專利名稱：檢測間日瘧原蟲的新方法
瘧疾是由屬于瘧原蟲屬的原生動物寄生蟲引起的。寄生蟲的生活周期為二個階段，即在脊椎動物身上的無性階段和在蚊蟲身上(通常為按蚊屬)的有性階段。造成人瘧疾病的四種瘧原蟲(Plasmodium)是惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、三日瘧原蟲(P.malariae)和卵形瘧原蟲(P.ovale)。
在這些瘧原蟲中，前兩種是最常見的。惡性瘧原蟲是造成瘧疾最嚴(yán)重的一種瘧原蟲，在某些情況下可致死。而且，這種寄生蟲還對通常使用的瘧疾藥物產(chǎn)生抗性。由間日瘧原蟲引起疾病的頻率視不同國家而不同，一般約為50-80%。三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲很少出現(xiàn)。
目前診斷瘧疾的方法是利用血樣涂片觀察。這種方法很麻煩，并需要專家評價。而且，一個熟練的顯微鏡學(xué)家一天最多只能看六十張片子。也可以通過血清學(xué)診斷，但由于抗體的持久性，無法將現(xiàn)時的感染與過去的感染區(qū)分開。新的診斷測試的研究包括了檢測寄生蟲核酸作為寄生蟲存在的指征。這種測試只需要很少量的血(5-50μl)，可從刺破手指得到，這種測試方法靈敏迅速。10μl血中有50個寄生蟲，可通過核酸雜交檢測(1)。只要有一點初級訓(xùn)練，一天就可分析幾百個樣品。這種檢測方法的靈敏性使得這種檢測可用于篩選輸血用的血庫。
為了鑒別作為載體的載體種類，也可在昆蟲組織的樣品中進(jìn)行核酸雜交。這一信息會有助于加強載體的對照測量以限制瘧疾的地理分布?；蛘?，可在這些區(qū)域采用化學(xué)預(yù)防，利用核酸雜交來完成對這一措施的評價。
雙鏈的DNA是互補的。在某些溫度和鹽濃度條件下，DNA的互補雙鏈會變性或解離并且能再生性地重新組合。這種重新組合還可能發(fā)生在DNA和互補的RNA之間。重組的DNA和RNA可用檢測裝置(同位素的或非同位素的)標(biāo)記，也可采用適當(dāng)?shù)臋z測方法。在間日瘧原蟲中，還沒有任何潛在的DNA探針順序的報道。為了確定間日瘧原蟲在地理限定區(qū)域中的影響，發(fā)展檢測間日瘧原蟲的特異性核酸順序是很重要。術(shù)語“探針用于表示一組用生物學(xué)方法或合成方法得到的DNA順序。
核酸雜交法可用于任何懷疑有寄生蟲的生物樣品。例如，血樣可直接拿來溶于堿中，并利用標(biāo)準(zhǔn)方法(2)點在硝酸纖維素或類似的固體支承物上。DNA被固定在支承物上，并在適當(dāng)?shù)臏囟取㈦x子強度等條件下與特定的探針接觸(3)，所述離子強度有利于探針和目標(biāo)核酸特異性重退火。如果探針帶有同位素標(biāo)記(通常用32P)，則利用放射自顯影檢測負(fù)樣品和正樣品。如果探針帶有非同位素標(biāo)記如生物素(4)，則采用酶體系(例如抗生物素蛋白-堿性磷酸脂酶)，經(jīng)過一聯(lián)串的反應(yīng)后，樣品中出現(xiàn)顏色的，就是測試的正反應(yīng)。
在另一項技術(shù)中(5)，可直接將待分析的血樣或組織樣品收集到離液序列高的試劑如4M硫氰酸胍中。雜交過程在溶液中進(jìn)行，然后將混合物在只促進(jìn)目標(biāo)-探針結(jié)合而過量的探針不結(jié)合到基質(zhì)上的條件下通過固體支承物過濾，放射性自顯影或比色檢測可在基質(zhì)上進(jìn)行。當(dāng)用單鏈RNA探針時，這種雜交形式特別有用。
本發(fā)明描述了間日瘧原蟲特異性DNA順序和用于間日瘧原蟲的探針的核苷酸順序的鑒定?；谶@些特性，發(fā)展了采用核酸雜交法特異性地檢測間日瘧原蟲的診斷方法。這種測試快速、靈敏并且可大規(guī)模地用于流行病檢測。
本發(fā)明涉及
1.新的構(gòu)建體或質(zhì)粒pARC117、pARC145和pARC1153，以轉(zhuǎn)化的大腸桿菌形式保藏在NationalCollectionofIndustrialBacteria，TorryResearchStation，Aberdeen(NCIB)保藏號如下pARC117NCIB40114，E.ColiRR1M15pARC117，F(xiàn)eb.15，1989pARC145NCIB40110，E.ColiRR1M15pARC145，F(xiàn)eb.7，1989pARC1153NCIB40108E.ColiRR1M15pARC1153，F(xiàn)eb.7，19892.pARC117、pARC145和pARC1153的DNA順序和其亞結(jié)構(gòu)包括至少20個必要的核苷酸。
3.一種用于檢測間日瘧原蟲的DNA探針，其核苷酸順序的構(gòu)成同后面的pARC117。
4.一種用于檢測間日瘧原蟲的DNA探針，其核苷酸順序的構(gòu)成同后面的pARC145。
5.一種用于檢測間日瘧原蟲的DNA探針，其核苷酸順序的構(gòu)成同后面的pARC1153。
6.一種檢測脊椎動物和無脊椎動物生物樣品中間日瘧原蟲的方法，該方法將含有放射性或非放射性標(biāo)記形式的與pARC117、pARC145和pARC1153核苷酸順序序相同的探針與它們各自在間日瘧原蟲基因組上的同源順序雜交，然后檢測結(jié)合到間日瘧原蟲基因組上的標(biāo)記探針。
本發(fā)明以疾病的診斷為例子，但不限于此。流行病篩選、法醫(yī)研究、測定食品污染、公共衛(wèi)生調(diào)查、預(yù)防醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)應(yīng)用，在侵染試劑診斷方面都可用本發(fā)明的方法。
特異于間日瘧原蟲的DNA順序的鑒定由于間日瘧原蟲還不能在體外培養(yǎng)，這些寄生蟲的基因組DNA得自感染病人的血液。在除去盡可能多的淡黃色外殼后，由標(biāo)準(zhǔn)方法(6)制備基因組DNA，用Sau3A酶消化，然后克隆到已知質(zhì)粒載體pUC18的BamH1位點上。特異性DNA順序的種類通過用缺口翻譯的間日瘧原蟲DNA和缺口翻譯的正常人DNA在差示篩選形式下篩選重復(fù)濾膜(dupli-catefilters)而鑒定。得到三種間日瘧原蟲的特異性探針，表示為pARC117、pARC145和pARC1153，將它們亞克隆到M13載體上，它們的DNA順序由雙脫氧鏈末端法(di-deoxychainterminationmethod)而測定(7)。它們在排好順序的區(qū)域內(nèi)都沒有任何特征性的重復(fù)單元。一種基于同源尋找的電腦，利用諸如Genbank和EMBL這類最新數(shù)據(jù)庫，揭示任何已公開的核苷酸順序都沒有明顯的同源性。用pARC117和大鼠小清蛋白(parvalbumm)得到最高的同源性(約41%)，但這一數(shù)據(jù)對實際應(yīng)用沒有多大意義。
上述用于間日瘧原蟲的探針是特異性的，這些探針不與惡性瘧原蟲的分離物交叉反應(yīng)(

圖1)。
利用特異性的間日瘧原蟲探針的檢測方法核酸雜交有兩種方法。一種方法是把核酸樣品固定在固體支承物上，而探針順序在溶液中(2)。另一種方法是核酸樣品和探針順序都在溶液中(5)。
因此，一種測試核酸雜交的方法是將血或組織樣品點在固體支承物(如硝酸纖維)上，然后在適當(dāng)?shù)臏囟鹊葪l件下與(同位素/非同位素標(biāo)記的)探針雜交(3)。這類方法在文獻(xiàn)中均已有記載，并且在瘧疾診斷中被許多研究者應(yīng)用。但是，組織樣品必須進(jìn)行寄生蟲DNA的提取，然后才能用于圓斑分析。這在設(shè)計用于大量篩選的診斷測試時是不實用的。根據(jù)發(fā)明者的經(jīng)驗，將感染的血液直接點在基質(zhì)上是不行的。血液中的紅血球膜蛋白和其它血漿組份(可能為蛋白)和其它組織在使用時會在空間上阻礙寄生蟲DNA結(jié)合到基質(zhì)上。結(jié)果，在雜交過程中，點樣樣品會脫離基質(zhì)，導(dǎo)致特異性信號消失。這個問題可通過預(yù)先洗滌樣品以除去引起測試麻煩的干擾血漿成份而克服，或通過點樣非常小量的會影響檢測靈敏度的血樣而克服。
本發(fā)明者因此采取了無需樣品處理的溶液雜交形式，比濾膜雜交形式進(jìn)行的更快。測試使用了下列步驟。
a)將組織樣品直接收集在離液序列高的鹽溶液或變性試劑中，例如，將25μl血液收集在50μl6M硫氰酸胍中。如果探針有同位素標(biāo)記，可用4M的硫氰酸胍作為離液序列高的鹽。如果探針是非同位素標(biāo)記的(如生物素)，必須用酶反應(yīng)檢測，則不能用硫氰酸胍，因為硫氰酸胍會結(jié)合到硝酸纖維素濾膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)濾膜和其它類似的基質(zhì)上，并使反應(yīng)中隨后使用的酶變性。但是，只要將基質(zhì)預(yù)處理，則硫氰酸胍可與非同位素探針一起使用。
在本發(fā)明中，當(dāng)用鹽酸胍作溶解試劑時，發(fā)現(xiàn)它與硫氰酸胍一樣有效。并且它還有另外的優(yōu)點，即它不結(jié)合到固體基質(zhì)上，因此可用于非同位素探針。
b)加入探針(lng)。所加入的探針最好是單鏈核酸，DNA或RNA，所述DNA或RNA可以從生物上得到或利用本領(lǐng)域記載的方法合成。RNA是優(yōu)選的探針。
c)樣品在85℃加熱5分鐘，然后在室溫(約28-35℃)下冷卻2小時。
d)將樣品用含有核糖核酸酶A(RNAseA)的鹽溶液稀釋至少10倍，再保溫15分鐘。當(dāng)用單鏈DNA作探針時，末雜交的探針可通過羥基磷灰石層析而除去。
e)將樣品通過基質(zhì)(如硝酸纖維或聚偏二氟乙烯濾膜)過濾，濾液在含有核糖核酸酶A的鹽溶液中沖洗兩次，每次15分鐘。
f)然后用適當(dāng)?shù)臋z測方法檢測。
制備雜交探針雜交探針可通過在適當(dāng)?shù)妮d體上克隆基因單元而制備。這些載體可以是質(zhì)粒(大腸桿菌質(zhì)粒)、絲狀噬菌體(M13)、類λ(lamboid)噬菌體。裝配型質(zhì)粒、沙門氏菌噬菌體和酵母。本領(lǐng)域記載的任何載體都可使用。
雜交探針通過利用P用DNA聚合酶和〔α-P〕dNTP進(jìn)行缺口翻譯而標(biāo)記。對非放射性標(biāo)記而言，可以用Bio-dUTP進(jìn)行缺口翻譯。短的寡核苷酸探針可以用〔γ-P〕或〔α-P〕dNTP分別在其5′或3′末端進(jìn)行末端標(biāo)記。
用P標(biāo)記的單鏈DNA探針可利用M13載體體系(9)得到。單鏈DNA探針可用生物素標(biāo)記，方法是在Bio-dUTP、其它脫氧核糖核酸和TaqDNA聚合酶的存在下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(10)。
在利用RNA雜交反應(yīng)的雜交測定中，須制備互補于DNA的標(biāo)記RNA。構(gòu)建這類體系的方法在本領(lǐng)域的文獻(xiàn)中已有記載(11)。本發(fā)明也包括這類測定。因此，本發(fā)明包括用雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA作探針檢測間日瘧原蟲基因組的應(yīng)用。
實例1本實例說明了獲得間日瘧原蟲特異性探針的方法。
1.從間日瘧原蟲感染的血液中分離總DNA，用Sau3A酶消化，并克隆于質(zhì)粒載體pUC18的BamH1位點上。
2.將克隆拷貝到兩張硝酸纖維素濾膜上。一張濾膜用缺口翻譯的放射性人DNA篩選，另一張濾膜用缺口翻譯的放射性間日瘧原蟲DNA篩選。
3.將雜交的拷貝進(jìn)行放射自顯影響以產(chǎn)生雜交信號。
4.與間日瘧原蟲DNA反應(yīng)而不與人DNA反應(yīng)的克隆認(rèn)為是特異性克隆種，選作間日瘧原蟲的雜交探針。
5.用這種方法鑒定出三種克隆，這三種克隆分別表示為pARC117、pARC145和pARC1153。每個克隆的核酸順序用標(biāo)準(zhǔn)方法測定，結(jié)果如下。
pARC117的核苷酸順序
5'-------AT GTA AGA GCA CATGAG ATT TTA TAA GGA TTT CAT TTTACT CAG GGT GAA ATG AAG AAG CACTAA AAG ATT TTG AGT AGA GTT TCAT-----3'pARC145的核苷酸順序5'-----CC AAG TGA AGA AAGGTG GAA GGG CCA GCA GGA GAG CTGGTC ACT GCA TTG TCT CTC TGA GGTCTG TAG GCC AGA AGC TCC CCA GGACTT AGA CCC TAC TAA ATG GGG TAGAGA GTA AGG GGC AGC CAT CAC TTATCA CTG GCT GTC CTG AGG GTT TGGTGT ACA GCA TGG CTT GTG GTC AGAGGC CTG TCA GCT GGG CTC CAA GAGTCC TAG TGA ATG TAA ACA GTG CAGACC TTT TCT GGG GGG AAG G-----3'
pARC1153的核苷酸順序5'------TTT GTG TGA TTT TTG TGA TTT TTG ATGGAA ACC TGA ATA TTT GGG GTA ATT ATG TGA TTA GACTCA GGA TTT TAT TTA AAT CTT CTG TTT TAG CTA GCCTCC TCT GAC ACT AGC TTG GCA GGA ACG AGG GCA GGAGAG CAT TGC TGA TGC ATT CCT GCC TCT TTT CTT CCTTGT TAC TCC CAA GTG GGT GTA AAA ATC CAG GTT TCCCAC TGT TTC CTC CTT TAA ATT AAT TAA TTA ATT TTTAAT GTT GGC AAA TAA AAA TTA TAT ATT GTG TAT ATTTAT GGG GTA CAA CAT GAT ATT TTG ATA TAT GTA TACATT GCA GAA TGG CTA AAT TAA GCT AAT TAA CAT ACATAT TAC CTC ACA TAA TCA ATT TTT TTG TGG TGA GAGCAC CTG CAA TCT ACT CTT TTA GCA ATT TTC AAG TATATA AAA CAT TGT TAT TAA CTA TGG TCA CCT CAT TGTACA ATA TGT TTT TTG AAC TTA TTC CTC CTA AGT ATAATT TTG TAC TCT TTG ACC AAC ATC TCC CCA GAC CCCTCA ATG CCC ACC CTC TGG TAA CCA ACA TTC TAC TCTTTG CTT TTC AAC TTT TAT AGA TTC CAT ATG AAG TAGGAT CAT GCT GTA TTT GTC TTT GTG CCT GGC TTA TTTCCT TTA CAT ACT GTT CTC TAG GTG ------3'
實例2這個實例說明特異性雜交探針的制備。
雜交探針的制備方法是在大腸桿菌DNA聚合酶或T4 DNA聚合酶及〔α-32P〕dNRTs的存在下通過缺口翻譯標(biāo)記插入在pARC117、pARC145和pARC1153中的DNA，產(chǎn)生比活為107cpm～5×107cpmμg的DNA。單鏈或合成得到的DNA可利用聚核苷酸激酶和〔α-32P〕ATP在5′端進(jìn)行末端標(biāo)記。也可利用末端轉(zhuǎn)多酶和〔α-32P〕dNTPs在3′端標(biāo)記。生物素化的單鏈DNA可通過利用Taq DNA聚合酶和Bio-dUTP進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)而合成。
單鏈或雙鏈的核酸可利用可光活化的生物素而生物素化。也可進(jìn)行核酸的化學(xué)生物素化作用。
單鏈RNA可通過將目標(biāo)DNA融合到在適當(dāng)載體中的沙門氏菌噬菌體SP6啟動子的片段上而產(chǎn)生。載體可在大腸桿菌中繁殖。該載體的DAN可利用SP6 RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄。在這個加工期間，可利用〔α-32P〕UTP獲得高比活的放射性RNA。該RNA的生物素化作用也是可能的。
實例3本實例說明實例1所描述的三種間日瘧原蟲克隆(pARC117、pARC145和pARC1153)的特異性。
制備間日瘧原蟲9種不同分離物的基因組DNA，點在硝酸纖維素濾膜上。分別用幾種有放射性的間日瘧原蟲特異性探針探測濾膜，探針只與間日瘧原種樣品反應(yīng)，而不與惡性瘧原蟲及人DNA反應(yīng)(圖1)。
圖1顯示了間日瘧原蟲三種探針pARC117(A)、pARC145(B)和pARC1153(C)的特異性。以從這三種克隆中分離出的雙鏈插入片段作為測試探針。Pv1到Pv9代表從9種間日瘧原蟲感染血樣中制備的DNA。FCK2和T9代表惡性瘧接蟲DNA。NH代表正常人DNA。
實例4
本實例說明利用溶液雜交方式測定間日瘧原蟲。
將感染的血液(20μl)或組織直接放入50μl含有1ng經(jīng)標(biāo)記的pARC117RNA探針(如實例2描述)的硫氰酸胍溶液中。
樣品在85℃加熱5分鐘，然后在室溫下放置2小時。
將樣品在含有10ngRNAseA的2XSSC中稀釋10倍，再在室溫下保溫15分鐘。
將樣品通過硝酸纖維素或PVDF濾膜基質(zhì)過濾，濾膜在含有RNAseA的緩沖液2XSSC中沖洗兩次，每次15分鐘。
將濾膜干燥，對膜進(jìn)行放射性自顯影以顯示雜交信號。
所描述的測定很容易進(jìn)行，只需要很少的實驗裝置，例如在大量調(diào)查期間周圍環(huán)境條件上所存在的那些實驗設(shè)備。
實例5本實例說明用鹽酸胍代替實例4描述的硫氰酸胍的溶液雜交方法。
4M硫酸氰胍作為離液序列高的試劑與由蛋白結(jié)合物檢測的非放射性探針不相容。離液序列高的鹽會結(jié)合到硝酸纖維和PVDF濾膜上，并使得用于顯色反應(yīng)的蛋白結(jié)合物變性。
鹽酸胍用作溶解試劑時，和硫氰酸胍一樣有效。由于鹽酸胍不會結(jié)合到基質(zhì)(硝酸纖維或PVDF濾膜)上，它使得由蛋白結(jié)合物檢測的非放射性探針可以使用。
硫氰酸胍只有在濾膜預(yù)處理過(如在硫氰酸胍溶液通過以前用3%BSA預(yù)處理)的條件下，才可以與非放射性探針結(jié)合使用。
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權(quán)利要求
1.構(gòu)建體pARC117，保藏號NCIB40114。
2.構(gòu)建體pARC145，保藏號NCIB40110。
3.構(gòu)建體pARC1153，保藏號NCIB40108。
4.一種具有以下順序的DNA片段5'-------AT GTA AGA GCA CATGAG ATT TTA TAA GGA TTT CAT TTTACT CAG GGT GAA ATG AAG AAG CACTAA AAG ATT TTG AGT AGA GTT TCAT-----3'
5.一種具有以下順序的DNA片段5'-----CC AAG TGA AGA AAGGTG GAA GGG CCA GCA GGA GAG CTGGTC ACT GCA TTG TCT CTC TGA GGTCTG TAG GCC AGA AGC TCC CCA GGACTT AGA CCC TAC TAA ATG GGG TAGAGA GTA AGG GGC AGC CAT CAC TTATCA CTG GCT GTC CTG AGG GTT TGGTGT ACA GCA TGG CTT GTG GTC AGAGGC CTG TCA GCT GGG CTC CAA GAGTCC TAG TGA ATG TAA ACA GTG CAGACC TTT TCT GGG GGG AAG G-----3'
6.一種具有以下順序的DNA片段5'------TTT GTG TGA TTT TTG TGA TTT TTG ATGGAA ACC TGA ATA TTT GGG GTA ATT ATG TGA TTA GACTCA GGA TTT TAT TTA AAT CTT CTG TTT TAG CTA GCCTCC TCT GAC ACT AGC TTG GCA GGA ACG AGG GCA GGAGAG CAT TGC TGA TGC ATT CCT GCC TCT TTT CTT CCTTGT TAC TCC CAA GTG GGT GTA AAA ATC CAG GTT TCCCAC TGT TTC CTC CTT TAA ATT AAT TAA TTA ATT TTTAAT GTT GGC AAA TAA AAA TTA TAT ATT GTG TAT ATTTAT GGG GTA CAA CAT GAT ATT TTG ATA TAT GTA TACATT GCA GAA TGG CTA AAT TAA GCT AAT TAA CAT ACATAT TAC CTC ACA TAA TCA ATT TTT TTG TGG TGA GAGCAC CTG CAA TCT ACT CTT TTA GCA ATT TTC AAG TATATA AAA CAT TGT TAT TAA CTA TGG TCA CCT CAT TGTACA ATA TGT TTT TTG AAC TTA TTC CTC CTA AGT ATAATT TTG TAC TCT TTG ACC AAC ATC TCC CCA GAC CCCTCA ATG CCC ACC CTC TGG TAA CCA ACA TTC TAC TCTTTG CTT TTC AAC TTT TAT AGA TTC CAT ATG AAG TAGGAT CAT GCT GTA TTT GTC TTT GTG CCT GGC TTA TTTCCT TTA CAT ACT GTT CTC TAG GTG ------3'
7.一種含有權(quán)利要求4、5和6所定義的核苷酸順序或其相似片段的雜交探針，它能與間日瘧原蟲基因組特異性地雜交。
8.一種在適當(dāng)載體上的權(quán)利要求7的雜交探針。
9.一種權(quán)利要求8的雜交探針，其中所述載體選自大腸桿菌質(zhì)粒、絲狀噬菌體(M13)、類λ噬菌體、裝配型質(zhì)粒、沙門氏噬菌體和酵母。
10.權(quán)利要求9的雜交探針，其中所述載體是大腸桿菌質(zhì)粒。
11.權(quán)利要求10的雜交探針，其中所述大腸桿菌質(zhì)粒是pUC18或pUC19。
12.權(quán)利要求9-11的雜交探針，其中所述載體含有沙門氏菌SP6噬菌體啟動子或T7噬菌體啟動子。
13.權(quán)利要求7-12的雜交探針，其中的探針用P、I、發(fā)色團(tuán)或信息基團(tuán)標(biāo)記。
14.權(quán)利要求13的雜交探針，其中所述信息基團(tuán)為生物素。
15.一種檢測脊椎動物和無脊椎動物生物樣品中間日瘧原蟲的方法，該方法是將權(quán)利要求7-14的探針與間日瘧原蟲基因組中各自的同源順序雜交，然后檢測結(jié)合到間日瘧原蟲基因組上的探針。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述雜交探針包含一個含有所述DNA順序，互補DNA(單鏈)或RNA的載體。
全文摘要
公開了特異于間日瘧原蟲的探針的DNA順序及獲得這些探針的方法。通過核酸雜交測定證明這些核酸順序在檢測由間日瘧原蟲引起的人瘧疾病方面是很有用的。這些測定的高靈敏度及操作方便，使得它們可用來對脊椎動物和無脊椎動物的血樣和其它組織進(jìn)行分析。
文檔編號C12N15/09GK1054618SQ90109920
公開日1991年9月18日 申請日期1990年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1989年12月5日
發(fā)明者K·阿揚納芬, P·巴特, S·達(dá)塔, V·S·N·K·弗朗西斯, G·帕德馬納班, H·斯里尼瓦沙 申請人:阿斯特拉公司