專利名稱：人工培育的偽狂犬病病毒及其疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種(非自然界存在的)偽狂犬病病毒(PRV)，它具有一個或多突變基因組。
偽狂犬病是一種除馬以外所有家畜的共患病，能引起嚴重的損傷，特別是豬和牛，豬為偽狂犬病病毒的自然宿主。PRV是一種皰疹病毒，又稱Aujesky's病毒。感染PRV的豬出現(xiàn)呼吸器官的疾病和腦炎，最終導致死亡。
PRV由鼻道感染動物，并在上呼吸道和消化道的粘膜內(nèi)開始增殖，沿神經(jīng)侵害腦。感染程度可表明為急性到亞臨床型各種癥候，主要取決于病毒的毒力和感染動物的年齡。
為了限制感染動物的死亡和生長遲緩所造成的經(jīng)濟損失，對此病需進行免疫接種。為此研制的致弱活苗和滅活死苗都是可用的，但一般來講更喜歡用致弱的活苗。因活苗容易制備，成本低廉。
最初研制的弱毒活苗存在一些缺點。一般來講，這些疫苗的研制是使毒株在培養(yǎng)細胞上進行一系列傳代(50-900代)，從而導致病毒不能控制的突變，結(jié)果這樣的疫苗組成是非同源的，這種非同源的混合物中含有未知毒力和未知保護力的變異病毒。此外，這種病毒還存在毒力恢復的危險。
基因工程技術(shù)的發(fā)展揭開了克服上述缺陷而獲得弱毒活苗的可能性。文獻描述PRV基因組的結(jié)構(gòu)(Virol.97 151-163(1979))表明PRV基因組含有大約150，000對核苷酸，對2個反轉(zhuǎn)重復和2個獨立序，一個短序列和一個長序列，分別稱之為Us和Ul。上述PRV根據(jù)DNA序列被劃分為D-皰疹病毒。
強毒PRV的NIA-3株的基因如

圖1所示顯示HindⅢ和BamHI的限制內(nèi)切部位，反轉(zhuǎn)重復被證明為IR1和IRr，此外長序列(Ul)和短序列(Us)也在圖中注明。
普通病毒學雜志(J.gen.Virol.)68卷523-534(1987)論述了PRV缺失突變的NIA-3株，其毒力大大降低，但仍能誘導足夠高的中和抗體滴度，因此，這些突變株適用于作疫苗生產(chǎn)，缺失位于BamHI片段7的MluI-BgⅢ片段內(nèi)。很清楚，這些突變引起糖蛋白gI和gp63基因編碼功能的喪失。上述的這些突變株還在HindⅢB片段末端周圍的缺失，這種伴隨的缺失僅引起輕微的毒力降低。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，經(jīng)同野毒型PRV基因組相比較，PRV突變株基因組具有蛋白激酶(PK)和/或28K基因由于基因控制而喪失功能，但PRV突變株仍具有復制能力。
此外，還發(fā)現(xiàn)PRV突變株的基因含有已喪失功能的蛋白激酶(PK)基因，這種突變株有一定毒性，但較野毒型已下降，仍具有良好的免疫原性。另外，28K基因功能的喪失沒有檢測到是否對于毒力和免疫原性有影響。
事實上，PRV的蛋白激酶基因和28K基因不影響病毒繁殖，這就能使有利的突變基因引入到這些區(qū)域內(nèi)。因此，本發(fā)明涉及的偽狂犬病毒，(非自然界中存在的)，其蛋白激酶基因區(qū)和(或)28K基因區(qū)含有突變的基因;本發(fā)明還涉及含有這樣病毒的疫苗;以及制備疫苗(防制豬感染病原)的方法。根據(jù)本發(fā)明，偽狂犬病毒被制成具有免疫特性的藥用組分。
突變是在上述區(qū)域內(nèi)遺傳信息的改變，有關(guān)的信息存在于自然出現(xiàn)的偽狂犬病毒的這些區(qū)域內(nèi)。突變包括核酸替換，缺失、插入或倒位，或它們的結(jié)合。特別是本發(fā)明涉及的PRV在上述一個或2個區(qū)域內(nèi)有缺失和/或插入。
PK基因定位于Bam HI片段10上，就是說在編碼糖蛋白gx序列的上游，編碼28K蛋白的序列位于11K基因的下游，(Bam HI7片段轉(zhuǎn)換為12片段)。
PK基因的DNA序列已被確定，如圖2所示，轉(zhuǎn)錄開始位點由水平箭頭所示，TATA基因盒序列由畫線注明，IR意為反轉(zhuǎn)重復，gx基因的起始密碼子是在1395位置上。
28K基因的DNA序列如圖3所示，轉(zhuǎn)錄的開始位置由水平箭頭所表示，TATA基因盒序列如畫線所示。Poly-A-位置如雙股線所示。反轉(zhuǎn)重復由IR表示，DR表示直接重復(26bp)。11K基因的終止密碼子在位置7上。
圖4是PRV的已知的Us區(qū)域中7個基因的位置。圖4A是喪失功能的PK基因的插入突變株HindⅢB片段的圖解，所述的PK基因?qū)⒃诤竺嬲撌觥D4B是喪失功能的28K基因的缺失突變的HindⅢB片段圖解，所述的28K基因也將在后面論述。
在圖4中，BamHI的限制性位置由B所表示，Bg 1Ⅱ用Bg表示，HindⅢ用H表示。
編碼PK和28K蛋白DNA序列的位置由下列程序所確定。
gx1170核苷酸上游的起始閱讀框架(下面用ORF表示)完全位于Us區(qū)內(nèi)(圖2)，體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的試驗已經(jīng)肯定了ORF的存在，假如在163位置上第一個ATG密碼子作為翻譯起始密碼子，就可翻譯出390個氨基酸的蛋白(43K)，然而，mRNA圖譜實驗表明在325位置上第三個ATG密碼子可能是非常重要的翻譯起點，蛋白可能為336個氨基酸長度(37K)。
早在感染后2個小時，由PRV感染的組織細胞中檢測到由這個區(qū)域的轉(zhuǎn)錄體。2.7kb mRNA的5'-末端完全由引物延長實驗所確定。發(fā)現(xiàn)2個轉(zhuǎn)錄起始位點超過95%的mRNA的起始位點在258，260或261的位置(分別為C.U或A)，因此為編碼37K產(chǎn)物。另一部分mRNA起始位點在99位置上，因此為編碼43K產(chǎn)物。
蛋白含有一個絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶的保守區(qū)段，(科學241、42-52(1988)它與皰疹病毒1型(HSV-1)Us3編碼的蛋白激酶是同源的(J.Mol.Biol 181，1-13(1985))，因此該PRV蛋白可能是在PRV感染的細胞中發(fā)現(xiàn)的38K蛋白激酶(Eur.J.Biodem 152，57-65(1985)和Eur.J.Biodcem 167，507-512(1987))。
28K蛋白11K的768核苷酸下游的ORF編碼256氨基酸的蛋白(28K)(圖3)。體外轉(zhuǎn)錄或翻譯已證明了這種ORF的存在。最低程度上28K蛋白是和HSV-1的Us2蛋白同源(J.Mol.Biol，1981，1-13(1985)。
早在培養(yǎng)細胞感染的2個小時，28K特異的mRNA就能檢測到，然后感染5個小時，轉(zhuǎn)錄水平大大增加。
借助于引物擴增實驗可以確定1.15kbmRNA的5'-末端。mRNA在146、147、148或149的位置開始，(分別為C、A、C或A)。圖3還顯示了反轉(zhuǎn)重復序列的一小部分，它含有5個26bp相同的直接重復序列(較短的一個為24bp)。
根據(jù)目前突變的發(fā)明，PRV的區(qū)域可由含有編碼PK蛋白或28K蛋白基因序列的核酸為特征和有這些基因5'和3'末端的核酸序列為特征，因此這些側(cè)邊序列不編碼多肽。因而，區(qū)域還含有一些所涉及基因的調(diào)節(jié)和表達的重要序列。
根據(jù)本發(fā)明，這樣的突變可能存在于PK基因區(qū)和/或在28K基因區(qū)，這些區(qū)域由1-1394核酸序列為特征，如圖2所示，或圖3表明的7-1725的核酸序列為特征。
更可取的是，突變存在于編碼PK蛋白和/或編碼28K蛋白的基因上，非常適合于插入的區(qū)域位于163-1332的核酸序列內(nèi)，如圖2所示，和232-999核酸序列內(nèi)，如圖3所示。
例如，更適合的突變是來源于1個或更多豬病原體基因序列的核酸插入，但不同于PRV。這些也是含有與誘導保護性免疫應答有關(guān)的遺傳信息的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明，用這樣重組病毒免疫接種動物之后，病毒能在靶細胞內(nèi)增殖，因此建立了含有外源信息的許多載體病毒。隨后，這種病毒再次感染靶細胞，又開始新的增殖循環(huán)。結(jié)果，大量外源的基因產(chǎn)物提供給宿主的免疫系統(tǒng)，這和亞單位疫苗是不同的。
盡管不同于PRV的病原體基因的插入可能存在于蛋白激酶基因區(qū)內(nèi)或存在于28K基因內(nèi)，或這2個區(qū)內(nèi)，但用于疫苗在PRV株基因插入的狀況下，28K基因更適合一些，因為編碼28K基因的核酸序列的功能喪失不影響PRV突變株的繁殖，毒力和免疫原性。
更可取的是，PRV載體的基因組含有把外源基因引入到28K基因內(nèi)或/和引入蛋白激酶基因內(nèi)，這樣實際上PRV載體就是由gI糖蛋白和/或胸腺嘧啶激酶缺失而致弱的PRV。
外源核酸序列的插入可在上述區(qū)內(nèi)任何適宜的位置內(nèi)完成，而PK基因和/或28K基因完全或部分缺失。
譬如，若考慮將外源遺傳信息插入到PRV載體的遺傳信息可選擇一些病毒，如豬霍亂病毒、細小病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬地方性腹瀉病毒和流感病毒，或細菌性病原，如多殺巴氏桿菌、支氣管敗血性博代氏桿菌、胸膜肺炎放線菌、豬鏈球菌、豬痢疾密螺旋體、大腸桿菌和鉤端螺旋體，或支原體，例如豬肺炎支原體和豬鼻支原體等。
PRV亞基因片段中病原體核酸序列的克隆技術(shù)并隨后將這些序列整合到PRV基因組中的技術(shù)一般是已知的，舉例講，由亞基因片段重組的PRV構(gòu)建方法見M.Van zijl等文獻(J.Virol 62，2191-2195(1988))。
在研究PRV蛋白激酶和28K基因的功能喪失分別對繁殖和病毒特性的影響中，應用寡聚核苷酸插入引起涉及的基因區(qū)內(nèi)突變，寡聚核苷酸具有翻譯終止信號，此外含有酶限制位點，這種限制位點不存在于NIA-3上。應用的寡聚核苷酸有下面的順序5'-TAGGCTAGAATTCTAGCCTA-3'3'-ATCCGATCTTAAGATCGGAT-5'這種寡聚核苷酸在2個方向上含有3個翻譯終止密碼子，TAG，每一個可能有3個閱讀框架，此外，它還含有EcoRI識別位點，GAATTC，另外，寡聚核苷酸是一個回文結(jié)構(gòu)，這種雙股寡聚核苷酸插入到任何編碼蛋白的基因內(nèi)，任何方向，任何閱讀框架中都能導致那個基因RNA的翻譯終止。在寡聚核苷酸EcoRI識別位點的存在(NIA-3基因組中不存在)可促進寡聚核苷酸插入位置的確定，進一步控制在此克隆中寡聚核苷酸已被插入的克隆體。
上述寡聚核苷酸可由已知的合成方式獲得，合成是借助于磷胺(fosforamidite)方法。
下面詳細論述了一些突變株的構(gòu)建和生物學特性。
1、PRV NIA-3株的HindⅢB片段克隆的構(gòu)建質(zhì)粒PBR322載體引導物是在dATP和dTTP存在下DNA多聚酶Ⅰ的klenow片段處理而使EcoRI的位置缺失的狀況下構(gòu)建。PRV的NIA-3株的27kbp HinclⅢB片段是在后者載體的HindⅢ位置上克隆。
2、在準隨機位置的線性克隆。
HindⅢ-B克隆的共價閉合環(huán)狀DNA(25μg)在37℃，15分部分消化，然后分別再選用下列任何一種酶消化FnuDⅡ，HaeⅢ和RsaⅠ。消化在下列體系中進行，125μl體積的溶液含有DNA和2u FnuD Ⅱ 20 mM Tris-HCLpH7.5，8mM Mgcl2，50μg溴化乙錠，或DNA與1單位Hac Ⅲ，20 mM Tris-HCL，pH 7.5，50mMNaCL，8 mM MgCL2，5μg/ml溴化乙錠或與0.5uRsaI孵育，在20 mM Tris-HCL，pH 7.5，50 mM NaCL，8 mM MgCL2，0.5μg/ml EtBr.
這些部分消化結(jié)果有30%完全長度的線狀DNA片段的形成，瓊脂凝膠電泳確定。因為所用的限制性酶識別位點散在整個DNA片段上。這個部分可以被認為是在克隆內(nèi)準隨機位點上線性化過程。這種線性DNA可由氯化銫密度梯度離心而純化，去除未消化的閉合環(huán)狀DNA，然后，通過制備的瓊脂糖凝膠電泳去除單股分子片段，和不止一次切斷的分子。
3、寡聚核苷酸插入到線狀HindⅢ-B克隆內(nèi)3個部分酶消化的樣品每一份取1μg的線狀DNA與蛋白激酶處理的寡聚核苷酸0.03μg連接，(摩爾數(shù)超過50倍)，體積為15μl。HindⅢ-B片段和寡聚核苷酸交聯(lián)的連接物由EcoRI消化，而形成在2個末端具有一半寡聚核苷酸的完整長度片段，這些片段由制備性瓊脂糖凝膠電泳和電洗脫而分離，然后將3個部分消化制備的3種DNA制備物合并。0.5μgDNA由一半EcoRI識別位點與線性HindⅢ-B片段的2個末端交聯(lián)成環(huán)狀，體積為400μl，從交聯(lián)的混合物的沉淀出DNA并溶于10μl 10mM Tris-Hcl，pH7.5，1mM EDTA中，用Hanahan的方法將上述DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5中，結(jié)果在一系列HindⅢ-B克隆的突變株中，每株在準隨機位點都有寡聚核苷酸的插入。
4、重組克隆的分析重組克隆的完整性由BamHI和HindⅢ限制性內(nèi)切酶的消化而檢測，然后通過瓊脂糖凝膠電泳。寡聚核苷酸在這些重組克隆中每株的插入位置由BamHI+EcokI和BgⅢ+EcokI限制酶消化，然后進行瓊脂糖電泳。
5、偽狂犬病毒突變株的構(gòu)建按照Van Zijl等(J.Virol.622191-2195，1988)介紹的方法從載體PJBF克隆出病毒亞基因片段克隆，以亞基因片段重新裝配出PRV?？寺『蠵RV NIA-3株HindⅢ-B片段的Us是按Quin等(J.Gen.Virol.68525-534，1987)的方法進行。為了獲得沒有載體序列的病毒插入片段，用ECORI消化Cosmid載體DNA，用HindⅢ消化質(zhì)粒DNA，然后采用甘油梯度離心純化病毒插入片段，從組建載體C-179，C-27和C-443或HindⅢB片段中得到的病毒插入片段被用于構(gòu)建PRVcos NIA-3野毒型。這些病毒插入片段聯(lián)合起來就代表了PRV病毒的全部遺傳信息。
為了組建突變體病毒，C-179，C-27再加上下列任何一個，即用于構(gòu)建△28K突變體的C-443或C-447(由于和HindB片段重疊，缺失一片8Kbp序列的組建載體)的組建載體用于構(gòu)建PK突變體，最后，使用HindⅢB片段。
在圖5中，將與NIA-3限制性消化譜有關(guān)的上述構(gòu)建過程都很系統(tǒng)地表明出來。垂直箭頭表示寡聚核苷酸的插入位點。
將這些片段協(xié)同轉(zhuǎn)染到PK15細胞中，在這之前，應將這些片段的重疊未端進行體內(nèi)同源重組具有感染性的病毒子此時就攜帶有一個引入的Hind Ⅲ B片段的變異片段。以這種方式得到的突變病毒應在SK6細胞上噬斑純化三次，再從感染突變病毒的SK6細胞中分離DNA，用Bam HI和BamHI+GCORI消化，這些DNA提取物和用同樣方式處理的NIA-3感染細胞的DNA用瓊脂糖電泳進行分析。
6、構(gòu)建NIA-3PK和△28K突變體用上述技術(shù)，通過對C-179、C-27、謾＊447和帶有在旦白激酶基因S'未端轉(zhuǎn)譯終止寡聚核苷序列的HindⅢ B549片段，即可得到病毒突變體Mllo(PK-)，寡核苷片酸段可以早期終止PK-mRNA的轉(zhuǎn)譯。
Sanger和Coulson(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-5467，1977)介紹的DNA序列分析方法可以確定這段寡核苷酸片段是否與病毒DNA側(cè)邊整合也可以確定在PK基因內(nèi)寡聚核苷酸插入的確切位置。
為此，Hind Ⅲ B 549克隆的DNA可用限制性酶Sau3A+ECORI消化，插入到用BamHI+ECORI消化的M13mpll載體中。這個重組質(zhì)粒的序列分析可揭示在寡聚核苷序列插入位點的兩側(cè)都沒有缺失，在圖2A上垂直箭頭所示的PK轉(zhuǎn)錄體5'未端的第457和458堿基對之間正好是寡聚核苷序列的插入位點。
在第二次試驗中，重復構(gòu)建出PRV PK-插入突變體。試驗是按上述過程進行的。這樣就得到了病毒M119突變體(PK-)。
對Hind Ⅲ-B片段的寡聚核苷插入的致突變作用也產(chǎn)生在28K基因(Hi Ⅲ-B……351和357)兩位點有插入寡聚核苷片段的兩個克隆。這些可用于獲得一個28K基因更大部分缺失的突變體。為此，Hind Ⅲ B351片段或357片段突變體用Bgl Ⅲ+EcoRI消化，兩個酶在這兩個克隆上各切一次(Bgl Ⅱ位點在gp50基因上，EcoRI在插入的寡聚核苷片段，圖4B)，導致在消化后出現(xiàn)二個DNA片段，351克隆體的4.9kbp Bgl Ⅱ-EcoRI片段產(chǎn)生一個在351-357寡聚核苷序列插入位點之間大約0.5kbp缺失的Hind Ⅲ B片段突變體，這使28K基因缺失更多(圖4b)。
用在5中所描述的方法，突變的病毒進一步消化株M113(△28K)就用351-357克隆中得到。
7、PK-和28K突變體在組織細胞上的生長在SK6細胞中，28K突變體PRV株與NIA-3株生長相同，PK-突變株比NI＊A-3生長慢。
致病性和免疫原性在試驗1和2中，插入突變體M110(PK-)和缺失突變體M113(△28K)的致病性和免疫原性在10周齡仔豬(沒有PRV抗體)體上進行的檢查。105PFU通過鼻腔內(nèi)接種。試驗組由8-9頭仔豬組成。在試驗1中檢測M110突變體，在試驗2中檢測M113突變體，在每一次試驗中都設有兩組對照群，也就是說，C群感染M209株(COSNIA-3)，A群不感染，接種后8周，所有動物都感染NIA-3株，以便測定免疫原性，18周齡的未感染A群用以對照。
M209(COSNIA-3)株是用C-179、C-27、C-443和NIA-3Hind Ⅲ-B片段的組建載體重新裝配的強毒PRV株。
在試驗了M119(PK-)致病性是以沒有PRV抗體的3周齡仔豬為試驗對象。PRV PK-(M120)的致病性也被測定。M120株是M119(PK-)的PK基因的缺失經(jīng)配對后獲得的，在SK-6細胞上，M119病毒DNA和NIA-3病毒DNA BamHI第10片段的協(xié)同轉(zhuǎn)染影響了這種補救過程。BamHI 10片段與PK基因重疊，如果插入PK基因是在試驗1中所描述的降低致病性的唯一原因，那么，PK基因的補救將一定會得到一株病毒，M120(PK+)，攜帶有對照株M209(COSNIA-3)的致病性特征。
A、B、C試驗群每群由5個沒有PRV抗體的SPF3周齡仔豬組成，分別用105PFU M118(PK-)，M120(PK+)和M209(COSNIA-3)鼻內(nèi)感染A、B和C三群仔豬。
致病性試驗1和2的結(jié)果在用M209(COSNIA-3)“免疫”后，常見的臨床癥狀象廢食或食欲極度降低，嗜睡、嘔吐，分泌鼻液，發(fā)熱，都可以觀察到有一些動物在觀察期內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，在兩組試驗中6頭動物有2頭死亡，下面表列出毒力方面的結(jié)果。
表AN.S. 死亡率MTD 增重(kg)群 第18天-第1天A 對照 - 0/6 12.5B M110(PK+) - 0/7 12.0C M209(COSNIA-3) + 2/6 8.0 4.6試驗2A 對照 - 0/6 13.8B M113(△28K) + 5/7 7.4 -4.0C M209 + 2/6 10.0 6.1神經(jīng)癥狀(運動失調(diào)、麻痹、抖顫)
在接種M110(PK-)突變體的仔豬群中，臨床癥狀仍限制在嗜睡，在有些動物缺乏食欲，體溫增高，但很明顯地低于M209感染。
M113(△28K)感染后，典型的臨床癥狀出現(xiàn)，伴有神經(jīng)癥狀，在M113群7頭有5頭死亡，第7天死亡3頭，第8天死亡2頭，其余2頭，有一頭呈慢性感染發(fā)病。M110(PK-)接種的群增重與未感染對照組A群相當，這與接種M110突變體出現(xiàn)溫和型臨床癥狀的結(jié)論相一致。
M113(△28K)感染可觀察到體重降低，M113群的體重曲線測到存活2頭仔豬體重曲線為終點，這兩頭中有1頭仍慢性發(fā)病，體重還在不斷的下降。另一只體重在感染后第9天開始增加。
M110(PK-)接種后可以觀察到所分泌的病毒數(shù)量很低。
接種后第四天，從每一群中剖殺2頭的仔豬從各種組織/器官(每頭19部位)取樣進行病毒分離，結(jié)果列在表B上。
因此，這些結(jié)果表明M110(PK-)株和父母代毒株相比，毒力明顯降低，相反，M113(△28K)和父母代毒株對10周令仔豬的毒力相同。
表B試驗1群 鼻咽區(qū) C1N1S 肺B M110(PK-) + + +C M209(cosNIA-3) + + +試驗2
B M113(△28K) + + +C M209(cosNIA-3) + + +試驗3的結(jié)果C群仔豬在3周齡血清陽性對鼻內(nèi)接種M209(cosNIA-3)，出現(xiàn)典型的特征性強毒PRV感染的癥狀，這些不僅包括一般癥狀，如發(fā)熱(平均體溫高于40℃持續(xù)6天)，食欲下降，嗜睡、嘔吐、噴吐，分泌鼻液，而且還出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，如痙攣、震顫，共濟失調(diào)、麻痹等。5頭仔豬中有4頭分別在第6、6、7和7天死亡(平均死亡時間6.5天)感染M120(PK-)B群仔豬出現(xiàn)同C群一樣的癥狀，其中5頭仔豬中有3頭分別在6、7和12天死亡(平均死亡時間8.3天)，感染M119(PK-)的A群，在接種后第3和第4天看到溫和性的一般癥狀，5頭仔豬的平均體溫高于40℃，在接種后第5天有1頭仔豬出現(xiàn)嗜睡，沒有看到食欲降低在第18天和第1天增重和對照群相同。
在感染后第一天一直到整個試驗期內(nèi)A、B、萌旱淖兄磯伎I在唾液中查到病毒。每群仔豬口咽拭子在第1和第9天之間的病毒平均數(shù)量差別不大。
免疫原性試驗1的結(jié)果用M110(PK-)和M209(cosNIA-3)接種的仔豬在接種后第8周可完全抵抗NIA-3強毒攻擊。沒觀察到生長抑制，采食減少，臨床癥狀明顯的體溫增加，對照組經(jīng)攻毒后出現(xiàn)典型的臨床癥狀，但全部都存活下來。對照組仔豬生長受阻約15天。很明顯接種M110(PK-)仔豬在攻毒后7天內(nèi)分泌病毒，血中高水平中和抗體滴度(高于1000)減少了病毒排放的時間和數(shù)量，但不能完全阻止該病毒的排放。攻毒后血清中和滴度的提高斷定病毒進行復制。
權(quán)利要求
1.一種人工培育的，并在蛋白激酶區(qū)或在28K基因區(qū)或兩個區(qū)中有一突變的基因組的偽狂犬病毒。
2.如權(quán)利要求1所述的偽狂犬病毒，其中的突變是缺失基因，外源插入或者缺失基因和外源插入。
3.如權(quán)利要求1所述的偽狂犬病毒，其中的突變存在于蛋白激酶和28K基因中，或者存在于這兩個基因中。
4.如權(quán)利要求2所述的偽狂犬病毒，其中的基因組含有一個編碼能對豬典型致病的抗原多肽的插入片段。
5.如權(quán)利要求1所述的偽狂犬病毒，它不產(chǎn)生功能性gI蛋白，功能性胸腺嘧啶激酶或兩者中的任何一種。
6.如權(quán)利要求1所述的偽狂犬病毒，它來自NIA-3毒株。
7.含有如權(quán)利要求1至6中之一所述的偽狂犬病毒，保護豬免受強毒攻擊的疫苗。
8.一種保護豬免受強毒感染的疫苗生產(chǎn)方法，其中包括按權(quán)利要求1至6之一中所述的偽狂犬病病毒制成的一種具有免疫特性的藥物組份。
全文摘要
本發(fā)明涉及人工培育的偽狂犬病毒(PRV)，它在蛋白激酶基因區(qū)和/或28K基因區(qū)含有突變的基因組。突變是指核酸替換、缺失、插入或轉(zhuǎn)換或他們的組合，用基因工程技術(shù)可將突變物引入到自然的PRV病毒，最好是NIA-3基因組中，插入核酸序列可以是對豬具有典型致病的核酸序列編碼。本發(fā)明還包括用涉及本發(fā)明的偽狂犬病病毒制備的疫苗及其制備該疫苗的方法。
文檔編號C12N15/00GK1049519SQ90106840
公開日1991年2月27日 申請日期1990年8月17日 優(yōu)先權(quán)日1989年8月17日
發(fā)明者尼爾斯·德·溫德, 瑪麗亞·馬德琳·凡·齊爾, 阿諾德·倫納德·喬澤夫·吉爾肯斯, 安托尼斯·齊澤夫·瑪麗亞·伯恩斯 申請人:技術(shù)科學基金會