產(chǎn)品中，于標(biāo)準(zhǔn)化條件下每分鐘轉(zhuǎn)化1mg淀粉所需酶的量。標(biāo)準(zhǔn)條件是pH6.6、30℃、反應(yīng)時(shí)間20分鐘。參考顏色是將25g COCl2.6H2O、3.84g K2Cr2O7和1ml HCl(1M)溶于100ml蒸餾水中得到的。
1.低pH(5.5和5.25)下的液化試驗(yàn)盡可能快地使淀粉漿的溫度提高到110±0.5℃，并在該溫度下保持6分鐘。
在連續(xù)流動(dòng)(5.41/小時(shí))下實(shí)現(xiàn)液化。液化45、60和75分鐘后取3份135ml樣品(液化1.5分鐘)并于95℃下保持2小時(shí)。然后用0.4ml H2SO4(1N)酸化50ml樣品達(dá)到pH3.5，并在沸水浴中保持10分鐘，以便在進(jìn)行D.E.測(cè)定之前終止酶活性。
冷卻剩余的樣品，以測(cè)定殘留的酶活性。
淀粉漿組成3.3Kg玉米淀粉，D.S.88%(2.904Kg干淀粉)5.45升井水(40T.H.)淤漿的干物質(zhì)為33%用1N硫酸或1N NaOH將pH調(diào)到5.5。
酶濃度4.4TAU/克干淀粉。
在試驗(yàn)期間檢查流速二或三次。
2.D.E.的測(cè)定用屈光度儀檢查液化之淀粉的干物質(zhì)(約34%)。用已知的Lane Eynon方法測(cè)定D.E.值。結(jié)果如圖15所示。
3.殘留的酶活性用Brabender面粉糊粘度圖示儀測(cè)定液化淀粉中的殘留淀粉酶活性。
40g馬鈴薯淀粉390ml蒸餾水(50℃)50ml Tris緩沖液(0.05M，pH6.50)5ml CaCl2.2H2O(30g/L)當(dāng)粘度穩(wěn)定后(10分鐘)，將溫度提高到80℃(1.5°/分鐘)，加入5ml稀釋的液化淀粉(7g.用蒸餾水配到50ml)，20分鐘后測(cè)知粘度下降，這種下降與酶活力呈函數(shù)關(guān)系。用已知酶濃度劃出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以估計(jì)殘留活性的TAU數(shù)。
在pH＜5.5和110℃條件下，突變的2D5明顯優(yōu)于WT酶。用突變的2D5，在pH5.25下可提高2-3個(gè)DE單位。
實(shí)施例11
突變型α淀粉酶在織物脫漿條件下的應(yīng)用試驗(yàn)為了試驗(yàn)堿性α淀粉酶突變型的工業(yè)應(yīng)用，在下列溶液中就穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)1.4% H2O2(35%)1.0-1.5% 苛性蘇打(100%)15-20ml/L 硅酸鈉(38Be′)0.3-0.5% 烷基苯磺酸鹽(Lanaryl N.A.-ICI)0.5-1.0% 有機(jī)穩(wěn)定劑(Tinoclarite G)保溫2.5小時(shí)后，根據(jù)其所需特性選擇的α淀粉酶突變型應(yīng)具有余留的酶活性。
權(quán)利要求
1.一種突變型α淀粉酶，其為突變的編碼α淀粉酶之DNA順序的表達(dá)產(chǎn)物，特征在于該突變型α淀粉酶至少有一個(gè)氨基酸不同于野生型酶的氨基酸順序，且所說(shuō)的突變型α淀粉酶在降解淀粉和/或紡織物脫漿應(yīng)用中表現(xiàn)有改善的特性，其中改善的特性是由于氨基酸置換所致。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的α淀粉酶，特征在于其表現(xiàn)有改善的熱穩(wěn)定性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的α淀粉酶，特征在于其在pH低于6.5和/或高于7.5時(shí)表現(xiàn)有改善的穩(wěn)定性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的α淀粉酶，特征在于其表現(xiàn)有改善的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的α淀粉酶，其中由之衍生突變酶的原始基因得自于一種微生物，較好是芽孢桿菌菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的α淀粉酶，其中所說(shuō)的基因是由選自脂肪嗜熱芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌和淀粉液化芽孢桿菌之菌株的野生型基因衍生的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的α淀粉酶，特征在于該酶因?yàn)樵?11、133和149位上或任何同源α淀粉酶的相應(yīng)位置上有一個(gè)或多個(gè)位置的氨基酸置換，而不同于得自地衣形芽孢桿菌的野生型α淀粉酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的α淀粉酶，特征在于它含有一個(gè)或多個(gè)下列氨基酸置換Ala-111-Thr、His-133-Tyr、Thr-149-Ile。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)中限定的編碼α淀粉酶的突變基因。
10.包含根據(jù)權(quán)利要求9之突變基因的表達(dá)載體。
11.包含根據(jù)權(quán)利要求10之表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
12.在轉(zhuǎn)化前基本上不能產(chǎn)生細(xì)胞外淀粉水解酶的宿主細(xì)胞，特征在于其被根據(jù)權(quán)利要求10的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞為地衣形芽孢桿菌T9。
14.一種芽孢桿菌/大腸桿菌穿梭載體，其中物理上將調(diào)節(jié)順序與結(jié)構(gòu)基因分離后便不可能在大腸桿菌中表達(dá)已克隆的基因，且其中已克隆之基因在芽孢桿菌內(nèi)的表達(dá)可因用單一限制酶消化并且繼后重新連結(jié)成環(huán)形而得以恢復(fù)。
15.一種制備在淀粉降解或織物脫漿應(yīng)用中具有改善之特性的淀粉水解酶的方法，該方法包括下列步驟誘變編碼有用淀粉水解酶的克隆的基因或其片段;分離已得到的突變型淀粉酶基因;將所說(shuō)的突變型淀粉酶基因引入適于表達(dá)和生產(chǎn)的宿主菌株中;回收已產(chǎn)生的突變型淀粉酶并鑒定那些具有適用于淀粉降解或織物脫漿之改善特性的突變型淀粉酶。
16.一種生產(chǎn)突變型α淀粉酶的方法，包括在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求11-13的宿主細(xì)胞，回收所產(chǎn)生的α淀粉酶。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的α淀粉酶在淀粉降解和織物脫漿中的應(yīng)用。
18.降解淀粉的方法，其包括使用根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的突變的α淀粉酶。
19.織物脫漿的方法，其包括使用根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的突變的α淀粉酶。
20.包含根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)之突變的α淀粉酶的淀粉降解組合物。
21.包含根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)之突變的α淀粉酶的織物脫漿組合物。
全文摘要
提供了熱穩(wěn)定和酸穩(wěn)定的α淀粉酶，該酶是從微生物特別是桿菌類微生物中分離之遺傳工程化α淀粉酶基因的表達(dá)產(chǎn)物。其中對(duì)造成缺口的異源雙鏈DNA進(jìn)行的化學(xué)和酶促誘變方法可以是亞硫酸氫鹽方法和酶促錯(cuò)誤摻入法。該突變的α淀粉酶具有優(yōu)越的特性，如其可在淀粉降解和紡織物脫漿的工業(yè)應(yīng)用中，在寬pH條件下表現(xiàn)有改善了的熱穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)C12N15/56GK1050220SQ9010681
公開(kāi)日1991年3月27日 申請(qǐng)日期1990年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1989年6月29日
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